Nghiên cứu đặc điểm thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu nho nhe ((vigna umbellata) thu tại tỉnh yên bái và lai châu

Mục tiêu nghiên cứu Phân tích và so sánh được đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.. Nghiên cứu sử dụng

ĐẠ HỌC THÁ NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,

MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)

THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

I I

ĐẠ HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,

MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)

THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

Ngành: Di truyền học

Mã ngành: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Quân

THÁI NGUYÊN - 2018

I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn làtrung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Hải Yến

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS NguyễnHữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học TháiNguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quátrình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viênPhòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sưphạm - Đại học Thái Nguyên trong quá trình làm thí nghiệm

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáodục sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập

và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhiệm vụ bảo tồn và lưu giữ quỹ gencấp Bộ năm 2017 “Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen nhóm cây đậu đỗ địa phương thuthập từ các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam” Mã số B2017-TNA-10-QG

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích vàgiúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Hải Yến

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về cây đậu Nho nhe 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe 3

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe 3

1.1.4 Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe 6

1.2 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật 7

1.3 Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu 10

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 14

2.1.1 Vật liệu 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Thiết bị 14

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 15

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 16

2.2.3 Xác định hoạt tính α-amylase 16

2.2.4 Xác định hoạt tính protease 17

2.2.5 Ðịnh lượng protein tan 19

2.2.6 Xác định sự sinh trưởng của thân mầm và rễ mầm 19

2.2.7 Xác định hàm lượng isoflavone từ mầm đậu Nho nhe 19

2.2.8 Phương pháp sinh học phân tử 21

2.2.9 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu đậu Nho Nhe 23

3.2 Đặc điểm hóa sinh của mẫu đậu Nho nhe 27

3.2.1 Hàm lượng protein tan tổng số 27

3.2.2 Hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe 27

3.2.3 Hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe 27

3.2.4 Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe 28

3.3 Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho Nhe 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

KẾT LUẬN 36

KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 37

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

Amplified Fragments Length

Polymorphism Đa hình độ dài các đoạn khếch đại

bp Base pair Cặp bazơ nitơ

DNA sợi đôi được tổng hợp từcDNA Complementary DNA

mRNA nhờ enzyme phiên mã ngượcDNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA)

Ethylene diamine tetraa acid

EDTA

ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS

matK matK maturase Gen matK

mRNA Messenger RNA ARN thông tin

NADP Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

Coen z y m đ ược sử dụng trong phản

ứ ng đồng hóaPCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạnRNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit

rRNA RNA ribosome riboxom RNA

SSR Simple Sequence Repeats Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 14

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 15

Bảng 2.3 Chương trình gradient nồng độ của pha động 20

Bảng 2.4 Thông tin về cặp mồi nhân vùng gen ITS 21

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân vùng gen ITS 22

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái hạt của 02 mẫu đậu Nho nhe 24

Bảng 3.2 Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của 2 mẫu đậu Nho nhe 28

Bảng 3.3 Đặc điểm hóa sinh của 02 mẫu đậu Nho nhe 30

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ glucosamine theo phương pháp Miller 17

Hình 2.2 Đường chuẩn nồng độ tyrosine 19

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thân, lá (A), hoa (B), quả (C) và hạt (D) của mẫu đậu Nho nhe 23

Hình 3.2 Giải phẫu lá của đậu Nho nhe 25

Hình 3.3 Giải phẫu thân của đậu Nho nhe 26

Hình 3.4 Giải phẫu rễ của đậu Nho nhe 26

Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm 3 ngày tuổi 29

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số 30

Hình 3.7 Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB (A) và NN10-LC (B)

31 Hình 3.8 Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI 32

Hình 3.9 Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 trên GenBank 33

Hình 3.10 Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank 35

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu đỗ là nhóm cây có giá trị dinh dưỡng cao và đóng vai trò thiết yếu để nângcao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở những nước đang phát triển trong tìnhtrạng thiếu hụt protein Nguồn gen các nhóm cây đậu đỗ gồm những giống và loài câyhoang dại, cùng những dạng tài nguyên thực vật đáp ứng được yêu cầu của quá trìnhnghiên cứu và sản xuất nông nghiệp Nguồn gen của các nhóm cây đậu đỗ được coi là

cơ sở sinh học cho vấn đề an ninh lương thực thế giới cũng như ở Việt Nam Do vậy,nguồn gen các nhóm cây đậu đỗ cần phải được bảo tồn trong một môi trường thuậnlợi, ổn định, ít có những biến đổi khắc nghiệt mang tính hủy diệt nguồn gen

