NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP TRỒNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum

Khảo sát năng suất và dược tính của nấm linh chi trồng trên các loại cơ chất trên.. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm linh chi trên các loại cơ chất khác nhau.. Được sử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

TRỒNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum

Sinh viên thực hiện : PHAN HỮU TÍN Niên khóa : 2007 – 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỬ SỤNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

TRỒNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum

ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 7/2011

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt bốn năm đại học dài đằng đẳng học tập, nghiên cứu, rèn luyện… bao

nhiêu niềm vui nỗi buồn để cuối cùng kết tinh vào cuốn luận văn này, tôi xin cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cơ sở

vật chất cho tôi học tập và nghiên cứu

Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng

dạy luôn tận tình truyền đạt kiến thức quý báu giúp em có được vốn tri thức vững chắc để

vào đời

Chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Minh Quang, cô Võ Thị Thúy

Huệ, cô Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ, chỉ dạy em hoàn thành khóa luận

này

Cảm ơn chị Trương Thị Ngọc Hân, chị Nguyễn Trường Ngọc Tú, chị Trần Thị

Quỳnh Diệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm vi sinh

Cảm ơn các em lớp DH08SH trong trại nấm Nola đã cùng tôi xây dựng và phát

triển trại nấm có được như ngày nay

Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Cẩm Tú đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực

hiện đề tài tốt nghiệp

Cảm ơn các bạn lớp DH07SH, đặc biệt là ban cán sự lớp, đã cùng tôi vượt qua bao

khó khăn, chia sẻ bao niềm vui nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn con xin dành cho cha mẹ đã sinh thành, dưỡng

dục, nuôi dạy con thành người

Tp HCM, ngày 11 tháng 07 năm 2011

TÓM TẮT

Nấm linh chi là một loại thảo dược quý giá mà thiên nhiên đã hào phóng ban tặng cho loài người Qua hàng trăm năm nghiên cứu và thử nghiệm, nấm linh chi ngày càng chứng tỏ khả năng phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh như: tim mạch, cao huyết áp, giảm cholesterol, ung thư, tiểu đường… Do đó, nhu cầu sử dụng nấm linh chi là rất cao Mặt khác, nước ta lại có nhiều loại cơ chất thích hợp cho nấm linh chi sinh trưởng và phát triển Những cơ chất đó thường là những phụ phẩm nông nghiệp Nếu tận dụng triệt để sẽ tạo ra một khối lượng sản phẩm nấm linh chi rất lớn Góp phần cải thiện thu nhập cho người nông dân và giảm tác hại ô nghiễm môi trường nhằm hướng tới một nên nông nghiệp bền vững

Nghiên cứu được tiến hành trên nấm linh chi chuẩn Ganoderma lucidum Bước đầu khảo

sát các hoạt tính enzyme amylase, cellulase của nấm linh chi Sau đó, chọn lọc môi trường nhân giống cấp 1: PGA, PGAY, MGA, MGAY thích hợp cho nấm linh chi Đồng thời thử

nghiệm bổ sung chế phẩm sinh học có chứa xạ khuẩn Streptomyces giúp phân giải nhanh

các loại cơ chất: mạt cưa cao su, mụn dừa, rơm rạ Khảo sát năng suất và dược tính của nấm linh chi trồng trên các loại cơ chất trên

Kết quả cho thấy có thể trồng được nấm linh chi trên các phụ phẩm nông nghiệp Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm linh chi trên các loại cơ chất khác nhau Xử lý nhanh các loại cơ chất bằng chế phẩm sinh học giúp giảm thời gian ủ nguyên liệu và tăng năng suất Đánh giá được một số dược tính quý của nấm linh chi

SUMMARY

Thesis title “Research used to planting Ganoderma lucidum on agricultural by- products”

Ganoderma is a valuable medicinal herb which nature gave us Over hundred years of research and testing, Ganoderma show the abilities in prevention and treatment some diseases like: heart disease, high blood pressure, reducing cholesterol, cancer, diabetes Therefore, the demand for Ganoderma is very high On the other hand, our country has a variety of substrates which suitable for Ganoderma’s growth and development These substrates are usually agricultural by- products If they are fully utilized, they will create a great volume of Ganoderma products, from that, improving farmers’ incomes and reducing environmental harms for a sustainable agriculture

This study was carried out on Ganoderma lucidum It is the initial surveys for the activity

of amylase and cellulase enzymes of Ganoderma Then, we select the mother spawn: PGA, PGAY, MGA, MGAY which suitable for Ganoderma We also did some

experiments of supplying some biological products containing Streptomyces actinobacteria

to resolved quickly some substrates: rubber sawdust, coconut sawdust, straw; make a survey on productivity and pharmaceutical value of Ganoderma grown on these substrates

Results agricultural by-products can be used for planting Ganoderma lucidum Assess the

growth and development of Ganoderma on different kinds of substances Dispose of the substrate was quick by probiotics to help reducing the incubation time and increasing productivity Besides, we evaluated some precious medicinal properties of Ganoderma

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 Mở đầu 1

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Nấm 3

2.1.1 Khái quát về nấm 3

2.1.2 Hình thái học sợi nấm 4

2.1.3 Hình thái học quả thể nấm 4

2.1.4 Sinh trưởng và biến dưỡng của nấm 5

2.2 Nấm linh chi Ganoderma lucidum 9

2.2.1 Phân loại 9

2.2.2 Đặc điểm hình thái 9

2.2.3 Đặc điểm sinh thái 10

2.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 10

2.2.5 Thành phần dược tính của nấm linh chi 11

2.3 Khái quát về xạ khuẩn 15

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu 17

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.2.2 Nguyên liệu 17

3.2.3 Hóa chất 17

3.2.4 Thiết bị 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Xác định hoạt tính enzyme cellulase và amylase của nấm linh chi 18

3.3.2 Khảo sát môi trường nhân giống cấp I 21

3.3.3 Tuyển chọn dòng xạ khuẩn 22

3.3.4 Khảo sát khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn được bổ sung vào quá trình ủ cơ chất 22

3.3.5 Khảo sát tốc độ lan tơ của nấm linh chi trên các cơ chất thí nghiệm 24

3.3.6 Khảo sát năng suất thu hoạch của nấm linh chi 24

3.3.7 Khảo sát dược tính của nấm linh chi trên các cơ chất thí nghiệm 25

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 38

Chương 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Xác định hoạt tính enzyme cellulase và amylase của nấm linh chi 34

