Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen MATK ITS ở cây ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC

VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU

(Aconitum carmichaelii Debx.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC

VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU

(Aconitum carmichaelii Debx.)

Ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Loan

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, em

đã được tạo điều kiện và nhận được sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, cơ quan, bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Lan, người hướng dẫn khoa học đã tận tâm chỉ bảo hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới Quý thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, Hội đồng Khoa học của trường và Quý thầy, cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ

em trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Phổ thông Dân tộc nội trú tỉnh Quảng Ninh đã tạo điều kiện giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình học tập

Và cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi

Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong luận văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để luận văn thêm hoàn thiện

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Loan

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Ô đầu 3

1.1.1 Phân loại cây Ô đầu 3

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam 3

1.1.3 Vai trò của cây Ô đầu 4

1.2 Phương pháp phân loại học phân tử 5

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch DNA 5

1.2.2 Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA 6

1.3 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử 7

1.3.1 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới 7

1.3.2 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam 8

1.4 Sơ lược về gen matK và ITS 10

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 13

2.1.1 Vật liệu 13

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 13

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 13

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá 14

2.2.3 Phương pháp phân tử 15

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu 18

3.1.1 Đặc điểm hình thái 18

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu 20

3.2 Kết quả phân lập đoạn gen matK và trình tự ITS 27

3.2.1 Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch matK 27

3.2.2 Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch ITS 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Đề nghị 34

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BOLD : The Barcode of Life Data System

BLAST : The Basic Local Alignment Search Tool

CIA : Chloroform : Isoamyl Alcohol Solution

CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA : Deoxyribonucleic acid

DNA barcoding : Mã vạch DNA

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

Genbank : Ngân hàng gen

ITS : Internal Transcribed Spacer

NCBI : The National Center for Biotechnology

Information PCR : Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của cặp mồi ITS-F/ITS-R và cặp mồi

matK-F/matK-R 16

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 16

Bảng 3.1 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự gen matK 30

Bảng 3.2 Bảng hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng ITS2 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc gen matK 10

Hình 1.2 Cấu trúc vùng gen ITS 11

Hình 3.1 Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx) 18

Hình 3.2 Cơ quan sinh sản của cây Ô đầu 19

Hình 3.3 Lớp biểu bì dưới của lá cây Ô đầu 21

Hình 3.4 Lớp biểu bì trên của lá cây Ô đầu 22

Hình 3.5 Cấu tạo sơ cấp cuống lá 22

Hình 3.6 Cấu tạo rễ cây Ô đầu 23

Hình 3.7 Cấu tạo sơ cấp thân cây Ô đầu 25

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen matK của mẫu cây Ô đầu 27

Hình 3.9 Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn gen matK phân lập từ mẫu Ô đầu 28

Hình 3.10 Trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Ô đầu Hà Giang và của cây Ô đầu mang mã số KY407560 trên GenBanK 29

Hình 3.11 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu thuộc chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK 30

Hình 3.12 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản vùng ITS từ hệ gen cây Ô đầu 31

Hình 3.13 Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn DNA phân lập từ mẫu Ô đầu Quản Bạ, Hà Giang 32

Hình 3.14 Trình tự nucleotide vùng ITS của mẫu Ô đầu Quản Bạ, Hà Giang và của cây Ô đầu mang mã số KU041716 trên GenBanK 32

Hình 3.15 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu trong chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS 33

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu Trong đó, nhiều cây có giá trị làm thuốc nhưng cũng có độc tính, được xếp trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc như Thầu dầu, Cà độc dược, Ô đầu Vì vậy, khi sử dụng những loại dược liệu này làm thuốc cần phải đặc biệt chú ý đến cách sử dụng, liều dùng, đối tượng dùng và phải được chế biến theo quy trình nghiêm ngặt, đúng kỹ thuật để đảm bảo an toàn cho người sử dụng