Ngày nay, do nhiều nguyên nhân như sự tăng dân số, nhu cầu lương thực và nhucầu khác của con người ngày càng tăng dẫn đến khai thác đất rừng, đất nông nghiệp

và các nguồn tài nguyên một cách quá mức, thiên tai, dịch bệnh và sự phát triểnnhanh của các giống mới có năng suất cao dẫn đến nguồn tài nguyên di truyền ởnhiều vùng sinh thái đã suy giảm nghiêm trọng Sự suy giảm nhanh và mức độ mạnhnhất là các khu vực miền núi khi mùa mưa đến Trước tình trạng các giống đậu đỗ địaphương, đặc biệt là giống đậu nho nhe đang dần bị thoái hóa và mất dần các đặc tínhquý của giống, việc thu thập nguồn gen, xác định đặc điểm sinh học và mã vạch DNA

Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích và so sánh được đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và trình tự

vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Xác định và so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu cây đậu Nho nhethuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu

(2) Xác định đặc điểm hóa sinh liên quan tới hàm lượng protein tan, hoạt tínhα-amilase, protease và hàm lượng isoflavone của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnhYên Bái và Lai Châu

(3) Phân lập và xác định được trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe

thu được

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây đậu Nho nhe

1.1.1 Hệ thống phân loại

Đậu Nho nhe còn có tên gọi khác là đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng, đậu đà,thua dài Đậu Nho nhe là loại cây phát triển ở vùng nhiệt đới đặc biệt là Châu Á vàđược trồng chủ yếu để làm thực phẩm Hạt và các bộ phận khác của đậu Nho nhecũng được sử dụng làm thức ăn cho gia súc

Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata, thuộc chi Vigna, họ

Fabaceae, bộ Fabale s , lớp Magn o liopsi d a , ngành Magno l iop h y t a

Công thức hoa chung của họ đậu là: ↑ K5C5A10-8-7G1

1.1.2 Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe

Đậu Nho nhe là cây thuộc họ đậu có tuổi thọ ngắn (cây một năm), được trồnghàng năm Thân của đậu Nho nhe thường mọc thay đổi, có thể thẳng đứng, bán thẳngđứng hoặc cuộn lại Chiều cao của thân cây từ 30-100 cm, một số loài chiều cao thânlên tới 200 cm Thân cây phân thành nhiều nhánh và có lông mịn phát triển trên thân

Hệ thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh với một rễ chính phát triển sâutrong đất có chiều dài từ 100-150 cm Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách,thường là lá kép ba lá chét với chiều dài của lá từ 6-9 cm Cụm hoa hình chùm, mọc ởnách lá dài từ 5-10 cm, hoa có màu vàng hoặc vàng sáng Hoa lưỡng tính, đều hoặckhông đều, mẫu 5 Hoa thường có 10 nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ Bộ nhụy gồm

có 1 lá noãn với nhiều não đảo hay cong Quả đậu, phôi lớn và thẳng, hạt không cónội nhũ hoặc nội nhũ kém phát triển

Quả của đậu Nho nhe có hình trụ cong, dài từ 7,5-12,5 cm chứa 6-10 hạt trongquả, hạt lõm một mặt có chiều dài từ 6-8 mm và có màu sắc thay đổi từ vàng xanhđến đen, vàng, nâu Các loại hạt màu vàng nâu được cho là bổ dưỡng nhất

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe

Độ ẩm: Độ ẩm của hạt đậu Nho nhe liên quan đến sự chín của hạt và sự tích lũy

các chất dinh dưỡng trong hạt, đây là một tiêu chí quan trọng góp phần vào quá trình

thu hái Giá trị về độ ẩm trong hạt giống của 13 mẫu đậu Nho nhe phụ thuộc vào kiểugen của từng giống và dao động từ 10,32-11,81% [24].

Protein tổng số: Hàm lượng protein tổng số được xác định là hàm lượng nitơ

tổng số có trong các nhóm amin của axit amin và vòng dị vòng của histidine,tryptophan, proline và hàm lượng hydroxyproline Kochhar và Hira (1997) đã phân

tích giá trị dinh dưỡng của các giống đậu Nho nhe Vigna radiata và chỉ ra hàm lượng

protein thô dao động từ 18,12-26,87% [18] Tiếp theo là nghiên cứu của Saikia vàđồng tác giả (1999) đã chỉ ra sự thay đổi hàm lượng protein trong các mẫu đậu Nhonhe dao động từ 16,91-18% [27] Chất lượng dinh dưỡng của 17 loài đậu Nho nhe đãđược Srivastava và đồng tác giả (2001) xác định Hàm lượng protein thô thay đổi từ20,34-22,97% [28] Năm 2002, Khabiruddin và đồng tác giả đã phân tích các loài đậukhác nhau thể hiện đặc điểm hóa sinh khác nhau Sự thay đổi hàm lượng protein tổng

số trong hạt chín khô của đậu Nho nhe thay đổi từ 15,83-19,01% [17] Sadana vàđồng tác giả (2006) đã xác định 14 mẫu đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng proteintổng số giao động từ 17,33-19,92% [24] Các dữ liệu về năng suất, chất lượng và giátrị bổ sung của các giống đậu Nho nhe đã được Raiger và đồng tác giả (2010) nghiêncứu Hàm lượng protein tổng số trong các giống đậu Nho nhe được trồng tại các địađiểm khác nhau ở Ấn Độ đạt từ 17,52-21,02% [22] Trong khi, Katoch (2011) đã xácđịnh 30 dòng đậu Nho nhe liên quan tới các đặc tính sinh lý và dinh dưỡng; đã chỉ rahàm lượng protein thay đổi từ 16,14-19,13% [16] Như vậy, hàm lượng protein tronghạt đậu Nho nhe giữa các giống là khác nhau

Chất béo tổng số: Thực phẩm thuộc cây họ đậu gồm đậu Nho nhe có chứa một

lượng lớn chất béo không nhìn thấy Tuy nhiên, thông tin thích hợp liên quan đến sựthay đổi thông số này đã được xem xét trên quan điểm chế độ ăn giống nhau Năm

1991, Gopalan và đồng tác giả đã báo cáo về giá trị chất béo tổng số dao động từ0,14-5,63% ở các mức tiêu thụ thông thường ngoại trừ đậu tương Trong khi hàmlượng chất béo trong các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 3,46 -4,03% [12].Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 mẫu đậu Nho nhe và xác địnhhàm lượng chất béo dao động từ 1,97 -3,73% [28] Trong khi, báo cáo về hàmlượng chất béo của Sharma (2002) là 0,83% [27] Năm 2011, Katoch đã phân

tích 30 mẫu đậu Nho nhe và xác định hàm lượng chất béo của đậu Nho nh e ở vụmùa dao động từ 0,57-2,13% [16].

Chất xơ tổng số: Negi và đồng tác giả (2001) [20], Srivastava và đồng tác giả

(2001) [28] đã nghiên cứu các thông số hóa sinh trong các giống đậu Nho nhekhác nhau chỉ ra giá trị của các tham số này giao động lần lượt từ 3,87 -4,48% và3,2-4,43% Năm 2006, Sadana và đồng tác giả đã đánh giá 14 mẫu đậu Nho nh eliên quan tới chất lượng và chỉ ra chất xơ tổng số dao động từ 2,1 4-3,33% [24].Trong khi, hàm lượng chất xơ của các mẫu đậu Nho nhe trồng tại Ấn Độ daođộng từ 4,85-6,30% [22] Nghiên cứu của Katoch (2011) trên 30 giống đậu Nhonhe liên quan đến đặc điểm dinh dưỡng và sinh lý học đã chỉ ra hàm lượng chất

xơ dao động từ 4,23-6,03% [16]

Carbohydrate và đường hòa tan tổng số: Igbedioh và đồng tác giả (1995) đã

phân tích hạt thô của các giống đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng carbohydrate đạt59,71-60,69% [14] Nghiên cứu của Saikia và đồng tác giả (1999) đã chỉ ra hàmlượng đường hòa tan và carbohydrate tổng số của bốn giống đậu Nho nhe dao độnglần lượt từ 4,91-5,62% và 52,21-55,03% [27] Năm 2004, Saharan và đồng tác giả đãchỉ ra hàm lượng đường hòa tan và tinh bột trong các giống đậu Nho nhe lần lượt là5,62% và 50,71% [25] Sadana và đồng tác giả (2006) đã chỉ ra hàm lượngcarbohydrate trung bình trong các giống đậu Nho nhe khác nhau đạt từ 60,59-63,41%[24] Trong khi, Katoch (2011) chứng minh hàm lượng carbohydrate trong đậu Nhonhe thay đổi từ 59,28-76,89% [16] Như vậy, hàm lượng đường hòa tan vàcarbohydrate tổng số của các giống đậu Nho nhe trồng ở các địa phương khác nhau làkhác nhau

Hàm lượng methionin và tryptophan: Sadana và đồng tác giả (2006) đã xác

định được hàm lượng methionin và tryptophan của 4 mẫu đậu Nho nhe dao động lầnlượt từ 64,53-124,94 mg/gN và 53-102 mg/gN [24] Trong khi, hàm lượng methionin

và tryptophan được Katoch (2011) xác định ở đậu Nho nhe lần lượt đạt 0,52-0,67g/16gN và 0,85-2,42 g/16gN [16]

Hàm lượng tanin: Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 giống đậu

Nho nhe liên quan đến các yếu tố dinh dưỡng và phi dinh dưỡng Kết quả nhận thấy,

hàm lượng polyphenol đạt từ 0,08-0,16% [28] Năm 2002, Khabiruddin báo cáo sựthay đổi hàm lượng phenolic trong 15 giống đậu Nho nhe dao động từ 0,36-1,78%[17] Saharan (2002) đã nghiên cứu các thông số lý hóa của các giống đậu tằm và đậuNho nhe có năng suất cao Nghiên cứu chỉ ra sự thay đổi hàm lượng polyphenol daođộng từ 750-1698 mg/100g [25] Priya (2005) đã xác định được tannin đặc có trong

30 giống đậu Nho nhe Hàm lượng tannin đặc được xác định từ 26-105 mg/100g Dữliệu được trình bày trong báo cáo thường niên của AICRN về các loại cây trồng đếnnăm 2010 nhận thấy, hàm lượng tannin tổng số trong các giống đậu Nho nhe daođộng từ 510-625 mg/100g [21]

Hàm lượng khoáng: Trong hạt đậu Nho nhe có chứa một số nguyên tố khoáng

như canxi, sắt, kẽm Hàm lượng của các nguyên tố khoáng này phụ thuộc vào từnggiống đậu Nho nhe khác nhau Sadana và đồng tác giả (2006) xác định hàm lượngcanxi và kẽm có trong hạt đậu Nho nhe lần lượt đạt từ 0,27-0,35% và 2,19-3,39 mg/100g [24] Năm 2010, Raiger và đồng tác giả đã xác định được hàm lượng canxi, sắt

và kẽm trong các giống đậu tương khác nhau trồng tại Ấn Độ lần lượt đạt từ 379; 3,87-8,95 và 2,55-4,30 mg/100g [22]

307-1.1.4 Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe

Các loài cây họ đậu là nguồn cung cấp protein rẻ, giàu dinh dưỡng và chấtlượng cao; có thể được thay thế cho protein động vật Các loài cây họ đậu cũng tạo racác chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng như dược phẩm, chất dinh dưỡng và các sảnphẩm phụ thân thiện với sinh thái như tannin, nướu, thuốc sát trùng, nhựa, véc ni,sơn, thuốc nhuộm và dầu diesel sinh học Ngoài ra, các loài cây họ đậu còn được sửdụng làm thức ăn cho động vật Các loài cây họ đậu còn góp phần phát triển nền nôngnghiệp bền vững: chúng làm giàu nitơ trong đất thông qua các vi khuẩn cộng sinh vàđóng vai trò quan trọng trong quá trình xen canh giữa cây ngũ cốc và cây rau [29]

Ở nước ta, đậu Nho nhe thường được trồng nhiều trên các nương ngô, trên đấtđồi núi thổ canh, trồng xen canh gối vụ với ngô nương Có khi cũng được trồng choleo lên hàng rào quanh nhà, từ vùng đồng bằng tới vùng núi có độ cao 1500m Câymọc nhanh, tái sinh khỏe, có khả năng chịu khô hạn Hạt đậu Nho nhe khô chứa13,3% hàm lượng nước; 0,9% protein; 64,9% gluxit; 4,8% chất xơ; 4,2% tro 100g

hạt cung cấp năng lượng là 1373 KJ Ngoài ra trong thành phần hạt đậu còn chứa nhiều canxi, sắt, phốt pho và các loại vitamin nhóm B như thianin, niacin, riboflavon.Năm 1996, de Carvalho và đồng tác giả nhận thấy hàm lượng protein của các

loài đậu Nho nhe hoang dại như Vigna minima cao hơn so với các dòng canh tác, vì

vậy các loài hoang dại có tiềm năng để cải thiện hàm lượng protein, nâng cao chấtlượng giống Ngoài ra, hàm lượng axit amin tổng số có trong đậu Nho nhe rất tốt chocon người Đậu Nho nhe là một loại cây giàu dinh dưỡng, nhiều protein cung cấp chongười và gia súc, đồng thời là một cây phân xanh phủ đất rất tốt đối với các cây đồinúi Cây, lá non và quả non cũng được dùng làm rau ăn Hạt có giá trị dinh dưỡngcao, dùng làm nhân bánh, nấu chè, thổi xôi, hầm thịt, nấu canh… Ngoài ra để làmthuốc người ta còn sử dụng nó như đậu Đỏ Ở Ấn Độ, lá đậu Nho nhe cùng với bộtgạo được dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạ dày

1.2 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật

Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếudựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ vàobảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống này bên cạnhcác ưu điểm, trong nhiều trường hợp còn gặp một số khó khăn và hạn chế như: nhiềusinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thốngphân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhaunhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác,phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệtđược sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoahọc công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phépchúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loàisinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó, sinh vật có thểđược định danh và được xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thểhay xuất xứ Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA

sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khácmột cách chính xác Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụhỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật Trong đó, mã

vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài.

Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen củasinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức năng,

nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1-5,8S-ITS2 Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1

và ITS2) được nối với nhau qua locus 5,8S Vùng 5,8S khá bảo thủ, trên thực tế có đủ

tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành Do đó các locus 5,8S có thể phục

vụ như là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài

và nhận diện Tiện ích của vùng bảo thủ như 5,8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở

dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [27]

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây

thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys

(UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen

trnK và chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng

cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực

vật [27]

Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là hướng nghiên cứu mới Nhậnthấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch DNA, ởViệt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu tiếp cận và quantâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mãvạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật, ) phục vụphân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tàinguyên sinh vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triểnkhai ở một số cơ sở nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trungtrên một số đối tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựngđược cơ sở dữ liệu về mã vạch DNA

Chi Vigna thuộc họ Fabaceae và được chia thành bảy phân họ, gồm hơn 150 loài phân bố khắp vùng nhiệt đới Các loài thuộc chi Vigna là các loại đậu thực phẩm

có tầm quan trọng kinh tế lớn trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước đang pháttriển Các đặc điểm hình thái truyền thống của các loài này không có sự khác biệtnhiều Một vài hệ thống mã vạch DNA đã được sử dụng nhiều năm trong nghiên cứu

đa dạng các loài thực vật Các hệ thống đánh dấu (chỉ thị) thường được sử dụng là:chỉ thị đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP), đa hình DNA nhân bản ngẫunhiên (RAPD), đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (AFLP), chuỗi lặp lại đơn giảngiữa (ISSRs), Chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp (cpSSR) Gần đây, mã vạch DNA đãđược sử dụng để xác định dựa vào vùng bảo thủ của hệ gen lục lạp; các vùng bảo thủnày được giải trình tự từ các mẫu giúp cho việc so sánh để phân biệt các mẫu dễ dàng[18] Do đó, một số locus trong hệ gen lục lạp đã được kiểm tra để xác định mã vạch

DNA Trong đó, việc kết hợp giữa gen rbcL và matK đã được đề xuất là mã vạch thực vật ưa thích [19] Giống như gen rbcL và matK, các nghiên cứu chứng minh các

vùng gen ITS có tiềm năng trong phân loại các loài thực vật, trong đó có các loài

thuộc chi Vigna.

Năm 2015, Raveendar và đồng tác giả đã sử dụng vùng gen ITS2 và gen matK

để phân loại các loài thuộc chi Vigna Kết quả cho thấy, trong tổng số 298 trình tự từ

52 loài Vigna trong nghiên cứu, đã xác định tỉ lệ 4 loại nucleotit lần lượt là

A=23,3±1,5%, T=25,4±4,7%, G=28,5±1,6%, C=22,8±3,4%; chiều dài của vùng gen

ITS2 là 413 nucleotit và gen matK là 469 nucleotit Sử dụng vùng gen ITS2 và gen matK chia 52 loài thành 6 nhóm: nhóm I (gồm các loài và dưới loài của V friesiorum), nhóm II (các loài của V membranacea), nhóm III (loài V schimperi),

nhóm IV (các loài V unguiculata, V radiate, V lobatifolia, V angivensis, V.

vexillata), nhóm V (gồm các loài V hosei, V racemose, V fischeri, V oblongifolia,

V marina, V luteola) và nhóm VI gồm những loài còn lại [23].

Chen và đồng tác giả (2016) đã sử dụng chỉ thị maker SSR để xác định các loài

đậu Nho nhe Vigna umbellata L Trong nghiên cứu này, khoảng 26 triệu trình tự

cDNA từ các loài đậu Nho nhe đã được xác định và được lắp ráp thành 71929 trình tự

có chiều dài trung bình khoảng 986 bp Trong số các trình tự này có 38840 trình tự có

sự tương đồng protein và trình tự nucleotit với các trình tự trên NCBI; 3018 trình tự

đã được xác định là chỉ thị SSR tiềm năng trong phân loại các loài V umbellate [10].

Năm 2004, Ba và đồng tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD để xác định 26 giống đậunho nhe (5 giống thuần chủng và 21 giống địa phương) từ Tây, Đông và Nam Phi 28cặp mồi được sử dụng để nhân dòng cho 202 băng; trong đó có 180 băng thể hiện sự

đa hình giữa các giống thuần chủng/181 giống địa phương Kết quả chứng minh đượccác giống địa phương có sự đa dạng hơn so với các giống thuần chủng [9]

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụngchỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn vàquản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

1.3 Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trên nhóm cây họ Đậu dựa trên trình tự

gen ITS như nghiên cứu của Krishna và đồng tác giả (2015) trên các giống đậu tương

về hệ thống phát sinh loài và các mối quan hệ hệ gen dựa trên vùng gen ITS của

rDNA Các mối quan hệ phát sinh loài trong tất cả 18 loài thuộc giống đậu tương

Glycine được suy ra từ trình tự nucleotide biến đổi trong vùng đệm (ITS) của rDNA.

Hệ số phân ly dao động từ 0,2% (một nucleotide đơn) giữa loài Glycine max và Glycine soja đến 8,6% giữa loài Glycine hirticaulis và Glycine falcata Độ dài của gen ITS1 và ITS2 dao động tương ứng từ 215-238 nucleotide và từ 205-222

nucleotide, gen 5,8S là 168 nucleotide trên tất cả các loài Dựa trên nghiên cứu này,

nhóm tác giả đã đưa ra các ký hiệu bộ gen mới là HH cho loài Glycine arenaria, HlHl cho loài Glycine hirticaulis, H2H2 cho loài Glycine pindanica, I1 cho loài Glycine albicans, và 1111 cho loài Glycine lactovirens.

Nhóm cây đậu đỗ ở Việt Nam đã được một số tác giả nghiên cứu như: LêQuang Vĩnh (2009) tiến hành “Theo dõi sự phát triển của một số loại cây phân xanh

họ đậu trồng xen với cây trồng lâm nghiệp trên vùng gò đồi ở trại Hương Vân, huyệnHương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế” Kết quả nghiên cứu nhận thấy các cây phân xanh

họ đậu như cốt khí, muông hoa vàng, keo đậu được trồng thành băng giữa hai hàngcây lâm nghiệp Thời gian đầu các cây phân xanh phát triển chậm (15-20 ngày), sau

đó phát triển nhanh dần và sau 30-40 ngày thì phát triển mạnh, nhiều nhánh và phủ

đất nhanh Thời gian che phủ đất của 2 loại cây phân xanh sau 80-90 ngày kể từ khigieo Độ ẩm đất trồng cây phân xanh họ đậu lớn hơn so với đối chứng Năm 2016,Trần Thị Trường và đồng tác giả tiến hành nghiên cứu chọn giống đậu tương kháng

bệnh phấn trắng (Microphaera diffusa) nhận thấy, tác nhân gây bệnh phấn trắng trên

cây đậu tương tại 6 vùng thu thập mẫu nấm ở Việt Nam là loài nấm có giai đoạn sinh

sản vô tính thuộc chi Oidium sp và xác định được 8 mẫu giống kháng cao; Đã xác

định được hệ số tương đồng di truyền giữa 34 giống đậu tương dao động trongkhoảng 0,1-0,74 và chỉ ra 3 chỉ thị có liên kết với gen kháng bệnh phấn trắng; Đãchọn được 12 dòng đậu tương triển vọng và khảo nghiệm 2 giống kháng bệnh phấntrắng và năng suất đạt 25,36-26,64 tạ/ha [7]

Hướng nghiên cứu về đa dạng di truyền: Phạm Thị Ngọc và đồng tác giả (2016)

đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu cô ve bằng chỉ thịhình thái và chỉ thị phân tử SSR của 60 mẫu giống đậu cô ve thu thập trong nước vànhập nội dựa trên chỉ thị hình thái (đặc điểm thực vật học, nông sinh học) và chỉ thịphân tử SSR Kết quả phân tích đa dạng di truyền dựa trên 16 chỉ thị hình thái đãphân chia các mẫu giống đậu cô ve thành 7 nhóm với hệ số tương đồng là 0,17 Sửdụng 20 chỉ thị SSR, kết quả phân tích PCR trên các mẫu giống của nghiên cứu, chỉ

có 15 chỉ thị xuất hiện băng DNA đa hình và 5 chỉ thị không xuất hiện băng DNA là:BM188, BMd-1, GATS91, C33 và C106 Kết quả thu được tổng số 69 allen đa hình,trong đó chỉ thị BM152 có hệ số đa dạng cao nhất là 0,73 Dựa trên kết quả phân tích

ma trận đồng hình, các mẫu giống đậu cô ve có hệ số tương đồng di truyền dao động

từ 0,57-1 Kết quả chứng tỏ các mẫu giống đậu cô ve thu thập có sự đa dạng cao vềmặt di truyền Nếu mức tương đồng di truyền là 0,69 có thể chia 60 mẫu giống thành

4 nhóm di truyền Kết quả của nghiên cứu thể hiện khả năng ứng dụng cao của chỉ thịSSR trong phân tích đa dạng di truyền đối với nguồn gen đậu cô ve Phân tích đadạng 60 mẫu giống làm cơ sở lựa chọn mẫu giống cho chương trình chọn giống đậu

cô ve cho các mục đích khác nhau [4]

Năm 2007, Nguyễn Thị Lang đã sử dụng 30 giống đậu nành từ ngân hàng gencủa Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu và đánh giá đa dạng nguồngen Dùng hai loại chỉ thị phân tử (chỉ thị RAPD và SSR), được thiết lập giữa các

alen của SSR và của RAPD khoảng cách di truyền của RAPD lớn hơn so với phươngpháp của SSR Điều này cũng ghi nhận bằng các tần suất alen có tương quan giữa cácgiống của RAPD rất cao (r = 0,64-0,98) Sự tương quan giữa các locus lớn nhất làOMDN109 và OMDN87, và tương quan giữa các locus nhỏ nhất là OMDN1 vàgiống OMDN36 Sự tương quan giữa các giống trong phương pháp SSR chỉ thị biếnđộng (r = 0,42-0,97) Các giống có chỉ số alen giữa các locus cao đó là OMDN118 vàOMDN34 Tương quan giữa các locus nhỏ nhất là OMDN113 và OMDN31 Thôngqua các dữ liệu chỉ thị RAPD với 9 mồi được sử dụng cho 30 giống phân thành 4nhóm chính Trong phân nhóm của SSR trên 6 chỉ thị được ghi nhận với 3 nhóm khácbiệt Sơ đồ phân nhóm hình cây phối hợp hai phương pháp chỉ thị phân tử được thiếtlập với 3 nhóm khác nhau Dựa vào chỉ thị phân tử có thể đánh giá gián tiếp sự hiệndiện hay không hiện diện của gen chọn lọc mà không bị ảnh hưởng của môi trường.Chỉ số đa dạng phân tích theo phương pháp SSR cao (H = 0,312), trong khi chỉ số đadạng của RAPD chỉ thị phân tử rất thấp (H = 0,124) Tương tự tần số đa hình táchtrên phương pháp chỉ thị SSR cũng cao hơn phương pháp chỉ thị RAPD Cả haiphương pháp cho sự tương quan trong nhóm rất cao với biến động từ 0,59 cho chỉ thịSSR và 0,77 cho chỉ thị RAPD Như vậy có thể sử dụng nhiều chỉ thị phân tử trongphân tích đa dạng, kết hợp với đánh giá tính trạng bằng kiểu hình để phục vụ cho vậtliệu ban đầu trong công tác chọn giống [3].

Vũ Thanh Trà (2012) đã sử dụng 15 cặp mồi SSR để phân tích sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt và đã xác định

14 cặp mồi cho thấy đa hình Kết quả chỉ ra có 81 alen đã được khuếch đại, các alenđược nhân bản với mỗi cặp mồi SSR dao động 4-8 Hàm lượng thông tin đa hình daođộng từ 0,473 (Satt042) đến 0,798 (Satt175) Trong 15 cặp mồi SSR, 10 cặp mồi cóbiểu hiện đa hình cao với hàm lượng thông tin đa hình có giá trị PIC

≥ 0,7 Các giống đậu tương nghiên cứu được phân thành hai nhóm rõ rệt: nhóm I chủyếu gồm các giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, nhóm II gồm các giống kháng bệnh vàtrung gian Khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 29% Thông tin này là cơ sở đểlựa chọn các giống đậu tương có khả năng chống gỉ sắt để sản xuất, đồng thời cũng là

cơ sở cho việc lựa chọn giống với sự khác biệt di truyền phục vụ chọn tạo giống đậutương [6]

Như vậy, các nghiên cứu về cây đậu đỗ tập trung vào các hướng chính như (1)Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, nông sinh học; (2) Nghiên cứu về đa hình của một

số giống đậu đỗ bằng các kỹ thuật RAPD, SSR Tuy nhiên, hướng nghiên cứu về sửdụng mã vạch DNA, cũng như nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, giải phẫu vàhóa sinh trên đối tượng đậu Nho nhe ở Việt Nam chưa có

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

Đệm, Taq DNA polymelase Invitrogen

Ethidium bromide Trung Quốc

Thang DNA Thụy Sỹ

Thuốc nhuộm Lugol, thuốc thử DNS, thuốc nhuộm

Coomassie Briliant Blue 20, thuốc thử foin