NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb)

Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái tế bào thực vật khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro

TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(Polygonum multiflorum Thunb)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: PHẠM MINH TÂM Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07 năm 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro

TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(Polygonum multiflorum Thunb)

Tháng 07 năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học trường đại học Nông Lâm, là những người đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt bốn năm ngồi giảng đường Đại Học và đã tạo nhiều điều kiện học tập cho em

Em xin chân thành cảm ơn ThS Trịnh Thị Thanh Huyền đã hướng dẫn và tạo điều kiện cho em thực tập và hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp và em cũng rất biết ơn anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị Thu Hiền, Ngô Ngọc Tú, cùng toàn thể nhân viên của trung tâm và các bạn cùng thực tập ở trung tâm

Em chân thành cám ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khoá 34 đã giúp

đỡ em rất nhiều trong qua trình học tập và trong thời gian làm đề tài tốt nghiệp

Em rất chân thành cảm ơn thầy Lê Đình Đôn, thầy Nguyễn Tiến Thắng vì đã truyền cảm hứng và nhiệt huyết cho em khi theo đuổi con đường công nghệ sinh học Con xin chân thành gia đình đã tạo điều kiện giúp đỡ, luôn động viên và ủng hộ con hoàn thành tốt công việc học tập

Tháng 7 năm 2012 Phạm Minh Tâm

TÓM TẮT

Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) là một thảo dược quý chứa các

thành phần: emodin, chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside, Tanin…là một loại thuốc truyền thống ở Việt Nam, Trung Quốc Nhân giống hà thủ ô

đỏ in vitro tạo ra số lượng lớn cây trong thời gian ngắn giúp đáp ứng cho nhu cầu

alpha-SUMMARY

The title of thesis “Regenerate shoots form leaf Polygonum multiflorum

Thunb.”

Polygonum multiflorum Thunb is valuable herb containing components:

emodin, chrysophanol, rhein, physcion, proteins, starch, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside, Tanin…It is also

known as tradition medicine of China and VietNam Micropropagation of Polygonum

multiflorum Thunb in vitro produce large amounts of plants in a short time to respond

cultivation and other purposes

Contents of the study include shoot regeneration form leaf and the creation of whole trees for growing in nursery

Leaf of Polygonum multiflorum Thunb were grown in vitro on Murashige and

Skoog's (MS) basal medium containing different concentrations of naphthaleneacetic acid (NAA), andbenzyladenine (BA), thidiazuron (TDZ), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D) The leaf explants (93%) produced callus (0,419g)

alpha-on MS basal medium supplemented with 0,75 mg/l TDZ, 2.0 mg/l BA and 2,4D 0,5mg/l Therefor, the callus regenerated shoots on MS supplemented BA 4mg/l and Kinitin 1.5mg/l After four weeks, multiple shoots developed from the calli culture with average of 3,93 shoots per sample.The single shoots were propagated on MS supplemented 4 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), 0,25 mg/l NAA with average of 7,44 shoots per sample and rooted on MS supplemented with 0,5 mg/l NAA Finally, whole trees were grown in greenhouses on substrates (containing 50% coconut fiber and 50% rice husk ash) with 57% survive, average height of 5.27 cm and 4.41 is the average number of leaves on each plant

Key words: Polygonum multiflorum Thunb, in vitro, micropropagation…

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN 2

2.1Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ 2

2.1.1Phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm hình thái 2

2.1.3 Phân bố 2

2.1.4 Tác dụng dược lý 2

2.2Khái niệm nuôi cấy mô tế bào 3

2.2.2 Sự tạo mẫu cấy in vitro vô trùng 3

2.2.2 Sự tăng sinh tế bào có định hướng và tái sinh cây hoàn chỉnh 4

2.2.3 Nuôi trồng ngoài vườn ươm 4

2.2.4 Auxin và Cytokinin 5

2.2.4.1 Auxin 5

2.2.4.2 Cytokinin 6

2.2.5 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.5.1 Các chất khoáng 8

