NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒ ĐIỆP Phalaenopsis TỪ HẠT

2.2.2 Nhân giống in vitro lan Hồ Điệp được trình bày ở mục 2.3.6 2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 2.3.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật 2.3.1.1 Khái niệm Nuôi cấy mô thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HỒ ĐIỆP Phalaenopsis TỪ HẠT

Sinh viên thực hiên: BÙI HÀ ANH THƯ Ngành: Nông Học

Niên khóa: 2005 – 2009

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2009

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HỒ ĐIỆP Phalaenopsis TỪ HẠT

Tác giả:

BÙI HÀ ANH THƯ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông Học

Hướng dẫn:

PGS.TS PHAN THANH KIẾM Ths NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

Tháng 07/2009

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

Thầy Phan Thanh Kiếm, bộ môn Di truyền - Giống, khoa Nông học, Đại học Nông Lâm đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn tôi thực hiện đề tài Đồng cảm ơn chị Nguyễn Thị Thanh Huyền phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng, Viện Khoa học

Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tâm hướng dẫn và trực tiếp giúp đỡ tôi tiến hành và hoàn thành tốt đề tài

Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa nông học, Bộ môn Di truyền – Giống, các thầy cô giáo đã truyền đạt kiến thức, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Thầy Đỗ Khắc Thịnh và các chị phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã luôn quan tâm giúp đỡ và tạo môi trường thân thiện và tốt nhất cho em cũng như cho đề tài tốt nghiệp của em

Những bạn bè, người thân đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng, đặc biệt con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và gia đình đã sinh thành, nuôi dưỡng, lo lắng, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập và hoàn thành luận văn này

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro Lan Hồ Điệp

Phalaenopsis từ hạt” được thực hiện tại Phòng Di truyền và Chọn giống cây trồng,

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam từ 2/2009 đến 7/2009 nhằm: Tìm hiểu nồng độ hóa chất khử trùng và thời gian xử lý quả, tìm hiểu môi trường gieo hạt, môi trường cấy chuyền và môi trường ra rễ

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại

Kết quả đạt được:

1 Công thức khử trùng quả lan thích hợp, giảm thiểu tỷ lệ nhiễm nấm, nhiễm khuẩn để làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt: 100% Javel +10 phút hoặc 100% Javel +15 phút

2 Môi trường gieo hạt thích hợp: MS (40 g/l sucrose) + 100 ml/l YE

3 Môi trường cấy chuyền thích hợp: MS + 0 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA hoặc

MS + 0,1mg/l BA + 0,1 mg/l NAA

4 Môi trường thích hợp cho sự ra rễ: MS + 0,1 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA

5 Trong 3 giống (38/42, 25/26, 26/32) giống 26/32 cho sự nảy mầm và sinh trưởng tốt nhất ở tất cả các thí nghiệm

2.3.5 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng và dịch chiết hữu cơ

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 23

4.1 Nghiên cứu tìm hiểu thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp

4.3.1 Tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi của các giống Hồ Điệp lai 34 4.3.2 Tác động của BA, NAA lên sự hình thành số lá của các giống Hồ

4.3.3 Tác động của BA, NAA lên kích thước lá của các giống Hồ Điệp lai 38 4.3.4 Tác động của BA, NAA lên chiều cao cây của các giống Hồ Điệp lai 42 4.3.5 Tác động của BA, NAA lên chiều ngang cây chiếm chỗ của các

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm (%) của các nghiệm thức khử trùng sau 7 ngày 30 Bảng 4.2: Kết quả số lượng hạt nảy mầm (mầm) ở 30, 45, 60 ngày sau gieo 32 Bảng 4.3: Tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi ở 45, 60, 75 NSC 35 Bảng 4.4: Tác động của BA, NAA lên sự hình thành số lá ở 45, 60, 75 NSC 37 Bảng 4.5: Tác động của BA, NAA lên chiều dài lá ở 45, 60, 75 NSC 39 Bảng 4.6: Tác động của BA, NAA lên chiều rộng lá ở 45, 60, 75 NSC 41 Bảng 4.7: Tác động của BA, NAA lên chiều cao cây ở 45, 60, 75 NSC 43 Bảng 4.8: Tác động của BA, NAA lên chiều ngang cây chiếm chỗ ở 45, 60, 75 NSC 45 Bảng 4.9: Tác động của môi trường lên sự hình thành số rễ của các nghiệm

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của môi trường lên sự hình thành chiều dài rễ ở 20,

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hoa lan có thể thấy ở khắp nơi, trong vườn nhà hay ở công sở, trong công viên hay ở các quán cà phê, trên phim ảnh, truyền hình hay trong các tạp chí, cho thấy loại hoa này được con người ưa chuộng Vì có tính thẩm mỹ cao, hoa lan đã trở thành mặt hàng có giá trị kinh tế và đang được sản xuất khá phổ biến

Hiện nay, ở nước ta việc nhân giống lan vẫn chưa phát triển mạnh, chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước Các giống hoa lan nhập nội từ Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan và nhiều nước khác đang được tiêu thụ trên thị trường hoa trong nước Đó là vấn

đề mà những nhà nghiên cứu và sản xuất hoa kiểng nước ta cần phải quan tâm

Hơn nữa, những người thưởng thức hoa thường ưa thích những cây hoa đẹp, độc đáo Và, do vậy bên cạnh phải tạo ra số lượng lớn các loại lan hiện có, các nhà nghiên cứu phải tiếp tục lai tạo để tạo ra một thị trường lan phong phú, trong đó có nhiều loại lan đẹp, mới lạ đáp ứng được thị hiếu của nhiều người Đó cũng là tiền đề