4.2 Khảo sát môi trường nhân giống cấp I 34

4.3 Tuyển chọn dòng xạ khuẩn 31

4.4 Khảo sát khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn được bổ sung vào

quá trình ủ cơ chất 31

4.5 Khảo sát tốc độ lan tơ của nấm linh chi trên các cơ chất thí nghiệm 33

4.6 Khảo sát năng suất thu hoạch của nấm linh chi 34

4.7 Khảo sát dược tính của nấm linh chi trên các cơ chất thí nghiệm 35

Chương 5 Kết luận và đề nghị 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 42

Tài liệu tham khảo 43

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng 6

Bảng 2.2 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến nấm linh chi 8

Bảng 2.3 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm linh chi 14

Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn glucose 18

Bảng 3.2 Thực hiện phản ứng cellulase 19

Bảng 3.3 Phương pháp dựng đường chuẩn tinh bột 20

Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải cellulose và tinh bột 31

Bảng 4.2 Mô tả hình thái hệ tơ trong giai đoạn ủ trên từng loại cơ chất 33

Bảng 4.3 Đường kính và độ dày quả thể thí nghiệm 34

Bảng 4.4 Trọng lượng quả thể và hiệu suất sinh học của nấm linh chi 35

Bảng 4.5 Định tính alkaloid 35

Bảng 4.6 Thử nghiệm tính tạo bọt của saponin 36

Bảng 4.7 So sánh độ cao cột bong bóng ở thử nghiệm Fontan – Kaudel 37

Bảng 4.8 Định tính triterpenoid 37

Bảng 4.9 Định lượng polysaccharide 38

Bảng 4.10 Định tính acid hữu cơ 39

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 3.1 Phương pháp định lượng cellulose 23

Hình 3.2 Phương pháp định lượng Polysaccharide 27

Hình 4.1 Hoạt độ enzyme cellulase và amylase của nấm linh chi 29

Hình 4.2 Tốc độ lan tơ của nấm linh chi trên các loại môi trường nhân giống 30

Hình 4.3 Hàm lượng cellulose bị phân giải trong quá trình ủ nguyên liệu 32

Hình 4.4 Sự lan tơ của nấm Linh Chi 33

Hình 4.5 Tốc độ lan tơ trên các môi trường thí nghiệm 34

Hình 4.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 35

Hình 4.7 Thử nghiệm hợp chất saponin 36

Hình 4.8 Thử nghiệm Fontan - Kaudel 37

Hình 4.9 Định tính triterpenoid 38

Hình 4.10 Định tính acid hữu cơ 39

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Từ lâu đời nay, nấm là loại thực phẩm có giá trị cao không chỉ về hương vị đậm đà, dinh dưỡng cân đối mà còn là một vị thuốc quý có giá trị dược liệu cao Nấm chứa một hàm lượng dinh dưỡng rất phù hợp cho mọi người, kể cả người ăn kiêng, với một lượng đường, đạm, khoáng, vitamin cân đối Ngoài ra, nấm còn chứa một số dược tính quý: nấm mèo chữa lỵ, rong huyết, giải độc gan; nấm bào ngư chứa chất pleurotin (kháng sinh), retin (kháng ung thư), acid folic (chống thiếu máu)

Nhưng nổi trội hơn hết là nấm Linh Chi Ganoderma lucidum (GL) Được sử dụng từ hàng

ngàn năm nay, với hàm lượng dược tính cao, có công dụng phòng và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, GL được xếp vào loại “Thượng dược” trong sách “Thần nông bản thảo” và sau đó được danh y Trung Quốc Lý Thời Trân thời nhà Minh phân ra thành “ Lục bảo Linh Chi” (khoảng 1950) theo từng công dụng khác nhau Với nhiều tên gọi khác nhau: Bất Lão Thảo, Vạn Niên Nhung, Thần Tiên Thảo, Hổ Nhũ Linh Chi… Giá trị dược liệu của GL chủ yếu là do các thành phần: polysaccharide, triterpenoide, steroide,

adenosin, lactone Trong đó, thành phần polysaccharide và triterpenoide là quan trọng nhất, ảnh hưởng tới giá trị dược liệu của nấm GL

Trên thế giới đã có hàng trăm đề tài nghiên cứu về GL và ngày càng có nhiều công dụng của GL được phát hiện Những khảo sát dược lý và lâm sàng cho thấy GL có khả năng điều trị bệnh u bướu, tim mạch, suy nhược thần kinh, viêm phế quản mãn tính và hen suyễn, thiếu máu, bạch cầu giảm, viêm gan, hạ cholesterol, tiểu đường, đau khớp…cho thấy giá trị dược liệu quý giá của GL đối với con người

Việt Nam là nước có thế mạnh về nông nghiệp, mỗi năm đều có hàng ngàn tấn phụ phẩm giàu chất xơ (cellulose) và chất gỗ (lignin) được thải ra Hiện nay, tỷ lệ nông dân chiếm phần lớn dân số, có nhiều thời gian nông nhàn và rất muốn có thêm nghề phụ để nâng cao thu nhập Nấm Linh Chi sẽ là một lựa chọn tốt cho mọi người nông dân vì thích hợp cho nhiều vùng ở nước ta, dễ nuôi trồng, bảo quản, thị trường tiêu thụ lớn, giá trị dược liệu

kinh tế ở vùng đó nên không nhất thiết phải trồng nấm Linh Chi trên một loại cơ chất cố định

Do đó, đề tài “Nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp trồng nấm Linh Chi

Ganoderma lucidum” được tiến hành trên ba loại cơ chất: mạt cưa, rơm, mụn dừa

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát quy trình trồng nấm Linh Chi phù hợp với từng loại cơ chất khác nhau Đánh giá năng suất và chất lượng dược tính của nấm Linh Chi GL