2.2.5.2 Nguồn Carbon (C) 8

2.2.5.3 Các vitamin 9

2.2.5.4 Các điều kiện vật lý trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.2.6 Những vấn đề trong nuôi cấy mô 10

2.2.6.1 Sự tạp nhiễm 10

2.2.6.2 Tính bất định về mặt di truyền 10

2.2.6.3 Sự phát sinh các chất độc trong quá trình nuôi cấy 11

2.2.6.4 Hiện tượng thủy tinh thể 11

2.3 Sự tạo sẹo từ mẫu lá và tái sinh chồi từ sẹo 12

2.3.1 Cấu tạo của lá 12

2.3.2 Khái niệm mô sẹo 12

2.3.3 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo 12

2.4 Các công trình nghiên cứu liên quan 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

3.1 Thời gian và địa điểm 14

3.2 Vật liệu 14

3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 14

3.2.2 Dung dịch khử trùng mẫu và môi trường cấy 14

3.3 Nội dung nghiên cứu 14

3.4 Phương pháp 15

3.4.1 Quy trình khử trùng mẫu lá 15

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cytokinin và Auxin lên sự tạo mô sẹo 16

3.4.3 Tái sinh chồi từ mô sẹo lá 17

3.4.4 Sự nhân cụm chồi 17

3.4.5 Sự tạo rễ 18

3.4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Thời gian và nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu cấy 20

4.2 Sự tạo mô sẹo 20

4.3 Sự tái sinh chồi từ sẹo 22

4.4 Sự nhân cụm chồi 24

4.5 Sự tạo rễ 26

4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm 27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA:N6 – benzyladenine

BAP:6-Benzylaminopurine

ĐC: đối chứng

MS:môi trường Murashige and Skoog (1962)

NAA:α – napthylacetic acid

TDZ:Thidiazuron ( N-phenyl-N-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)

NT: Nghiệm thức

2,4D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng javel

đến tỷ lệ sống của mẫu lá hà thủ ô đỏ 15

Bảng 3.2 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên khả năng tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hà thủ ô 16

Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinitin lên khả năng tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hà thủ ô 17

Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên khả năng tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hà thủ ô 18

Bảng 3.5 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng NAA lên sự tạo rễ 18

Bảng 3.6 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của giá thể cây lên sự sinh trưởng và phát triển của cây hà thủ ô đỏ 19

Bảng 4.1 Kết quả khử trùng 20

Bảng 4.2 Tỷ lệ phát sinh mô sẹo và khối lượng mô sẹo sau 40 ngày 21

Bảng 4.3 Kết quả tái sinh chồi từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy 23

Bảng 4.4 Kết quả nhân cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy 25

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của cây sau 30 ngày nuôi cấy 26

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng trên các loại giá thể sau 15 ngày 27

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hà thủ ô đỏ 2

Hình 2.2 Mô tả ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên tế bào thực vật nuôi cấy của Mauseth 7

Hình 2.3 Cấu tạo của lá 12

Hình 3.1 Quy trình khử trùng 15

Hình 4.1 Mô sẹo sau 50 ngày nuôi cấy môi trường N19 22

Hình 4.2 Mô sẹo sau 50 ngày nuôi cấy môi trường N13 22

Hình 4.3 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K6 23

Hình 4.4 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K4 23

Hình 4.5 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K2 24

Hình 4.6 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K5 24

Hình 4.7 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K6 24

Hình 4.8 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K3 24

Hình 4.9 Chồi sau cấy 25 ngày 25

Hình 4.10 Cụm chồi sau cấy 25 ngày trên môi trường V6 25

Hình 4.11 Rễ sau cấy 30 ngày 27

Hình 4.12 Cây con trồng trong 15 ngày……… 28

Hình 4.13 Cây con sau 15 ngày trồng trong H2 28

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) từ xa xưa đã được mệnh danh là

một loại thần dược với các sự tích và các câu tục ngữ do tính dược liệu quý của nó Do