để tăng nguồn lợi kinh tế từ ngành trồng hoa Việc duy trì và phát triển các loài lan hiện có, đồng thời tạo ra những giống cây Lan lai sẽ góp phần tạo ra sự đa dạng của các loài hoa Lan, chống lại sự “xói mòn di truyền” đang diễn ra trong tự nhiên

Lan Hồ Điệp Phalaenopsis là loại hoa lan có hoa lớn, đẹp, độ bền hoa cao, được nhiều người ưa chuộng nên cần quan tâm phát triển Do hạt lan Hồ Điệp không chứa abumin và có phôi chưa phân hóa, nên trong tự nhiên rất khó nảy mầm Để tạo ra lan

Hồ Điệp lai, bên cạnh những khó khăn trong việc thụ phấn nhân tạo để tạo hạt lai cần phải nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp cho lan Hồ Điệp lai

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

môi trường nhân giống in vitro lan Hồ Điệp Phalaenopsis từ hạt”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu:

Đề tài nhằm xác định:

- Công thức khử trùng quả lan thích hợp, giảm thiểu tỷ lệ nhiễm nấm, nhiễm khuẩn để làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt

- Môi trường gieo hạt thích hợp

- Môi trường nhân và môi trường cấy chuyền thích hợp

- Môi trường thích hợp cho sự ra rễ

1.2.3 Yêu cầu

Bố trí thí nghiệm và theo dõi các chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, số lượng hạt nảy mầm/trái, số chồi, số lá, chiều rộng lá, chiều dài lá, chiều cao cây, chiều ngang cây chiếm chỗ, số rễ, chiều dài rễ để tìm ra công thức môi trường thích hợp nhằm nhân

giống lan bằng phương pháp gieo hạt in vitro Đồng thời bước đầu nghiên cứu sự

tương tác giữa yếu tố giống và 2 chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan Hồ Điệp Phalaenopsis

có 2 phiến dài, hẹp và có dĩa, những bộ phận phụ có dạng thay đổi: trụ bán nguyệt dày

ở bên trên, thẳng hay hơi cong

Ở Việt Nam, người ta đã ghi nhận có 6 loài Hồ Điệp rừng tự nhiên:

1- Phalaenopsis mannii Rchob F (Hồ Điệp Ấn) xuất hiện dọc từ Quảng Trị lên

tới Tây Nguyên

2- Phalaeopsis gibbosa Sweet (Hồ Điệp Trung) xuất hiện ở Hòa Bình, Hà

Giang, Tuyên Quang, Hà Tây và Đà Lạt

3- Phalaenopsis lobbii Rchob F (Hồ Điệp Cúc Phương) có ở rừng Cúc Phương

2.1.2 Đặc điểm thực vật học

2.1.2.1 Thân

Thân hoa lan được cấu tạo theo 2 hình thức đơn thân hoặc hợp thân

Hồ Điệp thuộc loại lan đơn thân Đơn thân là loại cây không có thân rễ hoặc mầm giả và phát triển từ một ngọn độc nhất Thân phát triển không giới hạn, cắt ngang thân ở bên trên thì cây vẫn tiếp tục phát triển

Thuộc nhóm phụ Sarcanthinae ở nhóm này lá được xếp thành hai hàng đối

nhau, lá trên một hàng xen kẽ với lá của hàng kia Phalaenopsis thì thân ngắn và lá trở nên dày đặc

2.1.3 Yêu câu sinh thái

Nhiệt độ: lan Hồ Điệp là loại lan chịu nóng, cây phát triển trong tự nhiên ở nhiệt

độ ngày là 28 - 35 oC, đêm: 20 - 24 oC Nhiệt độ tối hảo nằm trong khoảng 25 - 27 0C

Ẩm độ: 60 - 70 %

Ánh sáng: 20 - 30 %

2.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc

Chuẩn bị cây con: Tiêu chuẩn cây con:

- Khỏe mạnh, cao 4 - 5 cm, có 3 - 4 lá dày, xanh bóng,

- Rễ trắng, to,

- Có nguồn gốc rõ ràng

Lấy cây ra khỏi chai: dùng que móc từng cây từ phần gốc, tránh làm dập lá và gãy rễ Rửa cây con cẩn thận cho sạch agar, xếp đứng vào rổ, trồng ngay Tuy nhiên, đối với lan Hồ Điệp, kinh nghiệm của một số nhà vườn cho biết nếu để cây trong khay 1- 2 ngày với điều kiện đủ ẩm rồi đem ra trồng thì tỷ lệ sống cao hơn

Chuẩn bị giá thể

Giá thể tốt nhất đối với Hồ Điệp là dớn trắng, ngoài ra ta có thể sử dụng sơ dừa, than, mạc cưa, vỏ đậu phụng …

Cách trồng

Chọn chậu có lỗ 2 bên và ở đáy chậu Cũng có thể trồng cây con trong khay

nhựa hoặc khay gỗ

Xé xơ dừa quấn quanh rễ rồi đặt vào chậu Hoặc có thể sử dụng than bên dưới

và dớn bên trên để làm giá thể trồng Hồ Điệp

Ban đầu ta có thể trồng nhiều cây trong một chậu sau đó tách ra hoặc có thể trồng trong khay sau đó tách và trồng vào chậu Mùa trồng tốt nhất là cuối mùa mưa

Chăm sóc

Trồng Hồ Điệp phải đảm bảo đúng điều kiện theo nhu cầu sinh thái của cây Hồ Điệp chỉ thích nghi với cường độ ánh nắng 20 - 30 %, lại không chịu được nước nhỏ giọt lên trên lá và như thế rất dễ bị bệnh thối nhũn cây nên cần thiết phải làm dàn che nắng, che mưa, che ánh sáng Từ khi cây được lấy từ trong chai ra trồng cho đến khi

nở hoa, Hồ Điệp đòi hỏi phải thay chậu từ 2 - 3 lần

Tưới nước

Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, phần lớn nước được dự trữ ở lá nhưng diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm

Mùa nắng: tưới phun 2 - 3 lần /ngày

Mùa mưa: nếu mưa suốt ngày thì không tưới, mưa lất phất tưới 1lần, không mưa tưới 2 lần

Bón phân

Bón loại phân vô cơ hỗn hợp NPK:

- 30 - 10 - 10: dùng cho cây con

- 18 - 18 - 18 hoặc 20 – 20 - 20 cho cây trung bình và cây lớn

- 10 - 30 - 30 hoặc 10 - 20 - 30 cho cây sắp ra hoa và ra hoa

2.2 Tổng quan về nhân giống lan Hồ Điệp

2.2.1 Nhân giống truyền thống

2.2.1.1 Nhân giống bằng phương pháp cơ học

Đây là phương pháp dễ dàng nhất Khi cây đạt một kích thước mong muốn, ta cắt ngọn với một ít rễ đem trồng vào chậu mới, phần gốc còn lại sau một thời gian sẽ mọc lên vài chồi nữa Cây phải được cắt bằng kéo cắt cành đã được khử trùng và sau

đó phải trét vadơlin có trộn Zineb, sơn, hoặc vôi vào vết cắt để tránh sự nhiễm trùng và làm những bước tiếp theo như thay chậu Một phương pháp khác được đề cập đến, tuy đơn giản nhưng có hiệu quả hơn Dây đồng là dụng cụ duy nhất dùng cho công tác này, được buộc vào thân cây và xiết chặt, mạch dẫn nhựa bị ức chế là nguyên nhân tạo

sự kích thích cây mọc chồi mới Khi chồi nhú ra khỏi thân, ta gỡ dây đồng ra, cây con

sẽ lớn dần Tốt nhất là đợi cây con phát triển thành thục và mọc rễ ta sẽ cắt cây con lìa khỏi thân cây mẹ Với phương pháp này ta sẽ có cây con mới nhưng sức khỏe cây mẹ vẫn bình thường, cây không bị "xốc" bảo đảm sự ra hoa trong mùa kế tiếp

2.2.1.2 Nhân giống bằng phương pháp sử dụng kích thích tố

Một vài loại kích thích tố được dùng có hiệu quả rõ rệt và nhanh chóng đối với

sự mọc chồi của các loài lan Hồ Điệp Với dung dịch kích thích tố pha sẵn phun sương vào lá và rễ , chỉ 1 tháng sau có dấu hiệu của sự mọc chồi Có thể phun 2 lần cách nhau 5 ngày sẽ có kết quả chắc chắn Kích thích tố thường được dùng là Cytokinin, với nồng độ 5 ppm

2.2.1.3 Nhân giống bằng phương pháp tạo cây con trên trục phát hoa cũ

Ở phương pháp tạo cây con trên phát hoa cũ (Phương pháp Griesbacil), sau khi cây Hồ Điệp trổ hoa xong, cắt bỏ phần ngọn của phát hoa chỉ chừa lại 3 - 4 mắt phía gốc rồi bôi Ianohn có trộn 50 mg/ml acid Cinnamic + 5 mg/ml 6- Benzyl amino-purine Sau 4 - 8 tuần lễ, cây con sẽ mọc ở vị trí mỗi mắt và rễ sẽ tạo lập khi cây con lớn dần Lúc này có thể cắt bỏ phát hoa và đem cây con trồng trong chậu

Hình 2.2: Cây con hình thành từ phát hoa

(nguồn: Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam)

2.2.2 Nhân giống in vitro lan Hồ Điệp (được trình bày ở mục 2.3.6)

2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật

2.3.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật

2.3.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả phương

thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa các môi trường xác định

ở điều kiện vô trùng Trong môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormones tăng trưởng và đường

2.3.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thế giới

Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật Ông viết:

“Để kết luận, tôi tin tưởng rằng tôi đã không đưa ra một tiên đoán quá táo bạo nếu cho rằng bằng cách nuôi cấy, người ta có khả năng tạo thành công các phôi nhân tạo từ các

tế bào soma” Nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại là vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White (người Mỹ), nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua

(Lycopersicum esculentum) Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy

mô tế bào tượng tầng một số cây gỗ và xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của acid – β – Indolacetic acid (IAA) và nhóm ba vitamin B do White đề nghị: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4-D và

Kinetin cùng với phát hiện vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong gian đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật

Năm 1954, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ

lệ Cytokinin/Auxin Nếu tỷ lệ Cytokinin/Auxin thấp ảnh hưởng đến rễ và ngược lại nếu tỷ lệ này cao sẽ kích thích tạo chồi ở mô sẹo Thành công của Skoog và Miller dẫn đến những phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba cho lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong thời gian từ năm 1945 đến 1954, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn (các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác) đã được phát triển Nuir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc trên máy lắc

Năm 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu

(Phaseolus vulgaris)

Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng mới

Năm 1960, Morel đã nhận thấy các đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan

(Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các Protocorm Khi chia cắt các

Protocorm và nuôi cấy tiếp thì được các Protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì Protocorm có thể phát triển thành cây lan con Morel có thể phục tráng tạo các dòng vô tính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Cũng trong năm 1960, Bergman công bố có thể sử dụng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có các tế bào dính cụm Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh dược tính toàn năng của tế bào thực vật

Sau đó, Cooking ở trường đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là Protoplast

Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của Protoplast vào đầu những năm 1970, khi tác giả Nhật Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các Protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng, các Protolast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô đặt hy vọng vào kỹ thuật này để nhân giống có kết quả hơn