Ô đầu, Phụ tử chứa những thành phần có độc tính cao nhưng vẫn được cho là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong y dược học cổ truyền Ô đầu là củ mẹ và Phụ tử là củ con của một số loài thực vật thuộc chi

Aconitum Hiện nay, chi Aconitum được nghiên cứu nhằm phát triển các sản

phẩm theo hướng hiện đại, cũng như nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi này trong phòng và điều trị bệnh Do đó, việc nghiên cứu đặc điểm thực vật học sẽ giúp tiêu chuẩn hóa dược liệu, minh chứng cho cách sử dụng Ô đầu và Phụ tử, đồng thời góp phần phát triển các dạng thuốc mới sử dụng trong điều trị

và chăm sóc sức khỏe

Theo phương pháp truyền thống, việc giám định loài thực vật và động vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái Phương pháp phân loại này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như: nhiều loài có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều loài có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt

được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài

Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các

kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã giúp cho việc xác định nhanh chóng

được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các

cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó có thể định danh được loài và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ Vì vậy, các

kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật Trong đó, mã vạch DNA được xem như

là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài

Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là rất cần thiết và có ý nghĩa trong việc giám định, bảo tồn và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật Hiện nay, ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã bắt đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật, góp phần phân loại, bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS từ cây Ô đầu làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) tại Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu

- Nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen matK/ITS từ cây Ô đầu ở

Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Ô đầu

1.1.1 Phân loại cây Ô đầu

Aconitum carmichaelii Debx có tên thường gọi là cây Ô đầu Ngoài ra,

Ô đầu còn được gọi bằng các tên khác là Củ gấu tàu, Ấu tàu, Thảo ô, Xuyên ô Theo thống kê trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc, cây Ô đầu ở Việt Nam

bao gồm có hai loài là: Aconitum fortunei Hemsl và Aconitum carmichaelii

Debx [16], [25] Cây Ô đầu là một loại thực vật thân cỏ, có độ cao chừng khoảng 0,6 – 1m, thân mọc thẳng đứng Lá có hình mắt chim, xẻ 3 thùy, mép lá hình răng cưa Hoa có màu xanh tím và thành từng chùm Quả chia thành 5 đại

và hạt có vẩy ở trên mặt [12]

Về phân loại, cây Ô đầu thuộc chi Ô đầu (Aconitum), họ Mao lương

(Ranunculaceae), bộ Mao lương (Ranunculales), phân lớp Mao lương (Ranunculidae), lớp Mộc lan (Magnoliopsida), ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [12]

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng hiện nay có nguồn gốc từ Trung Quốc

di thực vào Việt Nam vào những năm 70 của thế kỷ trước Gần đây diện tích cây

Ô đầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại cây trồng rừng và cây đặc sản ở vùng núi phía Bắc, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho ngành y học nói riêng và nền kinh

tế nói chung Cây Ô đầu mọc trên cạn và là cây thích nghi tốt với điều kiện khí hậu lạnh, mát Vì vậy, hiện nay cây Ô đầu được trồng nhiều ở những vùng núi cao thuộc các tỉnh như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [17]

Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã được xác định bởi 2 tên là: A fortunei Hemsl và A carmichaelii Debx Theo một số nghiên cứu, tên khoa học của cây

Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là Aconitum carmichaelii Debx Việc xác định

tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở các địa phương khác cũng chưa được thực

hiện Do đó, cần có nghiên cứu định danh tên khoa học chính xác của cây Ô đầu [3], [5]

1.1.3 Vai trò của cây Ô đầu

Trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alcaloid,

polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính Trong các bộ phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin Aconitin là một loại alkaloid chính có trong củ Ô đầu Ngoài ra, trong củ Ô đầu còn có tinh bột, đường, manit, chất nhựa, các acid hữu cơ chất béo và sterol Ở thân, lá và hoa cây Ô

đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [30]

Cây Ô đầu là loại dược liệu có tính độc cao [12], [21], [33] Cây Ô đầu chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất là ở củ [34] Trong dược thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ nhỏ

Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu Phụ tử có độc tính kém hơn Ô đầu Ô đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên tim mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14], [29]

Theo y học dân tộc, Ô đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng trợ dương bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp Trong đông y, Ô đầu được dùng để chữa các chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại Thường chỉ dùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc Tây y dùng làm thuốc ho và chữa chứng ra mồ hôi nhiều [35], [36]

Hiện nay, trên thị trường đã có một số sản phẩm làm từ cây Ô đầu như: Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty Cổ phần Traphaco dùng để trị đau nhức xương khớp [39] Các sản phẩm khác có chiết xuất từ các loài cây

thuộc chi Aconitum với tác dụng tăng cường miễn dịch, chống viêm, giảm đau,

tim mạch như: Aconite 30C, Boiron, Hylands [37]

Hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về cây Ô đầu Trong đó, Phùng Hoà Bình và cộng sự (2003) [3] quan tâm nghiên cứu về tác dụng sinh học và phương pháp chế biến Ô đầu, phụ tử nhằm tìm ra các biện pháp sử dụng

Ô đầu một cách an toàn và hiệu quả Vũ Đức Lợi và cộng sự quan tâm nghiên cứu xác định thành phần hóa học của cây Ô đầu, đặc biệt là các alkaloid với nhiều tác dụng như giảm đau, chống oxy hóa, chống viêm … [10], [11]

1.2 Phương pháp phân loại học phân tử

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch DNA

Hiện nay, để phân loại và xác định loài thực vật người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau Nhưng các phương pháp đều có chung nguyên tắc là dựa vào các thông tin như: có chung một nguồn gốc, có nhiều tính chất giống nhau về các đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh

lý, sinh hoá…

Việc phân loại và xác định loài đối với thực vật dựa trên các đặc điểm về hình thái thông qua nhận biết cơ quan, bộ phận của cây như lá, hoa, quả hoặc chu kỳ sống, cách thức phân cành, … Với phương pháp truyền thống này có ưu điểm là dễ quan sát trực tiếp bằng mắt thường nhưng chỉ dựa vào sựu thống kê phân tích một hoặc một số tính trạng được thể hiện ra bên ngoài thì hiệu quả không cao Hơn nữa, khi sử dụng phương pháp này sẽ gặp nhiều khó khăn khi các mẫu cần giám định không còn nguyên vẹn đặc điểm hình thái bên ngoài Bởi vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại sẽ hỗ trợ việc định danh loài chính xác hơn, đặc biệt trong trường hợp mẫu thực vật đã bị tác động thay đổi hình thái (các bộ phận của cây đã bị cắt thái, sấy khô…)

Hiện nay, trên thế giới phương pháp phân loại học phân tử để xác định loài là hướng nghiên cứu đang phát triển mạnh, được xây dựng dựa trên việc nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu ở sinh vật Trong đó, kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp đạt hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài [32]

Năm 2003, Hebert P.D., nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đã đề xuất mã vạch DNA (DNA Barcode, chỉ thị DNA) giống như một cách để xác định loài Mã vạch DNA được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện được các loài [20]

Một mã vạch DNA điển hình đảm bảo được các yêu cầu:

(1) Hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu

(2) Có tính phổ biến

(3) Có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời

Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác [20], [28]

Mã vạch DNA là một đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã được xác định nằm trong Ngân hàng gen, nó được sử dụng để định danh các loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự DNA của Ngân hàng gen (Genbank) [15], [19]

1.2.2 Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA

Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu Hệ thực vật rất đa dạng, gồm thực vật có hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ và các loài có quan hệ gần với dương xỉ Tổng số các loài khác nhau rất nhiều, một tính toán gần đây thấy rằng hiện nay có khoảng 380.000 loài thực vật sống trên cạn, có khoảng 352.000 loài thực vật hạt kín, 1.300 loài thực vật hạt trần và 13.000 loài rêu với dương xỉ [2] Như vậy, với một số lượng loài rất lớn thì việc phân loại và định danh sẽ rất khó khăn