đặc điểm dược liệu quý nên hà thủ ô đỏ bị khai thác quá mức và nằm trong sách đỏ

(Trần Ngọc Ninh, 2006), cần được bảo vệ Hiện nay hà thủ ô đỏ đang được quan tâm

và bảo vệ bởi nhiều cơ quan (Sở Khoa học Công nghệ Đồng Nai, Phú Yên …) và tiềm

năng trên thị trường rộng mở do tính dược liệu quý của nó giúp làm giảm nguy cơ tim

mạch, làm đen tóc, mọc tóc, có tính an thần, diệt khuẩn (Fnimh, 2001)

Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được nhân giống bằng cách giâm cành, trồng bằng

hạt (Đỗ Tất Lợi, 2005).Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối

cây hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt chậm, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm

cành tạo ra cây con có tuổi thọ ngắn Theo Lin (2003), các cây hà thủ ô đỏ nguồn gốc

in vitro cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên

Từ những nhận định trên, được sự đồng ý của bộ môn Công nghệ sinh học Đại

học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tôi thực hiện đề tài: Phát sinh chồi từ lá cây hà thủ ô

đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.)

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định phương pháp khử trùng mẫu lá hiệu quả

Theo dõi và ghi nhận sự xuất hiện mô sẹo và trọng lượng tươi mô sẹo

Theo dõi số mẫu phát sinh chồi và số chồi tái sinh

Theo dõi số chồi trong nhân cụm chồi

Theo dõi số rễ và chiều dài rễ

Theo dõi chiều cao và số lá phát triển khi trồng ngoài vườn ươm

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ, thời gian sửdung javel lên quá trình khử trùng

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên quá trình tạo sẹo

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin, auxin lên quá trình tái sinh chồi

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và Auxin lên sự nhân cụm chồi

Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên quá trình tạo rễ

Khảo sát ảnh hưởng của giá thể khi nuôi trồng cây ngoài vườn ươm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ

Chi (Genus) : Fallopia

Loài (Species): Fallopia multiflora

Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm Thân rễ phồng thành củ.Thân quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân Lá mọc so le, cuống dài Phiến lá hình tim, dài 4-8cm, rộng 2,5-5cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân Hoa tự chùm nhiều nhánh Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn) Bầu hoa

có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên (Đỗ Tất Lợi, 2005)

2.1.3 Phân bố

Trên thế giới Hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc Lào Ở Việt Nam chúng phân bố ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…(Đỗ Tất Lợi, 2005)

2.2.5 Tác dụng dược lý

Hà thủ ô có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol.Thuốc

Hình 2.1: Hà thủ ô đỏ

có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch.Tác dụng giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin (Fnimh, 2001)

Thuốc làm chậm nhịp tim Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và bảo vệ được cơ tim thiếu máu Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo mà giữ được mức như lúc chuột còn non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín (Trần Văn Kỳ, 2008)

Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm

Ngoài ra sử dụng hà thủ ô đỏ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng (Đoàn Thị Nhu, 2011)

Thành phần hoá học: Thân rễ hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside Tanin…(Fnimh, 2001)

2.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh

hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Trần Thị Dung, 2003).Kỹ thuật nuôi cấy mô bao gồm 3 bước cơ bản:

Tạo mẫu cấy in vitro vô trùng

Tăng sinh số lượng tế bào có định hướng và tạo cây hoàn chỉnh

Nuôi trồng thực nghiệm ngoài vườn ươm với điều kiện có kiểm soát

2.1.5 Sự tạo mẫu cấy in vitro vô trùng

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin…rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng Các dung dịch khử trùng thường dùng là

hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, javel… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo

vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm

là nấm và vi khuẩn (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2 Sự tăng sinh tế bào có định hướng và tái sinh cây hoàn chỉnh

Mục đích của giai đoạn này là nuôi cấy một cách định hướng các mô, tế bào, cơ quan sau khi được khử trùng tạo ra cây hoàn chỉnh gồm các bước: tái sinh mẫu nuôi cấy thành chồi, nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh (Đặng Thị Thanh Thúy, 2006)