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xứớng việc biến tính của tế bào thực vật Ông cho rằng các tế bào, thậm chí các hạt giống thực vật, đều có khả năng hấp thu AND ngoại lai vào trong tế bào

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy

túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia) Từ đó người ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật

nuôi cấy túi phấn

Năm 1967, nhóm Bourgin và Nisch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở nhiều loại cây trồng

Từ năm 1980 đến 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố Nhờ các plasmid, phân tử AND vòng thường có trong các

tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định và đã thực hiện thành công

Ngoài phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn, còn có các phương pháp chuyển gene khác như: kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (micro injection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả tốt

Chúng ta đang bắt đầu giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu

lý luận di truyền bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô, tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn carbon của chúng Các kỹ thuật để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các biện pháp khác của chương trình là tiền đề được chuẩn bị trong các giai đoạn trước

Việt Nam

Sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học,

Viện Khoa Học Việt Nam khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và Protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv., 1978; Lê Thị Xuân và ctv., 1978) Tiếp đó là thành công nuôi cấy Protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981) Tiếp theo là phân viện Khoa Học Việt Nam ở TPHCM, sau đó ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, và Viện Khoa Học

Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam và các phòng thí nghiệp nuôi cấy mô tế bào cũng được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay chúng ta đã

có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện

Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung Ương,…), mà có cả ở một số tỉnh và cơ

sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ,…)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv., 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv., 1994; Định Thị Tòng và ctv., 1994) Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành

và ctv., 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv., 1995; Bùi Bá Bổng, 1995)

2.3.2 Các phương pháp nhân giống in vitro

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên

Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát

triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh

Ứng dụng:

- Phục tráng giống;

- Nhân giống in vitro;

- Tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin;

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, phát triển nhanh trên môi trường giàu auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Ứng dụng:

- Nhân giống in vitro các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông

qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng;

- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học;

- Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào;

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

Nuôi cấy tế bào đơn

Các tế bào đơn tách từ mô thực vật bằng phương pháp nghiền hoặc xử lý enzyme Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng (Thomas and Davey, 1975) Một số tác giả thì sử dụng mô sẹo để nuôi cấy tế bào đơn (Trần Văn Minh,1994)

Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sự sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào Vì thế cần chọn lựa môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho nuôi cấy tế bào đơn (King and Street, 1977)

Ứng dụng:

- Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá tế bào trong những điều kiện khác nhau

- Chọn dòng tế bào,

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

Nuôi cấy Protoplast - chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, Protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật)

Khi tế bào mất vách, hai Protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp Protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

Ứng dụng:

- Tạo con lai soma nhờ phương pháp dung hợp Protoplast

- Chuyển các bào quan hoặc cả nhân vào tế bào

- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào

Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời Trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, tuỳ từng loại thực vật mà sử dụng môi trường thích hợp để tạo mô sẹo Từ mô sẹo sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh có 1n gọi là cây đơn bội Tỷ lệ tạo cây đơn bội sẽ phụ thuộc các yếu tố như:

2.3.3 Các bước vi nhân giống

- Nuôi cấy vật liệu nhân giống;

- Tạo thể nhân giống in vitro;

- Nhân giống in vitro;

- Tạo cây con hoàn chỉnh in vitro và huấn luyện cây con;

- Chuyển cây ra vườn ươm;

- Nhân giống lên luống ươm;

- Đưa cây con vào bầu đất;

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Tần số biến dị xảy ra phụ thuộc vào các yếu tố: kiểu di truyền hay giống cây trồng, loại mô cấy và số lần cấy chuyền nhiều hay ít

2.3.4.2 Sự nhiễm mẫu

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve bét, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy

Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây được xem

là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Cây trồng trong nhà kính

ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng

Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường

hợp này Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra

Ngoài ra côn trùng cũng là tác nhân gây nhiễm không kém gì nấm Đồng thời khi xâm nhập chúng còn mang theo nấm vào lúc này mẫu cấy bị nhiễm đồng thời cả côn trùng và nấm

2.3.4.3 Hiện tượng thuỷ tinh thể

Là một dạng bệnh lý của cây, thân lá cây trong suốt và chứa nhiều nước, khó nhân giống Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Để hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể, phương pháp được nhiều người ủng hộ nhất là làm giảm ảnh hưởng của nước trong môi trường nuôi cây bằng cách tăng nồng

độ đường hoặc giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy, tạo thông gió, tăng ánh sáng hay giảm nhiệt độ phòng nuôi cấy

2.3.4.4 Sự hoá nâu do việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm cho sự sinh trưởng và của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tanin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non

Phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với nồng độ thường dùng 0,1 - 0,3% Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol

Để hạn chế ảnh hưởng phenol và tanin các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần

2.3 5 Vai trò chất điều hoà sinh trưởng, dịch chiết hữu cơ trong nuôi cấy in vitro

2.3.5.1 Các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là những chất có bản chất hoá học khác nhau nhưng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây

Trong nuôi cấy in vitro, thường sử dụng hai nhóm chính có vai trò cơ bản là

auxin và cytokinin Ngoài hai nhóm chất căn bản trên, các chất điều hoà khác có thể cần thiết nhưng phần lớn thời gian chúng chỉ kích thích hoặc làm thuận lợi cho mô và hiếm khi là chất thiết yếu (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin

Auxin được tổng hợp từ các thực vật bậc cao, tảo, nấm, và cả vi khuẩn đối với thực vật cơ quan tổng hợp auxin trong cây chủ yếu là đỉnh sinh trưởng ngọn, càng xa đỉnh ngọn hàm lượng auxin càng giảm Ngoài đỉnh ngọn, auxin còn được tổng hợp ở một số cơ quan đang sinh trưởng như lá non, trái non, phôi hạt nhưng hàm lượng rất ít Tính chất sinh lí của auxin

- Tác động rõ ràng lên sự kéo dài tế bào;

- Thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào;

- Kích thích phân bào ở tượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp với cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật;

- Kích thích phát sinh rễ;

- Tạo ưu thế ngọn;

- Làm chậm quá trình lão hoá ở lá;

- Ức chế hay thúc đẩy (thông qua ethylene) sự rụng lá và trái;

- Làm chậm chín

Auxin trong cây trồng:

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), hiện diện cao trong vùng phân sinh mô của thực vật

Các chất auxin tổng hợp:

Auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất là indole-3-butyric acid (IBA),alpha-napthaleneacetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Các auxin này thường được kết hợp liên kết với cytokinin

Trong thực tế, auxin có thể được sử dụng, nó ít độc nhưng cũng ít hiệu quả Chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin, mặc dù các nguy hại về độc tính thì cao hơn Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc auxin được sử dụng để giâm cành, chúng cũng được tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng trong ngành cây ăn quả để làm sáng các quả, đậu quả hoặc làm chậm sự thu hoạch quả

Cytokinine

Cytokinine hình thành chủ yếu trong hệ rễ thực vật Ngoài ra ở một số cơ quan của cây còn non, đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinine như chồi, lá non, trái non

Cytokinine là các chất adenine được thay thế, có hai nhóm nội sinh là:

- Zeatine

- Isopentenyladenine (IPA), cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp Có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:Kinetine (6 furfuryl – aminopurine) và Benzyladenine (BAP) (6 – benzyl – aminopurine)

Các adenine được thay thế khác được dùng dưới dạng tự do hoặc liên kết với một chất đường

Tính chất sinh lí của cytokinine:

- Phát sinh phân bào trong nuôi cấy mô (có mặt auxin);

- Kích thích sự tăng trưởng chồi;

- Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn;

- Nở lá;

- Làm chậm lão hoá lá;

- Tích tụ diệp lục và thúc đẩy chuyển hoá etioplast vào diệp lục

2.3.5.2 Các dịch chiết hữu cơ

Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2004)

Nước dừa

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng

thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh 2004)

Một lít nước dừa có 40 g glucid, 2 - 3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meq kalium, 2 meq natrium, 45 meq clor, 7 meq calcium, 6 meq magie…và các yếu tố vi lượng như sắt, mangan, lithium), vitamin, hầu như không có lipid và có rất ít sinh tố

Dịch chiết nấm men - Yeast Extract

Yeast Extract và một số dịch chiết Orange juice, Tomato juice, Banana juice… được sử dụng với vai trò như một chất hữu cơ khác Dịch chiết nấm men là một dịch lỏng chứa thành phần hòa tan của tế bào nấm men như acid amin, peptides,

cacbonhydrates, vitamin và một số muối khoáng (theo 9th International Symposium on

Yeasts, Sydney, August 1996) bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sự phát

triển của các tế bào Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết nấm men không có tác dụng ở các đối tượng cùng loài Hàm lượng thường sử dụng là 100mg/l môi trường

2.3.6 Nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

2.3.6.1 Nhân giống in vitro bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Công cụ chủ lực của nhân giống hiện nay là tạo dòng từ “đỉnh sinh trưởng” hay

“điểm tăng trưởng” Cây giống tạo ra theo phương pháp này gọi là cây tạo dòng (cloning) Quá trình tạo dòng làm giảm các đột biến bất lợi của phương pháp nhân giống truyền thống Do đó tạo nên được những quần thể cây con đồng tính trạng, có sự tăng trưởng và chất lượng hoa đồng đều Qui trình tạo dòng cũng đảm bảo sự ổn định

về màu sắc và sự pha trộn trên các cánh hoa Tuy nhiên đối với Hồ Điệp phương pháp này thực hiện rất khó thành công, đỉnh sinh trưởng quá nhỏ bé nên rất khó lấy, không thể tái sinh hoặc chết đi qua khử trùng

2.3.6.2 Nhân giống in vitro bằng nuôi cấy phát hoa

Phalaenopsis là loại lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh

trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí

quá trình nuôi cấy Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa Hồ Điệp có chứa các mắt ngủ phần gốc, có bề mặt nhẵn bóng dễ khử trùng, tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo

được dòng cây ổn định về di truyền

2.3.6.3 Nhân giống in vitro bằng phương pháp nuôi cấy hạt

Sơ lược về lai giống hoa lan

Hoa lan có mức độ lai giống rất cao, ngoài tự nhiên xảy ra điều này thì chứng tỏ rằng khi con người tiến hành lai giống nhân tạo thì khả năng tạo ra những loài khi ra hoa giống trong tự nhiên là có thể Điều này rất quan trọng trong việc giảm áp lực cho các loài giống tự nhiên, bảo vệ sự đa dạng sinh học vốn có của tự nhiên

Từ giữa thế kỷ XIX việc lai giống hoa lan phát triển mạnh mẽ khi khoa học đã hiểu rõ được cấu trúc hoa lan Giai đoạn đầu thì gặp khó khăn, tuy nhiên không lâu sau người ta nhận ra rằng hầu hết các chủng loại chỉ lai được với cùng giống khác hoặc cùng họ đã có sẵn mối liên hệ Điều này đã tạo bước nhảy vọt trong lịch sử lai giống hoa lan

Sự thụ phấn của hoa lan

Thụ phấn trong tự nhiên

Với màu sắc rực rỡ và hương thơm ngào ngạt, hoa lan tung ra "quảng cáo" giả

về những bữa phấn hoa và mật hoa "miễn phí" nhằm thu hút ong, bướm và các loài côn trùng khác Đăc biệt do cánh hoa bên dưới biến thành cánh môi, giống như một bãi đáp cho côn trùng thụ phấn (pollinator) hoặc cánh môi biến hình giông côn trùng cái hoặc tiết ra pheromone dẫn dụ côn trùng đực đến thụ phấn giúp Đây là một trong những phương cách làm giảm nguy cơ tự thụ phấn của hoa lan Tuy nhiên, hoa lan là loài hoa khó thụ phấn do có bao phấn đậy hạt phấn lại

Thụ phấn nhân tạo

Để thụ phấn, một cây lan phải mạnh khoẻ, bởi vì để tạo được quả, phải tốn nhiều sinh lực của cây lan

Để tạo nên quả lan, ta lấy phấn hoa (pollinia - nhị đực) của một bông hoa cấy vào đầu nhuỵ cái (stigma) một bông hoa khác Nếu chỉ có một cây lan hoặc chỉ có một

bông thì có thể mang phấn hoa sang đầu nhuỵ của nó

Kỹ thuật thụ phấn: Dụng cụ được dùng là một cái tăm gỗ để cấy phấn hoa Thời gian tốt nhất để thụ phấn hoa lan là khi bông hoa đã nở hoàn toàn Đưa đầu tăm vào trong hoa và lấy nhị hoa ra Đôi khi nhị hoa không dính vào que tăm Trong trường hợp này, nên dùng một cái kẹp để lấy ra Bước kế tiếp lấy cái nắp bao phấn ra và đặt phấn hoa vào trong nhuỵ cái, càng gần ống nhuỵ (stigma channel) càng tốt, của bông hoa khác Sau đó ghi ngày thụ phấn và tên của cây cha

Thu hoạch quả lan: Các hạt lan trong quả lan sẽ trưởng thành trong khoảng thời gian 3/4 đến- 4/5 khoảng thời gian từ khi thụ phấn đến khi chín Gieo hạt của quả xanh trong ống nghiệm, có thể thu hoạch chúng trong thời gian này Điều quan trọng là quả lan xanh phải kín, không có lỗ hoặc các nấm mốc có thể xâm nhập vào các hạt lan, nói khác đi là không bị nhiễm Muốn gieo hạt chín khô, phải chờ cho đến khi quả lan nứt

ra và thu hoạch chúng Đối với Phalaenopsis thì khoảng thời gian đó là 6 tháng

Sinh vật học của hạt lan nảy mầm

Hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi và không có dự trữ chất dinh dưỡng cung cấp cho hạt trong giai đoạn đầu tiên của cuộc sống Bởi vì lý do đó, hoa lan sinh sản một

số lượng lớn, lên đến cả triệu hạt trong mỗi quả lan

Trong thiên nhiên hạt lan sẽ nảy mầm, nhưng chỉ phát triển được khi bị nhiễm

các loại nấm cộng sinh như Rhizoctonia repens, R mucoronides, R lanuginosa

Hình 2.3: Hạt Lan Phaius tankervilleae trong quả đã chín

Nguồn: www.orchideenvermehrung.at

Nảy mầm cộng sinh (symbiotic) trong in vitro

Trong phương pháp này nấm cộng sinh đã được nuôi sẵn trong ống nghiệm Hạt lan được khử trùng và chuyển vào trong ống nghiệm, sẽ tiêm nhiễm với nấm và bắt đầu phát triển Lần đầu tiên phương pháp cộng sinh nấm để gây sự nảy mầm cho hạt được Noel Bermard tiến hành 1904

Sự khó khăn của cách làm này là làm sao giữ cho sự phát triển của nấm và sự phát triển của hạt lan cân bằng Nếu không cân bằng nấm sẽ phát triển quá nhanh và giết chết các hạt lan

Nảy mầm không cộng sinh (asymbiotic) trong in vitro

Để giảm thiểu sự rủi ro thất bại người ta không dùng nấm cộng sinh để cho hạt lan "ăn" Công việc này được làm bởi môi trường mà hạt được trồng lên Môi trường nuôi cấy cung cấp cho hạt lan đường và chất dinh dưỡng cho đến khi chúng đủ lớn để

Gần đây công thức II Yamada cũng được phổ biến:

- Gaviota 67(phần vô cơ): 2,5 g

- Nước dừa tươi: 250 ml

2.3.6 4 Những khó khăn trong nuôi cấy lan Hồ Điệp từ hạt

Hạt lan Hồ Điệp cũng như các loại lan khác, không chứa abumin vì thế cây con không thể phát triển sau khi nảy mầm nếu không tiêm nhiễm với các nấm cộng sinh của nó Điều này đã được Hans Burgeff (Đức) và Noel (Pháp) thông báo độc lập năm

1904 rằng sự nảy mầm của hạt lan chỉ xuất hiện khi có nấm cộng sinh, nhưng điều này vấp phải vấn đề sự phát triển của nấm giết chết hạt lan hoặc lấn át sự phát triển của cây lan con Đến năm 1922 Knudson C đã giả quyết được vấn đề này bằng việc đưa ra môi trường nuôi cấy có chứa agar, các muối khoáng và đường Điều này chỉ đồng nghĩa với việc cây con có thể phát triển nhưng sự phát triển ấy như thế nào là vấn đề còn bàn cãi và không thể khẳng định là tốt cho tất cả các loài lan và việc đi tìm kiếm môi trường thích hợp cho sự nảy mầm của hạt cũng như môi trường nhân giống từng loại lan là công việc vẫn đang tiếp diễn

Và khi con người tạo ra được vô số các giống lan lai thì bên cạnh đó, chúng ta cũng cần tìm ra môi trường thích hợp để nuôi cấy chúng thành công hơn

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

Thời gian: Thí nghiệm được tiến hành từ 02/2009 đên 07/2009

Địa điểm: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiêp Miền Nam

3.2 Điều kiện nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng

Thí nghiệm được tiến hành trên đối tượng là quả Hồ Điệp Phalaenopsis của 3 tổ hợp lai (38/42, 25/26, 26/32) từ mẫu có tại Tissue Culture Lab, phòng Di truyền và Chọn giống,Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam

Tên các giống bố mẹ:

25 (Doritaenopsis Hsintien Stripes)

26 (Chen Xen Queen)

32 (Dtps I - Hsin Black Jack)

38 (Doritaenopsis Queen Bee Mantenko)

42 (Drtp Pulcherrima)

Hình 3.1: Các giống lai bố mẹ được sử dụng làm thí nghiệm

3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm

Phòng pha môi trường: Gồm: Nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, bể rửa chai lọ, bếp

điện, lò viva, cân điện tử và cân phân tích, máy lắc từ, máy cất nước hai lần, chai lọ, pipet, ống đong, đũa thủy tinh, đĩa peptri

Phòng cấy: Gồm: Tủ cấy vô trùng, bàn để môi trường và mẫu cấy, tủ để các dụng

cụ thao tác, dụng cụ thao tác (tất cả đã được hấp khử trùng 1atm, 130 0C, 30 phút)

Phòng nuôi cây: Gồm: Hệ thống kệ để cây và đèn neon chiếu sáng, cường độ

chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, máy điều hoà nhiệt độ (nhiệt độ phòng cấy là 25  1 0C, ẩm độ: 70 – 80 %)

Dụng cụ thí nghiệm: Gồm: Đèn cồn, viết, dao, kéo, kẹp, giấy thấm nước, bình nuôi

cấy thể tích 200 – 350 ml, ống đong, đĩa peptri, giấy đo, cồn 960 và cồn 700, nước cất, Javel

3.2.3 Công thức môi trường sử dụng làm thí nghiệm

Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) gồm:

Bảng 3.1: Công thức môi trường MS

Ngoài ra trong môi trường cải tiến còn thêm đường, agar, các chất điều hoà sinh trưởng BA (Benzyl adenine), NAA (α – Naphytylacetic acid) Các dịch chiết hữu cơ được sử dụng gồm: nước dừa, nấm men Môi trường cấy được hiệu chỉnh pH = 5,7 - 5,8

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121 0C, 20 phút, 1 amt Các thao tác nuôi cấy và lấy số liệu được tiến hành trong điều kiện vô trùng

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.2 Môi trường nền

Trong một lít môi trường thí nghiệm bao gồm:

MS + 8 gram agar + 30 gram sucrose + 0,5 gram than hoạt tính

3.3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Tìm hiểu nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý quả

Lan Hồ Điệp

Hình 3.2: Quả Lan Hồ Điệp trên cây Hình 3.3: Quả Lan sử dụng làm thí nghiệm

Mục đích: Xác định nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý thích hợp nhất

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm theo kiểu hai yếu tố, 9 nghiệm thức, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Yếu tố C: nồng độ Javel dùng khử trùng với các mức 50%, 70% và 100%, ký hiệu tương ứng là C1, C2 và C3

Yếu tố T: thời gian khử trùng với các mức 10 phút, 15 phút, 20 phút, ký hiệu

tương ứng là T1, T2 và T3

Phối hợp 2 yếu tố thành 9 nghiệm thức từ 1, 2, 3 đến 9 như sau:

Bảng 3.2: Sơ đồ nghiệm thức thí nghiệm khử trùng quả lan

Quả lan được lắc qua cồn 700 trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó, ngâm quả lan trong dung dịch Javel đã pha sẵn với các nồng độ 50,70,100% và canh thời gian 10, 15, 20 phút Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần Cuối cùng quả lan được nhúng vào cồn 960 đốt nhanh trên lửa đèn cồn

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ bình nhiễm nấm = số bình nhiễm nấm/ tổng số bình gieo;

- Tỷ lệ bình nhiễm khuẩn = số bình nhiễm khuẩn/ tổng số bình gieo;

- Tỷ lệ bình nhiễm = tổng số bình nhiễm/ tổng số bình gieo

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Tìm hiểu môi trường gieo hạt thích hợp

Mục đích: Xác định môi trường gieo hạt thích hợp cho mỗi giống

- MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ký hiệu là M1;

- MS môi trường MS bổ sung 100 ml nước dừa, ký hiệu là M2;

- Môi trường MS bổ sung 100 mg PVP, ký hiệu là M3;

- Môi trường MS bổ sung 100 ml dịch chiết nấm men, ký hiệu là M4 Yếu tố V: gồm 3 tổ hợp lai 38/42, 25/26 và 26/32, được ký hiệu: V1, V2 và V3 Phối hợp 2 yếu tố thành 12 nghiệm thức từ 1, 2, 3 đến 12 như sau:

Bảng 3.3: Sơ đồ nghiệm thức thí nghiệm gieo hạt

Giống

Môi trường

V1 (38/42)

V2 (25/26)

V3 (26/32)

Trung bình, mỗi quả được gieo vào 3 bình môi trường

Chỉ tiêu theo dõi:

Số lượng hạt nảy mầm/NT = số cây thu được đem cấy chuyền môi trường mới

3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Tìm hiểu môi trường cấy chuyền thích hợp

Mục đích: Xác định môi trường cấy chuyền thích hợp cho mỗi giống

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm bố trí theo kiều hoàn toàn ngẫu nhiên 3 yếu tố, 12NT, 3LLL

Yếu tố B: nồng độ BA 0mg/l và 0,1mg/l, ký hiệu là B1 và B2

Yếu tố N: nồng độ NAA 0,1mg/l và 0,5mg/l, ký hiệu là N1 và N2)

Yếu tố V: gồm 3 tổ hợp lai 38/42, 25/26 và 26/32, được ký hiệu: V1, V2 và V3 Phối hợp 3 yếu tố thành 12 nghiệm thức từ 1, 2, 3 đến 12 như sau:

Bảng 3.4: Sơ đồ nghiệm thức thí nghiệm cấy chuyền

Giống

B1 (0mg/l)

NT 1 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 2 N2 (NAA 0,5mg/l)

NT 3 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 4 N2 (NAA 0,5mg/l)

NT 5 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 6 N2 (NAA 0,5mg/l)

B2 (0.1mg/l)

NT 7 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 8 N2 (NAA 0,5mg/l)

NT 9 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 10 N2 (NAA 0,5mg/l)

NT 11 N1 (NAA 0,1mg/l)

NT 12 N2 (NAA 0,5mg/l)

Phương pháp tiến hành:

Sau khi hạt mảy mầm, chọn những mầm đồng đều nhau cấy vào bình môi trường Mỗi bình cấy 5 mẫu, cấy vào 36 bình cho cả 3 LLL Tiến hành đo và lấy số liệu vào 45, 60, 75 ngày sau khi cấy

Số liệu được đếm và được đo đạt trên giấy kẻ ô li vuông, đơn vị 1mm2

Chỉ tiêu theo dõi:

- Số chồi (chồi)

- Số lá (lá)

- Dài lá (mm)

- Rộng lá (mm)

- Chiều cao cây (mm)

- Ngang cây chiếm chỗ (mm)

3.3.2.4 Thí nghiệm 4: Tìm hiểu môi trường ra rễ thích hợp

Mục đích: Xác định môi trường ra rễ thích hợp

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, 4 NT, 3 LLL

Tiến hành trên giống số 2 (25/26)

NT 1: 0,1 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA

NT 2: 0,1 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA

NT 3: 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA

NT 4: đối chứng (0 mg/l BA + 0 mg/l NAA) Phương pháp tiến hành:

Mẫu cấy được chọn đảm bảo độ đồng đều (số lá, dài lá, rộng lá và chiều cao cây), chọn những cây khỏe mạnh, lá xanh đậm Sau đó cấy vào bình môi trường, mỗi bình 5 mẫu, 5 cây/bình, tất cả 12 bình

Tiến hành lấy số liệu vào 20, 30, 40 ngày sau cấy Theo dõi và ghi nhận ngày ra

rễ đầu tiên

Chỉ tiêu theo dõi:

- Ngày ra rễ đầu tiên (ngày)

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tìm hiểu nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý quả lan Hồ Điệp (Thí nghiệm 1)

Đối với nuôi cấy in vitro, vấn đề giữ cho mẫu không bị nhiễm là rất quan trọng

quyết định thành công của thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, vitamin và muối khoáng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm và vi khuẩn Do sự phát triển của vi sinh vật nhanh hơn nhiều so với sự phát triển của mẫu cấy nên nếu mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật thì chỉ trong vài ngày toàn bộ bề mặt môi trường cũng như mẫu cấy sẽ bị bao phủ bởi vi sinh vật Trong trường hợp này mẫu cấy phải bỏ đi vì không còn khả năng sinh trưởng

và chết dần

Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1

Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm (%) của các nghiệm thức sau 7 ngày

Thời gian xử lý: T (phút) Nồng độ Javel: C (%) T1 (10 phút) T2 (15 phút) T3 (20 phút) C1 (50%)

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm này, thời gian mẫu nhiễm sớm nhất được ghi nhận ở các nghiệm thức 50 % (10, 15, 20 phút) và nghiệm thức 70 % (10, 15 phút)

ở 3 ngày sau gieo Các nghiệm thức còn lại đều bắt đầu có biểu hiện bị nhiễm sau gieo

5 ngày

Kết quả trong bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức khử trùng 100 % Javel trong vòng

20 phút cho kết quả có tỷ lệ nhiễm thấp nhất, tuy nhiên công thức này lại làm cho mẫu chết Vì vậy các nghiệm thức cho kết quả khả quan nhất, có tỷ lệ nhiễm thấp và mẫu không chết là NT 7 (100 % Javel + 10 phút) 42,9%, NT 8 (100 % Javel + 15 phút) 42,9 %

Hình 4.1: Kết quả khử trùng mẫu sau 7 ngày cấy 4.2 Tìm hiểu môi trường gieo hạt thích hợp

Hạt lan nói chung và hạt Hồ Điệp nói riêng do cấu trúc đơn giản không chứa abumin và một phôi chưa phân hóa, nên khả năng nảy mầm của hạt trong tự nhiên là rất hạn chế (có khi lên đến 1.000.000 hạt mới có thể nảy mầm được 1 hạt - Nguyễn Nam Sách) và thường nảy mầm ở gốc cây mẹ Năm 1904, Noel Bernard là người đầu tiên nghiên cứu về hiện tượng này và đã làm nảy mầm hạt lan theo hướng bắt chước điều kiện tự nhiên với sự cộng sinh của nấm

Năm 1909, Hans Burgeff đã làm nảy mầm được Laelio Cattleya trên môi trường saccharose 0,33% trong điều kiện hoàn toàn bóng tối Đến năm 1922 thì Lewid

Knudson làm nảy mầm hạt Cattleya mossia trên môi trường thạch Hiện nay thì có

nhiều môi trường được sử dụng cho gieo hạt lan như Knudson 1946, công thức II Yamada, Vacin và Went…