1.3 Nội dung thực hiện

- Đo hoạt tính enzyme amylase, cenllulase của nấm Linh Chi

- Khảo sát môi trường nhân giống cấp I: PGA, PGAY, MGA, MGAY

- Tuyển chọn dòng xạ khuẩn

- Khảo sát khả năng phân giải cellulose và tinh bột của xạ khuẩn được bổ sung vào

quá trình ủ cơ chất

- Khảo sát tốc độ lan tơ của nấm Linh Chi trên các cơ chất thí nghiệm

- Khảo sát năng suất thu hoạch của nấm Linh Chi

- Khảo sát dược tính của nấm Linh Chi

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nấm

2.1.1 Khái quát về nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Trước đây, người ta thường cho rằng nấm là thực vật Thậm chí trong một số sách giáo khoa cũng coi nấm là thực vật Đó là một quan điểm không chính xác Nấm khác với

những thực vật xanh: không có lục lạp, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát triển chung như thực vật, đường dự trữ là glycogen thay vì tinh bột Đồng thời cũng không phải là động vật, nấm hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm, sinh sản bằng cách tạo bào tử hữu tính hoặc vô tính Chính vì thế, tất cả hệ thống phân loại sinh giới hiện nay đều coi nấm là một giới riêng, tương

đương với giới thực vật và giới động vật

Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ Whitaker đã đưa ra hệ thống phân loại 5 giới (Kingdom):

 Giới khởi sinh (Monera): Gồm vi khuẩn và tảo lam

 Giới nguyên sinh (Protista): Gồm một số tảo đơn bào, nấm đơn bào có khả năng di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật nguyên sinh

 Giới nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota)

 Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia)

 Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina)

Tất cả các loài nấm ăn hiện nay đều thuộc nấm túi (Ascomycotina) hoặc nấm đảm

(Basidiomycotina)

2.1.2 Hình thái học sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn, đường kính 2 – 4 µm Các ống đều có vách ngăn ngang Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty thể (mycelium) Khoảng cách giữa hai vách ngăn ngang (khoảng

3 -10 µm) được gọi là tế bào (cell) Thành tế bào sợi nấm đều có cấu tạo chủ yếu bởi kitin – glucan

Đối với nấm đảm có 3 cấp sợi nấm:

 Sợi nấm cấp một (sơ sinh): Lúc đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần dần

sẽ tạo vách ngăn và phân thành những tế bào đơn nhân trong sợi nấm

 Sợi Nấm cấp hai (thứ sinh): Tạo thành do sự phối trộn giữa hai sợi nấm cấp một Khi đó nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm khác dấu sẽ trộn với nhau Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho các tế bào có hai nhân, còn gọi là sợi nấm song nhân (dicaryolic hyphae)

 Sợi nấm cấp ba (tam sinh): Do sợi nấm cấp hai phát triển thành Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với nhau và tạo thành quả thể nấm

2.1.3 Hình thái học của quả thể nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Tản hay cơ thể của nấm là những tế bào đơn hay dạng sợi kéo dài Phần lớn các sợi phân nhánh Khi các sợi nấm bện lại với nhau tạo thành thể sinh bào tử, gọi là quả thể hay tai nấm Đặc trưng của nấm lớn là có cơ quan sinh sản bào tử kích thước lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, do sự kết bện của sợi nấm khi gặp điều kiện thuận lợi Thường

có hai kiểu quả thể trong nhóm nấm lớn:

 Kiểu 1: Bào tử thường được sinh ra trong những thể hình cầu, như những nấm thuộc Gasteromycetes

 Kiểu 2: Bào tử sinh ra ở một phần của quả thể nấm Những nấm này thuộc Basidiomycetes

Có thể bào tử ở phần phiến hay không thuộc phiến (Aphyllophorales) Ở nhóm này ta thường gặp hai kiểu quả thể như sau:

 Quả thể lật ngược, phiến ở phía trên hay không có phiến, thường không có hình dạng nhất định Chúng rất mỏng, đôi khi dày nhất đạt 2 mm

 Quả thể thẳng đứng, gặp ở nhóm Basibiomyceteses hay Discomycetes Các sợi nấm phủ lên nhau ở mặt ngoài hay chỉ một phần bên trên Những kiểu này quả thể rất khác nhau ở các phần chân nấm, mũ nấm, phiến nấm

2.1.4 Sinh trưởng và biến dưỡng của nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

2.1.4.1 Biến dưỡng của nấm

Nấm có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào, những enzym ngoại bào này giúp cho nấm biến đổi những chất hữu cơ phức tạp thành dạng hòa tan dễ hấp thu Chính vì thế, nấm chỉ có đời sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu cơ (động vật, thực vật) Thức ăn được hấp thu qua màng tế bào hệ sợi nấm Dựa vào cách hấp thu dinh dưỡng của nấm có thể chia làm 3 nhóm:

 Hoại sinh: Thức ăn là xác bã thực vật hay động vật Ở nhóm nấm này, chúng có khả năng biến đổi những chất khó phân hủy thành những chất đơn giản dễ hấp thu, nhờ hệ men ngoại bào

 Ký sinh: Chủ yếu các loài nấm gây bệnh, chúng sống bám vào cơ thể sinh vật khác

để hút thức ăn của sinh vật chủ

 Cộng sinh: Lấy thức ăn từ cơ thể sinh vật chủ nhưng không làm tổn hại sinh vật chủ, ngược lại còn giúp cho chúng phát triển tốt hơn (như nấm Tuber hay Boletus cộng sinh với cây thông sồi…)

2.1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm

 Nguồn carbon: Nguồn carbon được cung cấp từ môi trường ngoài để tổng hợp nên các chất như: hydratcarbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm Trong sinh khối nấm, carbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn carbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu carbon cũng khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản là glucose, với nồng độ đường là 2%

Trong tự nhiên, carbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn như: cellulose,

hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất này có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất Muốn tiêu hóa được cơ chất này, nấm tiết ra enzyme ngoại bào phân hủy cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể xâm nhập được vào trong thành và màng tế bào

 Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy, cần cho sự phát triển hệ sợi nấm Hệ sợi nấm sử dụng nguồn đạm để tổng hợp các chất hữu cơ như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào Nguồn đạm sử dụng trong các môi trường ở dạng muối: muối nitrat, muối amon

 Khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm

 Nguồn suful: Được cung cấp vào môi trường từ nguồn sulfat và cần thiết để tổng hợp một số loại acid amin

 Nguồn phosphat: Tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng Nguồn cung cấp phospho thường là từ muối phosphat