Tái sinh mẫu nuôi cấy thành chồi: là giai đoạn tái sinh nguồn mẫu vật liệu nuôi cấy mô ban đầu như: đỉnh sinh trưởng, đốt thân, lá, hạt, tế bào đơn…một cách có định hướng, phát sinh trực tiếp hoặc gián tiếp ra chồi Quá trình này phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của mổi loài thực vật khác nhau mà lựa chọn phương pháp xử lý phù hợp nhưng mục đích cuối cùng đều là tạo chồi Các phương pháp xử lý được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ hai chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin có thể trực tiếp tạo thành chồi hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo, phôi

Nhân chồi: là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy mô vì quyết định năng suất bởi hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi là số chồi phát triển từ một chồi ban đầu sau một thời gian nuôi cấy Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, để tăng hệ số nhân chồi, ta thường bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellins), nước dừa, dịch chiết nấm men…

Tạo cây hoàn chỉnh: là giai đoạn phát sinh rễ cho chồi Khi đạt được kích thước nhất định, chồi sẽ được cấy sang môi trường tạo rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở gian đoạn này, ta có thể bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hormone thực vật có chức năng tạo rễ

2.2.3 Nuôi trồng ngoài vườn ươm

Sau khi hình hành rễ, cây con sẽ được chuyển sang môi trường nuôi trồng ngoài vườn ươm Giai đoạn này bao gồm sự di chuyển từ đặc điểm dị dưỡng (cần cung cấp đường) sang đặc điểm tự dưỡng (có khả năng quang hợp) và sự thích nghi của cây con mới tái sinh với môi trường ngoài ống nghiệm Giữ cho số cây con tiếp tục sinh trưởng

vô cùng quan trọng vì sự thích nghi với khí hậu và phát triển trong điều kiện tự dưỡng

là một sự thay đổi ngột có thể gây chết cây dẫn đến năng suất cả quá trình sẽ giảm

Những chồi non trong nuôi cấy in vitro có hình thái rất đặc biệt Kích thước lá

và số tế bào lá thấp hơn đáng kể so với cây ngoài tự nhiên Do độ ẩm cao trong ống nghiệm không phát triển lớp sáp bảo vệ với số lượng và chất lượng cần thiết Kết quả

là lá in vitro trong nuôi cấy khô rất nhanh khi chuyển ra môi trường tự nhiên

Xử lý vấn đề này bằng cách làm giảm từ từ độ ẩm trong môi trường nuôi cấy

mô dần dần đến mức độ ẩm môi trường nhà kính (Mai Xuân Lương, 2005)

2.2.4 Auxin và Cytokinin (Davies, 1995)

2.2.4.1 Auxin

Đây là loại phytohocmon đầu tiên và quan trọng nhất trong cây được phát hiện năm 1934 Con người đã tổng hợp được nhiều chất có bản chất rất khác nhau có hoạt tính sinh lý tương tự như auxin tự nhiên quan trọng nhất của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) Các auxin nhân tạo thường được sử dụng như: IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T

Các dạng auxin trong cây:

Auxin tự do: là dạng có hoạt tính sinh học Chúng tồn tại chủ yếu ở đỉnh ngọn giảm dần nồng độ ở chồi bên đến đầu rễ và các cơ quan còn non Càng xa đỉnh sinh trưởng nồng độ auxin tự do càng giảm dần

Auxin liên kết: là dạng auxin chủ yếu trong cây Hàm lượng có thể lên đến 90% lượng auxin có trong cây IAA có thể liên kết với rất nhiều các hợp chất nên chúng không có hoạt tính sinh học hoặc có nhưng rất thấp Nó có thể liên kết với các đường, với các axit amin và amit tạo nên auxin liên kết như: IAA-glucosid; IAA-glucan; indol

axetatamit …Chức năng auxin liên kết: Là nguồn dự trữ auxin cho cây, liên kết các