Hệ gen lục lạp ở thực vật bao gồm như: matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S có

nhiều đặc điểm thích hợp với chỉ thị DNA và hệ gen nhân vùng DNA như: 18S,

5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử

dụng làm chỉ thị DNA trong nhiều nghiên cứu [1], [8], [13], [24] Trong đó,

gen matK, ITS là gen có giá trị lớn trong nghiên cứu hệ thống và tiến hoá thực

vật ở các độ tiến hóa khác nhau [7], [18], [26], [31], [38]

Hiện nay, có rất nhiều vùng gen được đề xuất làm chỉ thị cho mã vạch DNA ở thực vật Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [28] Vì vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ sử dụng không chỉ một mà kết hợp nhiều vùng mã vạch DNA cho việc định danh loài đối với thực vật [22]

Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do đó, mã vạch DNA lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR [20]

1.3 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử

1.3.1 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới

Hiện nay trên thế giới đã ứng dụng nhiều phương pháp hiện đại như phương pháp phân tích DNA trong việc phân loại và giám định mẫu vật Phân tích DNA cụ thể là kỹ thuật mã vạch DNA đã xác định chính xác tên loài và đánh giá có hiệu quả trong việc giám định loài [28], [32]

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA ở thực vật để xác định một mã vạch DNA tiêu chuẩn đối với thực vật Dựa trên các kết quả nghiên cứu giám định loài thực vật mà đã thực hiện trên nhiều mẫu thực vật khác nhau, có các đại diện cho thực vật hạt kín, thực vật hạt trần, các vùng gen

được lựa chọn như: gen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoB, gen rpoC1, psbK-psbI và gen trnH-psbA Dựa trên những đánh giá có khả năng thu được,

chất lượng và mức độ phân biệt giữa các loài, nhiều nghiên cứu đã đưa ra kết

luận gen có mức độ phân biệt loài cao đó là gen rbcL và matK [23]

Hiện nay, việc điều trị các bệnh khác nhau thì thuốc thảo dược được sử dụng rộng rãi ngày càng nhiều, ngành công nghiệp dược liệu cũng phát triển Với nhiều lý do mà hiện nay các loại dược liệu có thể bị pha trộn làm giảm đi hiệu quả của thuốc Dược liệu bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính nên một số trường hợp có thể thể gây nguy hiểm đến tính mạng Các loại thuốc thảo dược được sử dụng ngày càng tăng vì vậy xác định chính xác nguồn gốc của các loại dược liệu là điều cần thiết Li M và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA [24] He J và cộng sự (2010) cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số

mẫu cây dược liệu trong chi Aconitum [19] DNA là một đại phân tử ổn định và

được tìm thấy trong tất cả các mô Do đó, sự phát triển của các dấu hiệu nhận biết dựa trên DNA là rất quan trọng để xác định cây thuốc [27]

1.3.2 Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc phân loại học phân tử các loài sinh vật nói chung và thực vật nói riêng đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [1], [8], [15] Khi nghiên cứu tính đa dạng sinh học cây họ Gừng

ở vùng Núi Cấm hướng đến ứng dụng trong việc điều chế các thuốc chữa bệnh, các nhà nghiên cứu thu thập hơn 20 mẫu cây họ Gừng có tên bắt đầu bằng chữ "ngải" tại vùng Núi Cấm, An Giang Các mẫu có đặc điểm là hình

thái của chúng tương đối giống nhau Vì vậy, trình tự ITS và matK đã được sử

dụng để định danh các mẫu này chính xác hơn [7]

Vũ Đình Duy (2013) tiến hành nghiên cứu mối quan hệ di truyền của

một số loài Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự

nucleotide vùng gen rbcL (Rubilose-1,5 Bisphophate Carboxylase) Tổng số

18 mẫu lá hoặc vỏ cây từ 17 loài thuộc 5 họ của bộ cây lá kim sử dụng trong

nghiên cứu này được thu thập vào năm 2009 Nghiên cứu vùng gen rbcL

khoảng 861bp đã được xác định cho 17 loài thông nghiên cứu Trong đó có

180 vị trí biến đổi, giá trị mang thông tin tiến hóa chiếm 148 vị trí Số cặp nucleotide tương đồng trung bình 681 Số cặp tương đồng cao nhất là 285 xuất hiện ở vị trí codon thứ 1 và thấp nhất là 237 ở vị trí codon thứ 2 Từ đó

đã xây dựng được cây tiến hóa cho thấy các loài nghiên cứu tách thành 3 nhánh: Nhánh thứ nhất gồm các loài thuộc họ Kim giao (Podocarpaceae), nhánh thứ hai gồm các loài thuộc họ Thông (Pinaceae), nhánh thứ ba gồm các loài của 3 họ Thông đỏ (Taxaceae), họ Hoàng đàn (Cupressaceae) và họ Bụt mọc (Taxodiaceae) Ba cặp loài có quan hệ rất gần nhau gồm: Thông đỏ bắc

(Taxus chinensis) và Thông đỏ nam (T wallichiana), Bách xanh núi đá (Calocedrus macrolepis) và bách xanh núi đất (Ca rupestris) và 2 mẫu Hoàng đàn tía (Cupressus tonkinensis) và Hoàng đàn rủ (C tonkinensis) Với

kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã nhập loài thông đỏ nam và loài thông đỏ bắc

vào cùng tên T chinensis, loài Bách xanh núi đất và loài Bách xanh núi đá vào chung một tên là Bách xanh (C macrolepis), Hoàng đàn tía và loài Hoàng đàn rủ được xác định vào cùng một loài C Tonkinensis [6]

Để góp phần xác định mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi

Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự DNA của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK Kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK

kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình

tự và cây phát sinh chủng loại được xây dựng Kết quả phân tích trình tự DNA

và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [13], [40]

Bùi Thanh Tùng và cộng sự (2017) đã sử dụng phương pháp giải trình tự DNA để xác định tên khoa học của cây Ô đầu của Việt Nam Kết quả đã giải

được trình tự gen của cây Ô đầu và khi so sánh với trình tự gen của loài A carmichaelii Debx thấy có sự tương đồng đến 99% Đây là căn cứ khoa học để xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: A carmichaelii

Debx họ Ranunculaceae [17]

Như vậy, việc sử dụng mã vạch DNA trong phân loại học đã và đang được ứng dụng rộng rãi Phương pháp này còn góp phần rút ngắn thời gian trong phân loại và định danh loài mới của sinh vật Hiện nay, mã vạch DNA còn giúp các loài có cùng nguồn gốc bằng phân tích sự đa hình di truyền

1.4 Sơ lược về gen matK và ITS

Gen maturase K (MatK) là gen mã hóa enzyme maturase, một protein kết nối các intron Gen matK là một trong số các gen trong lục lạp có mặt ở hầu hết thực vật Hiện nay, matK cũng đang được xem là một gen có những đóng góp

lớn cho việc phát triển hệ thống phân loại phân tử và cho tiến hóa Vì vậy,

gen matK được coi như một chỉ thị phân tử để giám định loài cũng như nghiên

cứu mối quan hệ giữa các loài thực vật

trnK ex1

trnK intron

Hình 1.1 Cấu trúc gen matK

Về kích thước, chiều dài của gen matK của lục lạp khoảng 1500 bp, nằm trong intron của gen trnK (Hình 1.1) Trong thực tế, hai exon của gen trnK bên cạnh gen matK đã bị mất, để lại gen matK còn nguyên bản để tham gia vào quá trình gắn nối các đoạn intron Gen matK có kích thước lý tưởng, tỷ lệ thay thế

cao, tỷ lệ thay đổi lớn ở mức axit nucleic tại vị trí codon thứ nhất và thứ hai, tỷ

lệ chuyển tiếp/chuyển đổi thấp và có sự hiện diện của các vùng được bảo tồn

Những đặc điểm này của gen matK đã tạo ra nhưng ưu thế lớn để xác định các

mối quan hệ cấp độ loài và họ [20], [28], [32]

Khác với gen lục lạp matK, trình tự internal transcribed spacer (ITS) nằm trong nhân tế bào ITS cũng được sử dụng rộng rãi như một công cụ hiệu

quả để nhận dạng loài và xác định quan hệ di truyền giữa các loài thực vật

Vùng ITS ở thực vật được hiểu là đơn vị chứa gen mã hóa 18S; 5,8S; 28S và hai đoạn đệm sao chép nội bộ ITS1 và ITS 2 có mặt ở hai bên của vùng 5,8S (Hình 1.2) Vùng này có thể dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR với các mồi đặc hiệu Về cấu trúc, vùng ITS gồm các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2

sắp xếp xen kẽ giữa với những trình tự mã hóa ribosome Vùng mã hóa được bảo tồn cao hơn vùng không mã hóa [28], [31], [32]

Hình 1.2 Cấu trúc vùng gen ITS

Hiện nay, ITS được coi là một trong những chỉ thị phân tử để xác định

phát sinh loài hữu ích nhất cho cả thực vật và động vật, bởi vì tính chất phổ

biến của ITS, sự thừa kế lưỡng cực và những thay đổi tiến hóa tương đối cao hơn do các ràng buộc chức năng ít hơn Một ưu điểm nữa là vùng ITS1 và ITS2

có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR một cách riêng biệt với các mồi đặ

hiệu cho từng vùng Điều này tạo điều kiện dễ dàng khuếch đại ITS từ mẫu

DNA có chất lượng kém hoặc bị suy thoái Ngoài ra các mồi khác có thể

khuếch đại cả hai vùng ITS1 và ITS2 Với các ưu thế như sự sẵn có của mồi, sự

hiện diện của nhiều bản sao trong tế bào, tính phổ quát cao và khả năng phân

biệt loài tốt, vùng ITS đã được xem như là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho

mã vạch trong thực vật [20], [28], [32] Vì vậy, vùng ITS được sử dụng để giám

định chính xác và hiệu quả các loài thực vật trong cùng họ với các đặc điểm

sống và nguồn gốc tiến hóa khác nhau Trong đó, việc sử dụng vùng ITS2 để

xác định cây thuốc và họ hàng gần của cây đã càng chứng tỏ về tiềm năng của gen này như một DNA mã vạch hữu ích cho thực vật [18], [19], [23]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu của đề tài là mẫu cây Ô đầu thu tại Quản Bạ, Hà Giang được trồng tại vườn Thực nghiệm, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Kit Gel QIAquick , các hóa chất như: cồn, agarose, EDTA, enzyme, isopropanol, isoamylalcohol, nước khử ion, Chlorofrorm… của các hãng Merck, Sigma, Invitrogen, Fermentas

Các thiết bị sử dụng trong đề tài gồm: Kính hiển vi kết nối máy tính, máy quang phổ UV - Visible Spectrometer (Cintra 40) của Australia; máy li tâm lạnh Heraeus của Đức; máy PCR - Veriti (Applied Biosystems) của Mĩ; tủ ấm (Hàn Quốc); máy điện di và bộ nguồn Power Pae 300 (Bio Rad) của Mĩ; pipet các loại (Gilson, Pháp); tủ sấy của Anh; cân điện tử của Thụy Sỹ; tủ lạnh âm 3000C (Sanyo, Nhật Bản); nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản); máy voltex (Đức)…

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại các phòng thí nghiệm khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống - Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên

Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS và gen matK được xác định tại

công ty 1st BASE tại Singapore

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

- Quan sát, mô tả, chụp ảnh về hình thái chung của cây Ô đầu

- Sử dụng phương pháp hình thái so sánh: căn cứ vào đặc điểm hình thái đối chiếu mô tả trong tài liệu chuyên khảo để xác định tên loài

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá

* Sử dụng phương pháp cắt lát, phương pháp nhuộm kép để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu

+ Phương pháp cắt lát: Dùng dao lam cắt lát thật mỏng theo những phương hướng nhất định trong không gian (theo mặt phẳng ngang, mặt phẳng dọc hay tiếp tuyến) Chú ý cắt lát thật mỏng thẳng góc với trục của vật mẫu, không nhay lại lát cắt, lát cắt phải đảm bảo vuông góc với trục thẳng của vật cắt

+ Nhuộm lát cắt theo phương pháp nhuộm kép: tiến hành nhuộm kép với thuốc nhuộm màu xanh metylen và cacmin Các bước thực hiện như sau:

Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch nước javen trong 10 - 15 phút

để tẩy sạch nội chất của tế bào

Bước 2: Rửa sạch javen bằng nước cất (2 - 3 lần)

Bước 3: Ngâm mẫu bằng axit axetic để sạch nước javen còn dính lại (nếu không javen sẽ làm mất màu thuốc nhuộm)

Bước 4: Rửa sạch axit axetic bằng nước cất (rửa 2 lần)

Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch cacmin trong khoảng 30 phút Bước 6: Rửa qua mẫu bằng nước cất (2-3 lần)

Bước 7: Nhuộm mẫu bằng dung dịch xanh metylen trong khoảng 30 giây Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất (2-3)

Bước 9: Lên kính, quan sát và chụp ảnh tiêu bản

* Phương pháp chụp ảnh hiển vi và phân tích giải phẫu

Ảnh được chụp trên kính hiển vi kết nối máy tính sử dụng phần mềm Microscope manger tại phòng thí nghiệm Thực vật học khoa Sinh học với các

độ phóng đại khác nhau và kết hợp với chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số

Sử dụng thuật ngữ để mô tả hình thái và cấu tạo giải phẫu theo các tài

liệu của các tác giả: Nguyễn Bá, 2010 (Hình thái học thực vật) [2]; Trần Công Khánh, 1981 (Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật) [9]; Đỗ Tất Lợi, 2004 (Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam) [12]

2.2.3 Phương pháp phân tử

* Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của cây Ô đầu được tách chiết theo quy trình thực hiện gồm các bước cụ thể như sau [22]:

- Ủ đệm chiết ở 650C trước khi tách 30 phút

- Cân 0.5 g mẫu lá, vệ sinh mẫu bằng cồn 70%

- Nghiền cẩn thận trong 0,5 ml đệm chiết thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml

- Bổ sung 1 ml đệm tách chiết đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất Ủ 650C trong 1 giờ 30 phút (10 phút đảo đều 1 lần )

- Bổ sung 0,5 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều Ly tâm 10000 v/p ở 4oC trong 15 phút Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới

- Bổ sung isopropanol lạnh tỉ lệ thể tích 1 : 1 với dịch thu được, đảo nhẹ,

để ở tủ -20oC trong 2 giờ

- Ly tâm 7000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa

- Bổ sung 1 ml cồn 70% Ly tâm 7000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa

- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan DNA trong 100 µl nước khử ion Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ

- Bảo quản DNA tổng số ở -20oC

* Phương pháp PCR

Khuếch đại vùng ITS và gen matK bằng PCR với các cặp mồi là: ITS-F/ ITS-R và matK-F/ matK-R Trình tự nucleotide của các cặp mồi này được thể

hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của cặp mồi ITS-F/ITS-R

và cặp mồi matK-F/matK-R

Kích thước đoạn DNA (bp) dự kiến

Gen matK được khuếch đại với chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR là 94oC trong 1 phút, phản ứng được lặp lại 35 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở

94oC trong 30 giây, tiếp hợp mồi ở 53oC trong 40 giây, tổng hợp ở 72oC cho 40 giây và bước kết thúc ở 72°C trong 5 phút