 Nguồn kali: Đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động Đồng thời đóng vai trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và ngoài tế bào

 Magiê: Cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, nguồn magiê được cung cấp từ sulfat magiê

Bảng 2.1 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng

 Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít, chúng không phải

là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động của enzym Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần một lượng rất ít nhưng không thể thiếu Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin (vitamin H) và thiamin (vitamin B1)

2.1.4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên sự hình thành quả thể nấm Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm với mức độ khác nhau: mức độ tác động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu, mức độ tác động lớn nhất Những yếu tố tác động trực tiếp lên sự sinh trưởng sợi nấm là nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và độ thông khí

 Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào, kích thích hoạt động các chất sinh trưởng, các enzym và chi phối toàn bộ các hoạt động sống của nấm Mỗi loài nấm có nhu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển khác nhau Nhiệt độ nuôi ủ hệ sợi bao giờ cũng cao hơn so với khi nấm ra quả thể vài độ Nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại hoặc chết hẳn

 Ánh sáng: Không cần cho quá trình sinh trưởng của nấm Cường độ ánh sáng mạnh kiềm chế sự sinh trưởng của sợi nấm, có trường hợp giết chết sợi nấm Ánh sáng có thể phá vỡ một số vitamin và enzym cần thiết, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường của sợi nấm Phòng ủ nấm không nên quá tối, sẽ gây trở ngại cho việc phát hiện bệnh và nhất

là tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, côn trùng phát triển Trong giai đoạn nuôi hệ sợi tạo quả thể, ánh sáng có tác dụng kích thích hệ sợi nấm kết hạch (nụ nấm)

 Độ ẩm: Hầu hết các loài nấm cần độ ẩm cao Một số loài thuộc nấm đảm cần độ ẩm thích hợp cho sự sinh trưởng tối ưu của sợi nấm (80 – 90 %) Nhưng hầu hết các loài nấm cần độ ẩm để sinh trưởng hệ sợi là 50 – 60 % (Flegg, 1962)

 Độ thông khí: Hàm lượng O2 và CO2 ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của sợi nấm Oxy cần thiết cho việc hô hấp của hệ sợi nấm Còn nồng độ CO2 tăng cao trong không khí sẽ ức chế quá trình hình thành quả thể nấm

 pH: Hầu hết các nhóm nấm mọc trên thực vật hay ký sinh thì thích hợp đối với

môi trường pH thấp Các loài nấm mọc trên mùn bã hay trên đất thì thích hợp với môi

trường pH trung tính hay môi trường kiềm Nhưng một số loại nấm có khả năng mọc được

ở biên độ pH khá rộng Một số loài nấm có khả năng tự điều chỉnh pH môi trường về pH

thích hợp cho sự sinh trưởng chính chúng

Bảng 2.2 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến nấm Linh Chi

2.1.4.4 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của sợi nấm

Giai đoạn sinh trưởng

Giai đoạn này thường dài, nấm ở giai đoạn này chủ yếu là dạng sợi Sợi nấm mỏng

manh và gồm 2 nhân, có nguồn gốc từ 2 bào tử khác nhau nẩy mầm và phối hợp

lại Hệ sợi nấm, còn gọi là hệ sợi dinh dưỡng, len lỏi trong cơ chất để rút lấy thức ăn

Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng tế bào Khi khối sợi đạt đến mức

độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, sẽ bện kết lại tạo thành quả thể nấm

Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành các bào tử tiềm sinh hay hậu bào tử

Giai đoạn phát triển

Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình thành một dạng đặc

biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm (fruit body) Quả thể thường có kích thước lớn và là

cơ quan sinh sản của nấm Trên quả thể có một cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn sợi

nấm, đó là thụ tầng (hymenium) Chính ở đây hai nhân của tế bào sẽ nhập lại thành một

Sau đó sẽ chia thành bốn nhân con hình thành các bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào

tử (basidiospore) hoặc nang bào tử (ascospore) Khi tai nấm trưởng thành, bào tử được phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục

2.2 Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum (Lê Xuân Thám, 1996)

Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều di dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu

- vàng cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen, nhẵn bóng, láng như verni Thường sẫm màu dần khi già, lớp vỏ láng phủ tràn kín mặt trên mũ, đôi khi có lớp phấn Kích thước mũ nấm có biến động Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống như rốn

Phần thịt nấm (context), màu vàng kem – nâu lợt – trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới Ở lớp trên, thấy rõ các tia sợi hướng lên, đầu các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng chứa laccate không tan trong nước nên nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

Tầng sinh sản ( thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,8 cm, màu kem – nâu nhạt gồm các ống nhỏ thăng, miệng gần tròn, màu trắng – vàng chanh nhạt, khoảng 3 – 5 ống/mm

Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng – hình chùy, không màu Dài 16 – 22 µm, mang bốn đảm bào tử (basidiospores)

Đảm bào tử dạng trứng cụt (truncate), cấu trúc lớp vỏ kép (bitunicate), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu Kích thước dao động 8 – 11,5 x 6 – 7,7 µm

2.2.3 Đặc điểm sinh thái

Nấm Linh Chi phân bố rộng khắp Việt Nam từ Bắc vào Nam, từ vùng rừng núi, cao

nguyên tới đồng bằng

Nấm Linh Chi thường mọc trên các loại cây gỗ thuộc bộ đậu (Fabales) sống hay đã chết Quả thể rộ vào mùa mưa, có thể ở trên thân cây (cuống thường ngắn, quả thể nhỏ), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (nổi hoặc ngầm gần mặt đất), khi ấy cuống nấm thường dài, có thể phân nhánh và tán nấm rất lớn (≈ 30 cm)

Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ

2.2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Từ đầu thế kỷ 17, Trung Quốc đã nuôi trồng đại trà nấm Linh Chi bởi giá trị dược liệu cao của chúng Đến năm 1936, Nhật Bản mới đưa vào trồng đại trà và sản lượng tăng vọt lên nhiều lần Nếu tính đến công trình tổng quan của Jong và Birmingham (1992), thì thống

kê chưa đầy đủ cho con số trên 200 công trình khảo cứu hóa dược lý các loài nấm Linh Chi

Ở Đài Loan, Peng (1990), Hseu (1992) đã sưu tầm, nuôi trồng với hơn 10 loài Linh Chi khác nhau Hàn Quốc cũng chiếm một thị phần đáng kể song Trung Quốc vẫn là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh Chi

Gần đây, các nước Đông Nam Á cũng bắt đầu nuôi trồng nấm Linh Chi Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình ngắn ngày Thái Lan đã có một số trang trại nuôi trồng nấm Linh Chi cỡ vừa, góp phần vào sản lượng chung cho thế giới

Do giá trị dược liệu cao của các nấm Linh Chi, nên Mỹ đã bắt đầu nghiên cứu và nuôi trồng ở quy mô công nghiệp Vào tháng 7/1994, hội nghị Nấm học thế giới tại Vancouver (Canada) đã quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh Chi quốc tế, trụ sở tại New York (Mỹ) Tháng 10/1994, Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh Chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc Tháng 7/1996, Hội nghị quốc tế nấm học châu Á lại dành một trong năm hội thảo cho các báo cáo về nấm Linh Chi tại Đại học Chiba, Nhật Bản Tháng

8/1996, Hội nghị Quốc tế nghiên cứu nấm Linh Chi được tổ chức tạiTrung tâm hội nghị Quốc tế Đài Bắc, Đài Loan Tại mỗi hội nghị số lượng báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú kì thú cùa các nấm Linh Chi

Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu còn khiêm tốn Vào thập niên 90, sản lượng nuôi trồng nấm Linh Chi mới thực sự bùng nổ ở thành phố Hồ Chí Minh, sản lượng ước đạt 10 tấn Nhưng còn manh mún, chưa thực sự phát triển lớn mạnh và bền vững Do đó, sản lượng chưa cao, chất lượng còn thấp và thị trường tiêu thụ còn hạn chế

Hiện nay, đi đầu trong công tác nghiên cứu, bảo tồn giống và sản xuất nấm Linh Chi phải

kể đến Trung tâm nghiên cứu Linh Chi và nấm dược liệu, Viện di truyền Nông nghiệp, Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội, Trung tâm công nghệ sinh học ứng dụng, Đại học Nông Lâm Tp HCM… Ngoài ra còn có hàng ngàn hộ nông dân, các hợp tác xã nông nghiệp, các làng nghề trên khắp cả nước cũng tham gia sản xuất một số lượng đáng kể

Do nhu cầu ngày càng tăng về nấm ăn và nấm dược liệu, việc thành lập một viện nghiên cứu nấm ăn và nấm dược liệu là rất cần thiết Viện này sẽ là nơi lưu trữ, bảo tồn nguồn gen từ thiên nhiên hoang dại của Việt Nam cũng như nguồn gen di thực Nơi trưng bày các mẫu nấm với sự đa dạng vốn có Nơi tham quan, trao đổi về học thuật Cũng là nơi xây dựng mô hình sản xuất nấm công nghiệp Cung cấp đủ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu Làm được như vậy thì việc bảo tồn, phát triển và sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu mới thành công được

2.2.5 Thành phần dược tính nấm Linh Chi

Với phương pháp cổ điển trước đây người ta đã phân tích các thành phần dược tính tổng quát của nấm Linh Chi như sau: Nước : 12 – 13%, cellulose : 54 – 56%, lignin: 13 – 14%,

hợp chất nitơ :1,6 – 2,1%, chất béo ( kể cả dạng xà phòng hóa): 1,9 – 2%, hợp chất

phenol: 0,08 – 0,1%, hợp chất Sterol toàn phần: 0,11 – 0,16%, saponin toàn phần : 0,3 – 1,23% (theo Bùi Chí Hiếu và ctv., 1993) Còn hiện nay, người ta đã xác định được hàng trăm loại hoạt chất sinh học khác nhau, chủ yếu bao gồm polysaccharide, triterpenoide, nucleotide, steroide, acid béo, peptid và các nguyên tố vi lượng

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol A và

B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R Trong đó kiểu Lanostane triterpene có thành phần chính là lipophilic Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpene của nấm Linh Chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính Ganopoly ức chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử

của polysaccharide từ G lucidum là khoảng 7.100 – 9.300 Những tổng kết về vai trò

sinh dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh Chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ

He và ctv (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có hoạt tính tăng miễn dịch Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside

Hikino và ctv từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều polysaccharide Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư Các ganoderan

B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường

Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp

Protoplast giữa chủng G lucidum với G applanatum, thậm chí với cả nấm hương

(Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức

polysaccharide – protein lên đáng kể

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2

(Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh Chi

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực chống

khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G lucidum và G applanatum

(Takashi, 1985; Liu G.T, 1993)

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine, triterpenoide và các acid ganoderic Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino enzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp

2.2.4.1 Polysaccharide

Các polysaccharide là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong nấm Linh Chi và gần đây người ta thấy chúng cũng có hiện diện ở nhiều loài nấm khác, rất được các nhà y dược học coi trọng Qua nghiên cứu phát hiện polysaccharide có hoạt tính dược lý rộng, nâng cao khả năng miễn dịch cơ thể, điều hòa hệ thống miễn nhiễm của cơ thể, có tác dụng chống phóng xạ, nâng cao chức năng gan, tủy xương, máu, tăng sinh tổng hợp các thành tố: DNA, RNA, protein, kéo dài tuổi thọ, chống u ác tính

Thành phần polysaccharide ở Linh Chi nay đã được xác định, phân ly thành hơn 200 loại, tức các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau, trong đó phần lớn là β-glucan, một

số ít là γ-glucan β-glucan là chất thuộc loại kết cấu, tồn tại ở thành tế bào,

α-glucan là chất tồn trữ, tồn tại ở trong thành tế bào Thành phần polysaccharide ở Linh Chi, có cấu tạo hình lập thể dạng xoắn ốc, giữa lớp xoắn ốc chủ yếu định vị cố định bằng liên kết hydro (hydrogen bond), phân tử lượng từ mấy trăm đến mấy ngàn vạn, ngoài một

số ít tiểu phân tử đa đường, đại đa số không hòa tan ở trong rượu nồng độ cao, nhưng có

thể hòa tan trong nước nóng Hoạt tính dược lý của Polysaccharide ở Linh Chi có liên quan đến kết cấu lập thể, cấu hình lập thể dạng xoắn ốc bị phá hủy thì hoạt tính

polysaccharide giảm đi nhiều Polysaccharide Linh Chi có 3 cách thức ức chế khối u:

 Qua nâng cao miễn dịch của cơ thể, khiến tế bào miễn dịch tấn công và giết chết u

ác tính phát triển thơi kì đầu

 Nâng cao khả năng hình thành albumin sợi ở tiểu cầu, lượng lớn albumin sợi sẽ bao vây khối u ác tính ở thời kì đầu, cách ly nó với bên ngoài, chặn đứng nguồn dinh dưỡng cung cấp cho nó, khiến nó trường kì ở trong trạng thái “ngủ”

 Kìm hãm sự phát triển của tế bào u ác tính Ngày nay, polysaccharide nấm đã trở thành một trong những dược liệu dùng để hỗ trợ điều trị u ác tính

2.2.4.2 Ganoderic acid

Ganoderic acid là một trong những thành phần chủ yếu của nấm Linh Chi, là một phạm trù rộng, gồm hàng loạt các hoạt chất có hoạt tính dược lý mạnh, đồng thời có tác dụng giảm đau, giải độc, dưỡng gan, tiêu diệt tế bào u ác tính

Ganoderic acid là một nhóm hoạt chất loại triterpenoid Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpene có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH, -Oac, eter -O-, Carbanil C=O, nối đôi C=C Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, clorofrom), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường tạo thành glycosid

Bảng 2.3 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh Chi

Hoạt chất Hoạt tính

Ganoderic acid B,D,F,H,K,S,Y Hạ huyết áp

Ganodermaldiol Hạ huyết áp

 Saponin triterpenoid pentacylic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean

 Saponin triterpenoid tetracylic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dummanran, lanostan, cucurbitan

Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan

2.2.4.6 Germanium

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà hóa học người Đức khám phá vào năm 1885

Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen Nó

kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa

Germanium sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khỏe Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất

Germanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

2.3 Khái quát về xạ khuẩn Streptomyces (Huỳnh Thư, 2009)

Streptomyces phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, phế phẩm nông nghiệp, phân

chuồng, gỗ mục, rác… Đất là môi trường sống chính của Streptomyces, đặc biệt là lớp đất

bề mặt (40 cm bên trên) Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU-colony forming unit) thường khoảng 105 – 107 trong một 1 g đất

Trên môi trường dinh dưỡng đặc, khuẩn ty phát triển mạnh, bện vào nhau tạo thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ Sinh ra nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán

ra môi trường Khuẩn lạc bám vào cơ chất nhờ các khuẩn ty cơ chất Trên bề mặt khuẩn lạc là hệ khuẩn ty khí sinh

Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa mycolic acid Thành phần menaquinone chính là MK-9(H6), MK-9(H8) Thành phần phospholipid chính là diphosphatidylglycerol,

phosphatidylethanolalanine, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside

Streptomyces có khả năng chuyển hóa và phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp như

cellulose, chitin, hemicellulose, lignin… Streptomyces tiềm năng rất lớn trong việc sản

xuất enzyme, đây cũng là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng, được nhiều nhà

khoa học quan tâm Các enzyme thủy phân ở Streptomyces thường có gồm: amylase,

cellulase, protease, mannanase, pectinase, chitinase Trong khuôn khổ của đề này, nghiên

cứu này tập trung về khả năng sinh enzyme amylase và cellulase của Streptomyces nhằm

ứng dụng vào việc xử lý nguyên liệu trong trồng nấm ăn và nấm dược liệu

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ ngày 15/01/2011 đến ngày 30/06/2011

Địa điểm nghiên cứu: Trại Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh Chi GL do Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, Đại học

Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp

Các chủng xạ khuẩn thí nghiệm do Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Và Môi

Trường, trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp

3.2.2 Nguyên liệu

 Mạt cưa cao su: ở huyện Dầu Tiếng, tỉnh Bình Dương

 Rơm rạ: ở thị xã Thuận An, tỉnh Bình Dương

 Mụn dừa: ở quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xác định hoạt tính enzyme cellulase, amylase của nấm Linh Chi

3.3.1.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy bán rắn

Chuẩn bị môi trường: trấu 30 g, cám 30 g, bã khoai mì 35 g, (NH4)2SO4 3 g, Urea 1,5 g,

KH2PO4 0,6 g, MgSO4 0,02 g, CaCl 0,3 g, H2O 55 – 60% Trộn đều rồi cho vào chai thuỷ tinh khối lượng 100g/chai thủy tinh Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C,

1 atm/60 phút, rồi để nguội ở nhiệt độ phòng Tiến hành cấy giống trong tủ vô trùng Lấy giống gốc nấm Linh Chi, cắt một mảnh thạch 1 cm x 1 cm cho vào chai mạt cưa Ủ ở

nhiệt độ phòng trong vòng 10 ngày

Sau thời gian nuôi cấy, thu nhận enzyme bằng cách lấy 10 g mạt cưa có hệ sợi nấm Linh Chi cho vào 100 ml nước cất Lắc trong 30 phút, rồi lọc thu dịch chiết enzyme thô và

đem xác định hoạt độ enzyme

3.3.1.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase (phương pháp Miller)

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS

Cường độ tạo màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa vào

biểu đồ đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng

đường khử của mẫu nghiên cứu

- Thuốc thử DNS: cân 1 g DNS pha trong 20 ml NaOH 2N, thêm 50 ml nước cất và

30 g muối sodium potassium tartrate Đun cách thủy cho tan rồi định mức cho đủ 100 ml

- Dung dịch acid acetic 0,1 N: pha loãng 5,8 ml dung dịch CH3COOH đậm đặc trong nước thành 1000 ml

- Dung dịch sodium acetate 0,1 N: cân 8,2 g CH3COONa cho vào1000 ml nước

- Dung dịch đệm acetate 0,1 N, pH 5: trộn đều 14,8 ml dung dịch CH3COOH 0,1 N

và 35,2 dung dịch CH3COONa 0,1 N và 50 ml nước cất

Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn glucose

Dung dịch glucose mẫu 500 µg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Hút ra 5 ống nghiệm tương tứng với lượng từ 0,1 đến 0,5 ml dung dịch glucose mẫu

Thêm nước cất cho vừa đủ 0,5 ml Ống kiểm chứng chứa 0,5 ml nước cất Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml thuốc thử DNS Đun cách thủy 3 phút rồi làm lạnh dưới vòi nước

chảy Thêm vào mỗi ống 5 ml nước cất Đo OD ở bước sóng 530 nm

Vẽ đường chuẩn glucose mẫu 500 µg/ml với trục tung là mật độ quang, trục hoành là

nồng độ glucose mẫu (µg/ml)

Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với lượng thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng biểu đồ đường chuẩn Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng

Ở đây ta xác định hoạt tính cellulase bằng cách xác định hoạt tính của các enzyme C1 và

Cx thông qua việc xác định lượng đường khử theo phương pháp Miller: cho enzyme tác dụng với cơ chất thích hợp trong điều kiện nhất định và xác định lượng đường khử tạo

Hút 0,5 ml từ các ống nghiệm trên sang các ống nghiệm khác, thêm 0,5 ml thuốc thử DNS, đun sôi 5 phút, thêm 5 ml nước cất, lắc đều, đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1 µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ ở nhiệt độ 400C

Hđ cellulasae (UI/g) = Trong đó: Hđcellulase : hoạt độ cellulase (UI/g)

a.n.5.V

M

n: hệ số pha loãng

V: thể tích enzyme ban đầu (ml) M: khối lượng canh trường (g)

3.3.1.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase (phương pháp Henkel)

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường

độ màu của hỗn hợp phản ứng và dung dịch Iod

- Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1 g NaCl trong nước thành 100 ml

- Dung dịch HCl 1N: pha loãng 5 ml dung dịch HCl 12 N trong 55 ml nước cất

- Dung dịch Iod (I2): hòa tan 1 g Iod vào 5ml dung dịch có chứa 2 g KI, thêm nước cất đến 100 ml Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần

- Dung dịch NaH2PO4 0,05M: hòa tan 1,9502 g NaH2PO4.2H2O trong 250 ml nước

- Dung dịch Na2HPO4 0,05M: hòa tan 0,8962 g Na2HPO4.12H2O trong 50 ml nước

- Dung dịch đệm Phosphate 0,05M, pH 6: trộn chung 87,7 ml dung dịch NaH2PO4

0,05M; 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05M và 100 ml nước cất

- Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1 g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,05M; pH 6 thành 100 ml

Dung dịch tiêu chuẩn 1%: hòa tan 1 g tinh bột trong nước cất thành 100 ml Từ dung dịch chuẩn bị các dung dịch có chứa 0, 2, 4, 6, 8 và 10 mg tinh bột trong 1 ml

Lập đồ thị tiêu chuẩn: lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn bị như tên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm phosphate, 0,1 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch HCl 1N, lắc đều rồi thêm 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần, so màu ở bước sóng

Dựng đồ thị đường chuẩn tinh bột với trục tung là hiệu số chuẩn độ hấp thu OD, trục hoành là nồng độ tinh bột (mg/ml)

Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và

2 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6.0 Lắc đều, để ở 300C trong 15 - 20 phút để dung dịch đạt 300C Thêm vào hỗn hợp 1 ml enzyme đã đạt 300C Lắc đều và tiếp tục giữ

ở 300C trong 30 phút Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5 ml HCl 1N để làm ngừng phản ứng Lấy 1 ml của mẫu thí nghiệm thêm vào 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng

450 lần Lắc đều rồi so màu ở bước sóng 560 nm, được độ hấp thụ OD là MT

Song song với mẫu thí nghiệm, mẫu đối chứng cũng làm tương tự nhưng cho dung dịch HCl 1N vô trước rồi mới cho enzyme vào sau Lấy 1 ml của mẫu đối chứng thêm vào 9

ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần Lắc đều rồi so màu ở bước sóng 560 nm, được độ hấp thụ OD là MK

Tính hoạt độ amylase (UI/g) =

Trong đó: X: số mg tinh bột bị thủy phân

n: độ pha loãng

V : thể tích enzyme ban đầu (ml)

10: thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml)

m: khối lượng môi trường cần đo OD (g)

3.3.2 Khảo sát môi trường nhân giống cấp I (Lê Duy Thắng, 2009)

3.3.2.1 Chuẩn bị môi trường PGA, PGAY, MGA, MGAY

 Chuẩn bị môi trường PGA/PGAY: khoai tây gọt vỏ 200 g, rửa sạch, cắt nhỏ, đun sôi trong vòng 20 – 30 phút Lọc lấy nước, cho đường glucose 20 g, (PGAY cho thêm

2 g cao nấm men), agar 20 g Cho vào nồi, đun để hòa tan hết agar Cho nước cất định mức đến 1000 ml

 Chuẩn bị môi trường MGA/MGAY: đun 500 ml nước cho nóng, rồi cho cao đại mạch 20 g, đường glucose 20 g, (MGAY cho thêm 2 g cao nấm men), agar 20 g Đun cho tan hết agar Cho nước cất vào định mức đến 1000 ml

X.n.10.V

m

Các môi trường đều cho vào chai thủy tinh đem hấp khử trùng 121oC/ 1 atm trong vòng 25 phút Sau đó đổ vào các đĩa petri vô trùng Chờ agar đông đặc lại thì đem ghi tên môi trường và úp ngược đĩa cho vào bịch nilon

3.3.2.2 Cách tiến hành cấy giống gốc linh chi

Tiến hành trong tủ cấy vô trùng Sau khi khử trùng tủ cấy, dùng dao hoặc que cấy cắt một mảnh thạch có chứa tơ nấm chuyển sang đĩa môi trường thí nghiệm rồi đem ủ ở nhiệt

độ phòng (25 – 300C) Sau đó, theo dõi và tiến hành đo đường kính khuẩn lạc định kì 2 ngày một lần cho đến khi hệ sợi lan hết đĩa petri

3.3.3 Tuyển chọn dòng xạ khuẩn (Huỳnh Thư, 2009)

Khi có mặt cơ chất, tế bào vi nấm sẽ tổng hợp enzyme tương ứng thông qua cơ chế cảm ứng và chính cơ chất là yếu tố kích thích tế bào tiết enzyme thực hiện phản ứng phân giải (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

3.3.3.1 Chuẩn bị môi trường Czapek và tinh bột tan

Môi trường Czapek: CMC 10 g, glucose 5 g, NaNO3 3,5 g, K2HPO4 0,5 g, KCl 0,5

g, FeSO4 0,01 g, Agar 20 g, nước cất vừa đủ 1000 ml

Môi trường tinh bột tan: Tinh bột tan 10 g, NaNO3 1 g, K2HPO4 0,3 g, MgCO3 1g,

agar 20 g, nước cất vừa đủ 1000 ml

Môi trường Czapek dùng để cảm ứng enzyme cellulase Còn môi trường tinh bột tan dùng để cảm ứng enzyme amylase Các môi trường cho vào chai thủy tinh đem hấp khử trùng 1210C/ 1 atm trong vòng 25 phút Sau đó đổ vào các đĩa petri vô trùng Chờ agar đông đặc lại thì ghi tên môi trường và úp ngược đĩa cho vào bịch nilon

3.3.3.2 Cách tiến hành cấy giống xạ khuẩn

Tiến hành trong tủ cấy vô trùng Chuẩn bị các đĩa petri có kích thước bằng nhau như mục 3.3.3.2 và các ống giống xạ khuẩn thí nghiệm Cấy chấm mỗi chủng xạ khuẩn vào chính giữa đĩa Mỗi dòng định tính lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 đĩa petri Ủ trong nhiệt độ phòng (25 – 300C) trong 7 ngày Sử dụng thuốc thử Lugol cho vào đĩa petri, để yên trong

15 phút Sau đó dựa vào đường kính vòng phân giải mà kết luận chủng xạ khuẩn có tạo enzyme phân giải hay không và chủng nào tốt nhất

3.3.4 Khảo sát khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn được bổ sung vào quá trình ủ cơ chất

Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của axít mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của axít yếu còn các chất khác thường đi kèm với cellulose như hemicellulose, lignin ít bền hơn đối với tác dụng của axít và kiềm, nên bị phân giải và tan vào dung dịch xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm

Hình 3.1 Phương pháp định lượng cellulose (Trương Thị Ngọc Hân, 2009)

Cách tính:

X(%) =

Với X : hàm lượng cellulose tính bằng %

3.3.4.2 Cách tiến hành bổ sung sinh khối xạ khuẩn

Sau khi chọn được chủng xạ khuẩn tốt nhất, tiến hành giữ giống và nhân sinh khối lên trong môi trường Gause lỏng: tinh bột tan 20 g, K2HPO4 0,5 g, MgSO4 0,5 g, NaCl 0,5 g, (NH4)2SO4 2 g, KNO3 0,5 g, FeSO4 0,01 g, nước cất vừa đủ 1 lít Khi sử dụng pha loãng 10 lần nhằm trộn đều với cơ chất

Thêm 50 ml nước cất, 9 ml NaOH 30%

Rửa 5 lấn với nước sôi

Rửa nhiều lấn với nước sôi cho đến khi nước trong

Thu lấy cặn, sấy khô đến trọng lượng không đổi

Đun 20 phút

( Trọng lượng sau khi sấy – trọng lượng giấy)*100

Trọng lượng mẫu

Định lượng cellulose có trong cơ chất thí nghiệm chưa xử lý Từ đó xác định tỉ lệ cellulose của nguyên liệu ban đầu Sau đó tiến hành xử lý cơ chất ban đầu:

 Mạt cưa: sau khi sàng bỏ dăm bào, gỗ vụn, lá cây… tiến hành trộn nước vôi đến 60% độ ẩm cơ chất Sau đó, tiến hành chia 2 phần bằng nhau, một phần phun dung dịch xạ khuẩn khoảng 1 lít/ 100 kg nguyên liệu, phần còn lại không phun để làm mẫu đối chứng Ủ trong 7 ngày, mỗi ngày đảo một lần

 Rơm: cắt khúc 6 – 8 cm, ngâm nước vôi làm ẩm, vớt ra để ráo, chia hai phần bằng nhau, một phần phun dung dịch xạ khuẩn khoảng 1 lít/100 kg nguyên liệu, phần còn lại không phun để làm mẫu đối chứng Ủ trong 7 ngày, mỗi ngày đảo một lần

 Mụn dừa: ngâm nước vôi trong 3 ngày, cách 12 giờ xả một lần, sau đó để ráo, chia hai phần bằng nhau, một phần phun dung dịch xạ khuẩn khoảng 1 lít/100 kg nguyên liệu, phần còn lại không phun để làm mẫu đối chứng Ủ trong 7 ngày, mỗi ngày đảo một lần

Sau thời gian ủ, tiến hành định lượng cellulose có trong cơ chất thí nghiệm

3.3.5 Khảo sát tốc độ lan tơ của nấm Linh Chi trên các cơ chất thí nghiệm

Sau thời gian ủ, nguyên liệu được trộn đều với nước có Urea 0,1%, DAP 0,2%,

(NH4)2SO4 0,2%, để đạt 65 - 70% độ ẩm cơ chất Cuối cùng trộn cám gạo 5% và

bắp xay 3,5%, cho vào bịch PP đạt trọng lượng 1,2 kg tức có 400 g cơ chất khô Hấp thanh trùng bằng hơi nước nóng cho đến khi đạt nhiệt độ 102 – 1050C, kéo dài thêm 5 tiếng Sau đó để nguội và cấy giống cọng vào Bịch sau khi cấy được đưa ra nhà ủ

Sau khi cấy giống, tơ trong bịch phôi sẽ lan từ trên đỉnh bịch phôi xuống đáy bịch Cứ sau 2 ngày, ta tiến hành đo độ dài tơ lan xuống Từ đó tính ra được tốc độ lan tơ trung bình của từng loại cơ chất

3.3.6 Khảo sát năng suất thu hoạch của nấm Linh Chi trên các cơ chất thí nghiệm 3.3.6.1 Đo đường kính và độ dày quả thể

Sau khi quả thể nấm Linh Chi ngừng sinh trưởng (khoảng 80 ngày từ ngày cấy

giống), tiến hành thu hái quả thể nấm Linh Chi đợt I Sau đó, đo đường kính và độ dày của quả thể Đường kính là nơi rộng nhất của quả thể nấm Linh Chi Để đo độ dày cần