đường, axit amin và các chất khác làm tăng độ bền cho auxin

Sự biến đổi thuận nghịch của IAA tự do và IAA liên kết bị ảnh hưởng dưới tác nhân kích thích của môi trường, góp phần điều khiển sự cân bằng auxin trong cây và

do đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây

Sự vận chuyển auxin trong cây:

Auxin được tổng hợp ở đỉnh ngọn và được vận chuyển xuống các cơ quan phía dưới với tốc độ vận chuyển khoảng 1cm/giờ ở rễ và thân

Sự tổng hợp auxin trong cây:

Cơ quan tổng hợp auxin là đỉnh sinh trưởng ngọn Sau đó auxin được vận chuyển xuống phía dưới Ngoài ra còn có 1 lượng ít auxin được tổng hợp ở: lá non,

chồi non, quả đang lớn, rễ non Chất tiền thân tổng hợp auxin là amin tryptophan

Sự phân hủy auxin:

Sự phân hủy auxin xảy ra khi có sự dư thừa do tổng hợp quá nhiều auxin trong cây bằng con đường oxi hóa bằng enzym IAA-oxidaza có nhiều ở rễ, ngoài ra sự mất hoạt tính của auxin do ánh sáng tử ngoại

Ảnh hưỡng sinh lý của auxin đối với thực vật:

Sự phát triển phôi (development of embryo)

Sự hình thành lá (leaf formation)

Hướng động ánh sáng (phototropism)

Hướng động với lực hút của trái đất (gravitropism)

Hiện tượng ưu thế ngọn(apical dominace)

Sự phát triển trái (fruit development)

Sự rụng lá và trái (abscission)

Kích hoạt tạo và phát triển rể (root initiation and development)

Hiệu ứng tránh bóng (the shade-avoidance effect)

2.2.4.2 Cytokinin

Là loại phytohormon quan trọng và xuất hiện trong tất cả các loài thực vật trên thế giới Một số cytokinin quan trọng: Adenin, Kinetin, Zeatin riboside, Isopentenyl adenosine (IPA), Benzyl adenine, Zeatin

Các dạng cytokinin:

Cytokinin có thể tồn tại dưới dạng tự do có hoạt tính sinh học và dạng liên kết

có hoạt tính hay có hoạt tính yếu hơn và chúng cũng có thế chuyển hóa thuận nghịch cho nhau Chúng có thể liên kết với các đường để tạo nên các glucosid Ngoài ra cytokinin có mặt trong ARNvận chuyển cho: xerin, phenyl alanin…

Cytokinin có thể bị phân hủy sau khi biểu hiện hoạt tính của mình cũng như cần thiết phải giảm nồng độ trong cây khi hàm lượng của chúng quá cao Sự phân hủy chủ yếu nhờ hệ thống enzym đặc hiệu và sản phẩm cuối cùng là urê

Sự tổng hợp cytokinin:Cơ quan tổng hợp cytokinin trong cây là hệ thống rễ Từ

rễ, cytokinin được vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất

Ảnh hưỡng sinh lý của cytokinin đến thực vật:

Cytokinin và sự phân chia tế bào: Hiệu quả đặc trưng của cytokinin là hoạt hóa

sự phân chia tế bào (stilmulate cell division)

Cytokinin và sự giãn của tế bào: Khi có sự tác động tương hỗ với IAA và GA thì cytokinin có khả năng làm tăng kích thước tế bào (cell enlargement)

Cytokinin có vai trò rất quan trọng trong sự phân hóa chồi và điều chỉnh ưu thế ngọn, cytokinin giải phóng chồi bên khỏi trạng thái ức chế của chồi ngọn (Stimulates the growth of lateral buds-release of apical dominance)

Kích thích tạo chồi (shoot initiation/bud formation)

Có thể tăng sự mở khí khổng ở một số loài (enhance stomatal opening)

Thúc đẩy sự chuyển hóa lạp thể ớm (etioplast) thành lục lạp

Cytokinin cũng ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt, trong một số trường hợp nhất định cytokinin có tác dụng kích thích sự nảy mầm, phá sự ngủ nghỉ như GA

2

Hình2.2 Mô tả sự ảnh hưởng của cytokinin va auxin lên tế bào thực vật nuôi cấy của

Mauseth 1995

2.2.5 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sự thành công hay thất bại nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường nuôi cấy có hoặc không có hormone thực vật

Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy là MS (Murashige và Skoog,1962), B5 (Gamborg cs 1968), hoặc White (1963)

2.2.5.1 Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng.Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô

và tế bào thực vật Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác.Canxi và acid boric được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học Muối khoáng còn đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật (Mai Xuân Lương, 2005)

Trong môi trường, các muối khoáng chia thành nhóm vi lượng và đa lượng:

- Các nguyên tố đa lượng gồm 6 nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N và K

- Các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl, Al

Nhu cầu của cây đối với các nguyên tố vi lượng là rất thấp Do vậy những nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng Một số các nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như: agar, các chất bổ sung như nước dừa, các muối và nước Hầu hết các nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là quan trọng, còn vai trò của các anion có thể là không cần thiết Ion

SO4 dư thừa trong môi trường và chủ yếu phát sinh từ các muối MgSO4, K2SO4

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nhìn chung cả phần anion và cation của các nguyên tố đa lượng đều quan trọng đối với tế bào thực vật Ví dụ như KNO3, cả K+ và NO3 là cần thiết trong nhóm các nguyên tố

đa lượng, các muối có chứa nitơ chủ yếu ở dạng kali nitrat, amonium hoặc calxi nitrat 2.2.5.2 Nguồn carbon (C)

Đường sucrose (saccharose) là nguồn carbon chủ yếu và được sử dụng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp Khi hấp khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi

hơn cho cây hấp thụ Trong một số trường hợp, như nuôi cấy mô cây một lá mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loài đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật

2.2.5.3 Các vitamin

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin

Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxin HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin B6) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy

Vitamin ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác

nhau là khác nhau hoặc thậm chí còn có hại (gây độc) (Mai Xuân Lương, 2005)

2.2.5.4.Các điều kiện vật lý trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ánh sáng: cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy Trong tạo chồi ban

đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1000 lux Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3000 - 10000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp Có

nhiều nghiên cứu về nguồn ánh sáng nhân tạo mới trong hệ thống nuôi cấy in vitro đã chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng thích hợp cho cây in vitro phát triển tốt

Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy và 6 tuần tập cho cây con quen với điều kiện trong

nhà lưới đã cho thấy cây in vitro được nuôi cấy với hệ thống đèn Compact 3U thì có

biểu hiện sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với cây dưới hệ thống đèn neon (Dương Tấn Nhựt, Mai Thị Ngọc Hương, 2006) Bên cạnh đó, việc thay thế đèn Neon bằng

đèn Compact 3U trong phòng nuôi cấy mô đã giảm giá thành cây giống và chi phí sản xuất đồng thời tiết kiệm được điện năng

Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và

có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường giữ ở 25 – 280 C

Độ pH môi trường: pH của môi trường thường ở khoảng 5,7 - 5,8 pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Agar: Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm

và sẽchết vì thiếu oxy Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar, một loại tinh bột được chế biến từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 - 1%

2.2.6 Những vấn đề trong nuôi cấy mô

2.2.6.1 Sự tạp nhiễm

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy Một số nguồn gây tạp nhiễm như

từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết

bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy

Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều

Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy.Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng Các loài nấm thường

gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra

2.2.6.2 Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo những biến dị tế bào qua nuôi cấy

mô sẹo.Những biến dị này là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng

có rất ít biến dị có lợi được báo cáo.Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish và Karp 1986) Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số

lần cấy chuyền Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988).Số lần cấy chuyền

ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị

2.2.6.3 Sự phát sinh các chất độc trong quá trình nuôi cấy

Trong quá trình nuôi cấy mô, hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu thường làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aeridesvới

nồng độ thường dùng 0,1-0,3% Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol

Để hạn chế ảnh hưởng phenol cómột số kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:

-Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

-Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

-Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

-Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần

2.2.6.4 Hiện tƣợng thủy tinh thể

Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Để hạn chế quá trình thủy tinh thể, ta sẽ sử dụng phương pháp: làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy, tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp

2.3 Sự tạo sẹo từ mẫu lá và tái sinh chồi từ sẹo

2.3.1 Cấu tạo của lá

Hình 2.3 Cấu tạo của lá

Khi vô mẫu lá từ tự nhiên được cắt 4 cạnh để cảm ứng với auxin và cytokinin

Lá khi được cấy vào môi trường chứa auxin và cytokinin được đặt úp xuống (mặt chứa khí khổng ở trên) nuôi cấy trong điều kiện tối Dưới tác dụng auxin và cytokinin, tế bào lá sẽ phản phân hóa và cho ra khối tế bào không tổ chức (mô sẹo)

2.3.2 Khái niệm về mô sẹo (callus)

Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới điều kiện đặc biệt Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin và cytokinin cho ra mô sẹo Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào thượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000) 2.3.3 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo

Quá trình hình thành cơ quan trong mô xảy ra qua 2 giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là tái phân hóa hình thành mô sẹo Giai đoạn thứ 2 hình thành thành các mầm mống cơ quan, tế bào có hiện tượng tổng hợp DNA và protein xảy ra mạnh, hàm lượng đường tăng, các mô sẹo không có tổ chức hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến việc tạo chồi, rễ Quá trình phân hóa này được thực hiện bằng cách bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin Trong đó cytokinin có đặc tính sinh lý kích thích tạo chồi nên thường được sử dụng riêng lẽ hoặc có thể kết hợp với auxin nồng độ thấp hơn để bổ sung vào môi trường cấy chuyền sẹo (Mai Xuân Hương, 2005)

Khả năng tạo chồi cũng bị ảnh hưỡng bởi tính chất của mô sẹo Loại mô sẹo cho khả năng tái sinh cơ quan tốt là mô sẹo cứng, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ (Vũ Văn Vụ, 1999) Ngoài ra, khi mô sẹo cấy chuyền nhiều lần sẽ làm giảm

xu thế tạo cơ quan vì cấy chuyền nhiều lần mô sẹo hình thành các tế bào đa bội, lệch bội và có thể mất các yếu tố di truyền

2.4 Các công trình nghiên cứu liên quan

Trên thế giới, năm 2003 Li Chang Lin và cộng tác viên đã xây dựng một quy trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây được nhân giống với cây trồng tự nhiên Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại

Ở trong nước, năm 2004 Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây

hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro và tiếp đó là các công trình nghiên cứu liên quan

như: sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan San và

Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009 Ngoài ra các nghiên cứu trong nước khác cũng

nghiên cứu về về nhân giống in vitro của Trần Thị Kim Thu năm 2008 hay Hoàng Thị

Kim Hồng vào năm 2011 Tất cả nghiên cứu trên đều có đóng góp quan trọng cho việc nhân nhanh cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm đuợc thực hiện từ tháng 1- 2012 đến tháng 7- 2012 tại Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Sở khoa học công nghệ tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu

Mẫu nuôi cấy được lấy tại vườn của Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Sở khoa học công nghệ Đồng Nai

3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị sử dụng bao gồm: Nồi hấp khử trùng, tủ cấy, máy cất nước, máy đo

pH, cân tiểu ly, máy lạnh, máy điều hòa, máy lắc

Dụng cụ sử dụng: Chai thủy tinh, ống nghiệm, ben, kẹp, đèn cồn, pipet, ống đong, ống hút, bình tam giác, cốc thủy tinh, đũa khuấy

Ngoài ra để có một cơ sở nuôi cấy mô hoàn chỉnh cần có các phòng riêng biệt:

Hệ thống phòng cấy là phòng nuôi cấy có kiểm sóat luồng không khí, không để

sự tạp nhiễm xảy ra Phòng phải kín và trang bị máy lạnh để tránh nhiệt độ nóng ảnh huỡng đến năng suất làm việc của con người

Hệ thống phòng nuôi: là hệ thống phòng có kểm soát nhiệt độ và độ chiếu sáng

ổn định, và có nhiều kệ để tăng diện tích Ánh sáng đuợc kiểm soát theo quang kì của cây và tắt theo hệ thống điện tự động

Hệ thống phòng rữa chai lọ cách biệt là hệ thống phòng dùng để rữa chai lọ và pha môi truờng và làm các việc lặt vặt Do công việc pha môi truờng thuờng làm vuơng vãi dung dịch dinh duỡng nên nồng độ vi sinh vật trong không khí rất cao, cần được lau chùi, khử trùng thường xuyên

Hệ thống nhà kính sẽ đuợc giảm cuờng độ ánh sáng bằng luới lan và cách ly côn trùng, sâu hại, và được trang bị hệ thống tưới phun sương

3.2.2 Dung dịch khử trùng mẫu và môi trường cấy

Dung dịch khử trùng mẫu: Cồn 700, javel, thuốc diệt nấm, kháng sinh

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS của Murashige và Skoog (1962) Các chất điều hòa sinh trưởng Auxin và Cytokinin

3.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ, thời gian sử dung của javel lên quá trình khử trùng

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên quá trình tạo sẹo

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin, auxin lên quá trình tái sinh chồi

Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và Auxin lên sự nhân cụm chồi

Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên quá trình tạo rễ

Khảo sát ảnh hưởng của giá thể khi nuôi trồng cây ngoài vườn ươm

Hình 3.1 Quy trình khử trùng (Thuốc diệt nấm 10 ml/l; kháng sinh 500mg/l)

Để tối ưu hóa quy trình mẫu lá sẽ được khử trùng với các nồng độ javel và thời gian thay đổi như bảng 3.1

Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng javel đến tỷ lệ sống của mẫu lá hà thủ ô đỏ

Nghiệm thức Nồng độ javel Thời gian khử trùng

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống trên tổng số mẫu

Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại

Lắc thuốc diệt

nấm 30 phút Lắc kháng sinh 1 giờ Lắc javel Lắc cồn 70

o 1 phút

Mẫu lá sau khi khử trùng được nuôi cấy trong môi trường: khoáng MS + 10g agar/l+ 3% sucrose + nồng độ Auxin và Cytokinin thay đổi

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cytokinin và Auxin lên sự tạo mô sẹo

Mẫu lá hà thủ ô đỏ sẽ được cấy vào các môi trường MS 10g agar/l + 3% sucrosechứa Cytokinin và Auxin

Mẫu cấy vào môi trường sẽ được nuôi trong điều kiện tối

Bảng 3.2 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên khả năng

tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hà thủ ô đỏ

Thí nghiệm nhiều yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 20 nghiệm thức với 3 lần lặp lại

3.4.3 Tái sinh chồi từ mô sẹo lá

Mô sẹo từ các mẫu lá của cây hà thủ ô đỏ trên môi trường tạo sẹo được cấy chuyền sang môi trường cảm ứng sinh chồi Các môi trường cảm ứng tạo chồi MS 10g agar/l + 3% sucrose với nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thay đổi như sau:

Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinintin lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây hà thủ ô đỏ

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi phát sinh từ mô sẹo

Thí nghiệm nhiều yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức với 3 lần lặp lại

3.4.4 Sự nhân cụm chồi

Mẫu chồi khi tái sinh được chuyển qua môi trường thích hợp nhằm tăng số chồi trong một chồi ban đầu Mẫu còn non và chứa nhiều dinh dưỡng, có nhu mô phân sinh cho khả năng tạo chồi cao được nuôi cấy trong môi trường: khoáng MS + 10g agar/l+ 3% sucrose + nồng độ Auxin và Cytokinin thay đổi: