XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY VÔNG VANG (Abelmoschus moschutas)

Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY

VÔNG VANG (Abelmoschus moschutas)

Niên khóa : 2008 - 2012 Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG QUANG HIẾU

Tháng 7/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY

VÔNG VANG (Abelmoschus moschutas)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TRỊNH THỊ THANH HUYỀN TRƯƠNG QUANG HIẾU

KS NGÔ QUANG HƯỞNG

Tháng 7/2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

 Quí thầy cô trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các quí thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

 Các anh chị làm việc ở Trung tâm ứng dụng công nghệ sinh – Sở Khoa học và Công nghệ Đồng Nai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá luận này

Đặc biệt, tôi xin được tỏ lòng biết ơn chân thành đến

o Thạc sỹ Trịnh Thị Thanh Huyền

o Kỹ sư Ngô Quang Hưởng

 Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khoá luận

 Xin được gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn bè, các anh chị em trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 34 đã góp ý, động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

 Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh chị

em trong gia đình và người thân

TÓM TẮT

Cây vông vang được biết đến như là một cây hương liệu, dược liệu, thân thảo, thân

có lông mềm Cây vông vang có vị ngọt, nhạt, nhiều nhớt, tính mát, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, trừ thấp, nhuận tràng, lợi tiểu, làm dễ đẻ Hạt của cây vông vang chứa tinh dầu,

có mùi thơm và được dùng trong công nghiệp sản xuất nước hoa Để đáp ứng nhu cầu thực tiễn cần xây dựng một quy trình nhân giống cây vông vang

Nội dung đề tài gồm: khử trùng mẫu hạt vông vang, khảo sát khả năng phát sinh chồi và phát sinh rễ cây vông vang, trồng thử nghiệm ngoài vườn ươm

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp giúp tỷ lệ hạt nảy mầm tốt nhất là ngâm hạt trong nước ấm 540C trước khi khử trùng mẫu, tạo vết thương cho hạt, ủ hạt trên bông

ẩm và để qua đêm Sau 4 tuần nuôi cấy, 83,33% mẫu nảy mầm; 6,67% mẫu nhiễm Môi trường MS + BA 0,03 mg/l + IBA 1 mg/l thích hợp cho sự phát sinh chồi của cây vông

vang in vitro Sau 4 tuần, hệ số nhân chồi đạt 5 chồi / mẫu Môi trường nuôi cấy MS bổ sung 1mg/l IBA sẽ tạo được cây vông vang in vitro hoàn chỉnh với bộ rễ tốt , thời gian tạo

rễ nhanh (trong 4 ngày sau khi cấy chuyền chồi là xuất hiện rễ) Cây sau khi phát sinh rễ hoàn chỉnh được đem trồng thử nghiệm ngoài vườn ươm trên giá thể xơ dừa, tưới nước thường xuyên, không để cây trong bóng râm

SUMMARY

Abelmoschus moschatus is known as a flavoring plant, medicinal herbs,

herbaceous, body’s soft hair Abelmoschus moschatus is sweet, bland, more viscous, the

cool It effect disinfection, antiseptic, except low, laxative, diuretic, give birth easily Seed

of Abelmoschus moschatus contains essential oils, scented and are used in industry of

production perfume To meet the practical requirements necessary to build a process

plant's Abelmoschus moschatus

Content implementation including sterilized Abelmoschus moschutas seed samples, arising at the possibility of shoots and roots arising Abelmoschus moschutas, outside the

nursery trials

Results: Methodology for seed germination rate is best in warm water for soaking beans, wounds created particles, incubated seeds on wet cotton and overnight After 4 weeks of culture, 83.33% samples were germinated; 6.67% samples were infected Environment MS medium supplemented ưith 0,03 mg/l BA and 1 mg/l IBA was suitable

for shoot initiaion of Abelmoschus moschatus in vitro After 4 weeks multiplier shoots reach 5 shoots / node To add to the environment grow with concentration MS + IBA 1

mg / l will created a Abelmoschus moschatus in vitro completely with the number 106

roots and roots length of 3,211 cm with time creat roots was the fastest (in just 4 days appears roots) Growing on coir, frequent watering, not to trees in shade is a suitable

condition for Abelmoschus moschatus grow well outside the nursery

Keywords: Abelmoschus moschatus, in vitro

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i 

TÓM TẮT ii 

SUMMARY ii 

DANH SÁCH CÁC CHỨ VIẾT TẮT vii 

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii 

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Yêu cầu 2 

1.3 Nội dung thực hiện 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1 Giới thiệu khái quát cây vông vang 3 

2.1.1 Phân loại 3 

2.1.2 Mô tả cây 3 

2.1.3 Phân bố, sinh thái, sinh lý 4 

2.1.4 Công dụng 5 

2.1.5 Thành phần hóa học trong hạt vông vang 5 

2.1.6 Đặc điểm bột dược liệu 6 

2.2 Khái quát về nhân giống cây trồng in vitro 6 

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 

2.2.2 Một số thành tựu về nuôi cấy mô 6 

2.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 7 

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 8 

2.2.4.1 Mẫu nuôi cấy 8 

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 9 

2.2.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 9 

2.2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền 10 

2.2.5.2 Sự hoại mẫu 10 

2.2.5.3 Hiện tượng tiết chất gây độc từ mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro 10 

2.2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể 11 

2.2.6 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật 11 

2.2.6.1 Auxin 12 

2.2.6.2 Cytokinin 12 

2.2.7 Một số thành tựu về nuôi cấy mô cây dược liệu ở Việt Nam 12 

2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu cây vông vang trong và ngoài nước 13 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15 

3.2 Đối tượng thí nghiệm 15 

3.3 Vật liệu nghiên cứu 15 

3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ 15 

3.3.2 Môi trường nuôi cấy 15 

3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 

3.4.1 Khử trùng mẫu 16 

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu đến khả năng nảy chồi của hạt vông vang 17 

3.4.3 Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây vông vang 17 

3.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 17 

3.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 18 

3.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và Kn đến sự phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 19 

3.4.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA và IBA đến sự phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 20 

3.4.4 Khảo sát khả năng phát sinh rễ của cây vông vang 21 

3.4.5 Trồng ngoài vườn ươm 22 

3.5 Phân tích thống kê 22 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 

4.1 Ảnh hưởng của phương pháp vô mẫu đến khả năng nảy chồi của hạt vông vang 23 

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường lên khả năng tạo chồi của cây vông vang 24 

4.2.1 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang 25 

4.2.3 Ảnh hưởng của BA và Kn lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang 28 

4.2.4 Ảnh hưởng của BA và IBA lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang 29 

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự hình thành rễ của cây vông vang 31 

4.4 Trồng cây ngoài vườn ươm 34 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 

5.1 Kết luận 35 

5.2 Đề nghị 35 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36  PHỤ LỤC 

DANH SÁCH CÁC CHỨ VIẾT TẮT

NT : Nghiệm thức

MS : Murashige và Skoog

IBA : Indol butyric acid

NAA : Napthlacetic acid

IBA : Indol butyric acid

NAA : Napthlacetic acid

ĐC : Đối chứng

Ctv : Cộng tác viên

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

v/v : Thể tích / Thể tích

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1:Cây vông vang 3 

Hình 4.1 Cây vông vang in vitro mới nảy mầm 23 

Hình 4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi cây vông vang in vitro 26 

Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh chồi cây vông vang in vitro 27 

Hình 4.4 Ảnh hưởng của BA, IBA và Kn đến sự phát sinh chồi cây vông vang in vitro 29  Hình 4.5 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự phát sinh chồi cây vông vang 31 

Hình 4.6 Rễ cây vông vang in vitro sau 3 tuần nuôi cấy 33 

Hình 4.7 Cây vông vang trong bầu sau 2 tuần trồng ngoài vườn 34 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng phát sinh

chồi của cây vông vang in vitro 17 

Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh chồi của cây

vông vang 19 

Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và Kn ở nồng độ thấp đến sự

phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 19 

Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và IBA ở nồng độ thấp đến sự

phát sinh chồi của cây vông vang in vitro 20 

Bảng 3.5 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự hình thành rễ

của vông vang in vitro 21 

Bảng 4.1: Kết quả vô mẫu hạt vông vang sau 4 tuần nuôi cấy 23  Bảng 4.2: Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh chồi cây vông vang in vitro sau 3 tuần 27  Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BA và Kn lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang 28  Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BA và IBA lên khả năng phát sinh chồi của cây vông vang 30 

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự hình thành rễ của cây vông vang in vitro

sau 4 tuần nuôi cấy 32  

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu từ thực vật đã được con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng lớn Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm

bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người

Cây vông vang được biết đến như là một cây hương liệu, dược liệu, thuộc họ thân thảo, thân có lông mềm Ở nước ta cây mọc rải rác từ vùng núi thấp (thường dưới 1000 m) đến trung du và đôi khi thấy ở cả đồng bằng Cây vông vang có vị ngọt, nhạt, nhiều nhớt, tính mát Vào ba kinh: can, tỳ, phế, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, trừ thấp, nhuận tràng, lợi tiểu, làm dễ đẻ Hạt của nó chứa tinh dầu, có mùi thơm và được dùng để sản xuất nước hoa Với nhiều tính năng và công dụng nên nó ngày càng bị khai thác qua mức, cộng với môi trường tự nhiên có nhiều thay đổi nên việc mọc tự nhiên rất khó Ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về vông vang được thực hiện Mặt khác các nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào việc ly trích, phân tích thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính dược học của các hợp chất thứ cấp từ các bộ phận của cây vông vang Trong khi đó, các nghiên cứu về sinh lý cở bản còn rất ít và hầu như chưa có nghiên cứu về sự phát sinh cơ quan ở cây vông vang Bên cạnh đó, việc nhân giống cây hiện nay chủ yếu được thực hiện bằng cách gieo hạt với thời gian nảy mầm kéo dài, cây con rất dễ bị sâu bệnh tấn công và không giữ được những đặc tính của cây mẹ

Để đáp ứng nhu cầu thực tế về việc cung cấp nguồn dược liệu với năng suất cao

mà không mất đi đặc tính của cây mẹ cũng như bảo tồn loài cây này, nâng cao hiệu quả kinh tế thì việc nhân giống hàng loạt là rất cần thiết Trước thực tiễn như trên đề tài

“Nhân giống in vitro cây vông vang (Abelmoschus moschatus)” đã được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Xác định được phương pháp vô mẫu thích hợp cho việc nảy chồi của hạt vông

vang in vitro

Xác định nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp đến khả năng tạo

chồi của cây vông vang in vitro bằng phương pháp nuôi cấy chồi nách

Xác định nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự tạo rễ cây

vông vang in vitro trước khi đem ra vườn ươm

Xác định được điều kiện thích hợp cho việc trồng cây vông vang ngoài vườn ươm

1.3 Nội dung thực hiện

Khử trùng mẫu hạt vông vang

Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây vông vang

Khảo sát khả năng phát sinh rễ cây vông vang

Trồng cây ngoài vườn ươm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu khái quát cây vông vang

Chi : Abelmoschus Medik

Loài : Abelmoschus moschatus (L.) Medik

Tên khoa học : Abelmoschus moschatus (L.) Medik.

2.1.2 Mô tả cây

Tên thường gọi: Vông vang

Tên khác : Hoàng quỳ, Bụp vang, Vông vàng, Bông vang…

Cây vông vang có nguồn gốc từ Ấn Độ (Nautiyal và Tiwari, 2011) Vông vang

thuộc họ thân thảo, cây cao từ 0,8 – 1 m Thân non tiết diện hơi đa giác, màu xanh lục, có nhiều lông cứng ngắn, màu trắng Thân già tiết diện tròn, màu nâu, ít lông hơn thân non,

có nốt sần, hóa gỗ ở gốc Thân non có nhiều chất nhầy hơn thân già

Lá mọc so le, có cuống dài, gốc hình tim, đầu nhon, mép khía răng nhỏ, gân lá hình chân vịt, hai mặt có lông, lá phía dưới chia thuỳ nông, thuỳ hình tam giác, lá phía trên chia 5 thuỳ sâu, thuỳ hình mác, lá kèm nhỏ, hình giùi, mặt trên màu xanh lục, mặt dưới nhạt hơn, dài 16 - 17 cm, rộng 14,5 cm Cuống lá hình trụ hơi dẹt, dài 9 - 10 cm, màu xanh lục, chỗ gắn vào thân hơi phớt đỏ

Hoa to, màu vàng, mọc đơn độc, có cuống dài, tiểu đài có 10 răng nhọn, rất hẹp, đài có răng rộng hơn, tràng 5 cánh rộng, nhị nhiều, tụ tập trên một cột nhẵn, bầu có lông.Cuống hoa hình trụ, hơi loe ở nơi tiếp giáp với đế hoa, dài 3,8 - 5,4 cm, khoảng 1 cm ở gốc có màu nâu đỏ, có nhiều lông cứng, ngắn, màu trắng Nhị nhiều, không đều, dính

Hình 2.1:Cây vông vang

(tuelinh.vn)

nhau ở phần lớn chỉ nhị, rời khoảng 0,05 cm phía trên, ống chỉ nhị màu trắng, đáy màu tím, miệng có 5 răng tròn không đều, phần dưới ống có màu xanh phớt tím, loe rộng ôm lấy bầu Đáy ống chỉ nhị dính vào đáy cánh hoa Chỉ nhị dạng sợi, màu trắng Bao phấn cong dạng chữ C, màu vàng, 1 ô, nứt dọc, hướng ngoài, đính giữa Hạt phấn rời, hình cầu gai, màu vàng nhạt, đường kính 150 µm Bầu noãn hình tháp, màu xanh, phủ nhiều lông dài màu trắng, 1 vòi nhụy hình trụ màu trắng, dài 1,2 cm, nhẵn, phía trên chia 5 nhánh dài 0,3 cm, mặt ngoài trắng, mặt trong đỏ, trên nhánh có lông ngắn màu trắng, tận cùng mỗi nhánh mang đầu nhụy hình mâm, màu đỏ đậm, có nhiều lông ngắn, màu đỏ

Quả nang, hình chóp nhọn, có lông trắng, khi chín không còn tiểu đài, hạt nhỏ và nhiều, hình thận, có mùi xạ, dài 5 đến 6 cm, rộng 3,5 cm, quả non màu xanh, quả già màu nâu, có 5 lằn dọc và có nhiều lông, khi chín nứt theo đường hàn mép lá noãn Hạt hình hạt đậu, màu đen, có nhiều vân đồng tâm màu nâu, kích thước 0,3 - 0,35 x 0,2 cm, có mùi xạ (Trương Thị Đẹp và ctv, 2011)

Cây vông vang ra hoa từ tháng bảy đến tháng chín, hạt giống chín từ tháng tám đến tháng mười Những bông hoa có mùi thơm là hoa lưỡng tính và được thụ phấn nhờ côn trùng (Orwa và ctv, 2009)

2.1.3 Phân bố, sinh thái, sinh lý

Ở nước ta cây vông vang mọc rải rác từ vùng núi thấp (thường dưới 1000 m) đến trung du và đôi khi thấy ở cả đồng bằng, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ thấp ở nương rẫy, ven đồi, bãi hoang hay ven đường đi Ngoài ra cây vông vang còn xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Ấn Độ, miền nam Trung Quốc và các vùng nhiệt đới châu Á, và một

số đảo Thái Bình Dương (Pier, 2003) Xuất hiện ở nhiều khu vực nông nghiệp, rừng tự nhiên, rừng trồng, đồng cỏ, khu vực ven sông, khu đô thị, có thể phát triển trên các vùng đất ngập mặn (Mishra Naik, 2000) Vông vang là loài cây ưa sáng, có thể hơi chịu hạn, cây con mọc từ hạt thường vào tháng 4 - 5, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu thì có hoa quả Quả vông vang già tự mở cho hạt phát tán ra xung quanh, sau đó toàn cây tàn lụi một phần (cành lá), phân thân cành còn lại sẽ mọc trồi vào mùa xuân năm sau (Trương Thị Đẹp và ctv, 2011) Vông vang thích hợp với độ pH trong khoảng 6 - 7,8 Cây

vông vang không thể phát triển trong bóng râm Nó đòi hỏi độ ẩm đất cao và yêu cầu đất thoát nước tốt (Orwa và ctv, 2009).

2.1.4 Công dụng

Người ta thường sử dụng rễ, lá cây vông vang để làm thuốc, thu hái quanh năm, dùng tươi hoặc phơi khô Hạt lấy ở những quả già (Trương Thị Đẹp và ctv, 2011) Hạt được tách chiết lấy tinh dầu sử dụng cho các ngành công nghiệp nước hoa (Oudhia, 2001) Lá vông vang được dùng chữa táo bón, thuỷ thũng, tán ung độc, thúc đẻ Ngày dùng 20 – 40 g, dạng thuốc sắc, thuốc hãm hoặc dùng tươi giã nhuyễn vắt lấy nước uống

Rễ vông vang chữa nhức mỏi chân tay, các khớp sưng nóng đỏ đau, co quắp, mụn nhọt, viêm dạ dày hành tá tràng, với liều 20 - 40 g/ngày dưới dạnh thuốc sắc hoặc thuốc hãm (Trương Thị Đẹp và ctv, 2011) Hạt chữa đái buốt, đái dắt, sỏi thận, sỏi bàng quang, đại tiểu tiện bí kết, làm dễ đẻ và bôi mụn lở, giã dập hạt thêm nước uống hoặc sắc uống Hạt còn được dùng làm thuốc trấn kinh, chữa di tinh, ngày 4 – 6 g dưới dạng thuốc sắc hay thuốc bột Để chữa rắn cắn, lấy 50 g hạt vông vang hoặc nhiều ít tùy theo nặng nhẹ, nhai nhỏ, nuốt nước, bã đắp lên vết cắn Kiêng kỵ: cơ thể suy nhược, tiêu chảy, đái đêm nhiều không nên dùng.Dầu thu được từ hạt sở hữu một mùi xạ hương giống như được sử dụng trong ngành công nghiệp nước hoa (Oudhia, 2001) Vào ba kinh: can, tỳ, phế, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, trừ thấp, nhuận tràng, lợi tiểu, làm dễ đẻ (Huỳnh Ngọc Tựng, 2008)

2.1.5 Thành phần hóa học trong hạt vông vang

Hạt vông vang chứa tinh dầu gồm ambretolic [(Z) - 7 - hexadecen - 16 – olid], acid ambretolic, farnesol, acid 12,13 - epoxyoleic, acid malvalic, acid sterculic, các acid C10, C18 (acid oleic, acid palmitic, các acid C10, C12, C14, C16, C18) Năm 1996, Leung và cộng tác viên đã tiến hành chiết xuất hạt vông vang, và nhận thấy trong hạt đó có chứa (Z)

- 5 - tetradecen - 14 - olid, (Z) - 5 - dodecenyl acetat và (Z) - 5 - tetradecenyl acetat với các hiệu suất theo thứ tự 0,5, 0,01 và 0,4% Vỏ hạt có 2 - trans, 6 - trans - farnesyl acetat,

2 - cis, 6 - trans - farnesyl acetat và oxacyclononodec - 10 - 2 - on (chất đồng đẳng của ambretolid) Chất có mùi xạ chủ yếu là do ambretolid và (Z) - 5 - tetradecen-14-olid Hạt còn chứa các chất khác như methionin sulfoxyd, phospholipid (alpha - cephalin, phosphatidylserin, phosphatidylcholin plasmalogen) và sterol (campesterol,

sitosterol, stigmasterol, ergosterol và cholesterol Dầu hạt còn có acid palmitic, acid myristic Hạt còn có các acid béo mạch dài Các acid béo nói trên nếu đã được tinh chế sẽ tạo mùi xạ của ambretolid, hiệu suất từ 0,2 - 0,6% (Leung và ctv, 1996)

2.1.6 Đặc điểm bột dược liệu

Bột lá hơi mịn, màu xanh Thành phần gồm mảnh mô mềm, lông che chở đơn bào, mảnh biểu bì (nhìn ngang) mang lỗ khí kiểu dị bào hay hỗn bào, mảnh mô mềm giậu (nhìn từ trên xuống), lông che chở đa bào hình sao, lông tiết, mảnh mạch xoắn

Bột rễ hơi mịn, màu nâu nhạt Thành phần gồm sợi, mảnh mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình cầu gai thước từ 12,5 - 25 µm, mảnh mô mềm chứa tinh bột, mảnh bần, hạt tinh bột kích thước to và nhỏ

Bột hạt mịn, màu trắng đục, có chấm đen Mảnh vỏ hạt, mảnh nội nhũ

2.2 Khái quát về nhân giống cây trồng in vitro

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên

Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô

có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm

2.2.2 Một số thành tựu về nuôi cấy mô

Thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục

Sau đó, năm 1938, Nobecourt nhận được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota Cùng năm 1938, White đã nuôi cấy được mô tượng tầng của cây thuốc lá lai Nicotiana glauca lai với N langsdorffi Năm 1949, Camus ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá

trình phân hóa ống mạch xảy ra trong khối mô Năm 1956, Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi Năm 1958 - 1959, Steward và Reinert đã sử dụng nước dừa vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từ tế bào cà

rốt nuôi cấy Tiếp theo có các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Brown và Thorpe, 1986)

Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro (Brown và Thorpe, 1986), cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy

và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua

sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ

2.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm như: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Đặc tính này giống như nhân giống vô tính Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt

So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất Việc trao đổi giống được dễ dàng

 Hạn chế:

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng phương pháp nuôi cấy mô Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thực tiễn hoặc bảo quản nguồn gen

Chi phí sản xuất cao: nuôi cấy mô đòi hỏi lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ

được đặc tính của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nuôi cấy, nhưng sau

đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài (Lê Văn Hoàng, 2010)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.2.4.1 Mẫu nuôi cấy

Murashige (1974), ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ

ra hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô Khi chọn lọc mẫu cần chú ý một số nhân tố bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu

Kiểu gen: kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Với loài thuốc lá

được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973), ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990), ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà

chua Lycopersycon esculentum Mill

Chọn cơ quan: Murashige (1974), cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có

khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác

nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt

Tuổi và sinh lý: tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu

nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già

Mẫu in vitro: trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in

vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn

ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986) Tuy nhiên, Lu và cộng sự (1991), ghi

nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng

Sức sống của mẫu: điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng

đến nuôi cấy in vitro Morel (1952, 1955), nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản

xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC Theo Murashige (1974), nhiệt độ

ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý

như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan

Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả

năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên hệ với

các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối (Papachatzi và ctv, 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970) Việc

nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002)

Quang kỳ và chất lượng ánh sáng:

Thời gian chiếu sáng: ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng Chất lượng ánh sáng: ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn

ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra

hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro

Các chất khí: thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh

trưởng cây in vitro O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi trường nuôi cấy Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô mẫu nuôi cấy

2.2.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh

Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu nuôi cấy Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc

có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường

Các thành phần chính: đường làm nguồn carbon, các muối khoáng đa lượng, các vitamin, các chất sinh trưởng Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: nước dừa, nước chiết nấm men

2.2.5 Những vấn đề trong nhân giống in vitro

Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro:

‐ Bị vi sinh vật huỷ hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường

‐ Bị virus hay thể giống như virus xâm nhiễm, không hại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau

Tuy nhiên có sự xâm nhiễm của vi sinh vật như Agrobacterrium, Bacillus và

Pseudomanas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hoại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia

Có thể làm giảm khả năng hoại mẫu bằng cách:

‐ Khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường

‐ Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh

2.2.5.3 Hiện tượng tiết chất gây độc từ mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro

Trong nuôi cấy in vitro, thường xuất hiện hiện tượng hoá nâu hay hoá đen mẫu,

ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của mẫu, ngăn chặn sự phát triển hoặc hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mô sẹo (Lê Văn Hoàng, 2010) Khi môi trường và mô cấy bị đổi màu quá mức thì absorbent được sử dụng Hai loại absorbent thông thường là polyvinylpyrrolidone (PVP) và than hoạt tính Nhưng một số nghiên cứu cho rằng nên sử dụng than hoạt tính (Yassen và ctv, 1995, Wann và ctv, 1997)

Nhiều phương pháp làm giảm sự hoá nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa học đồng ý như:

Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non

Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy

2.2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể

Thân, lá phồng to chứa nhiều nước, cây có dạng trong Đây là một dạng bệnh lý thường thấy khi cây được nuôi trong môi trường mà việc trao đổi khí giữa cây và môi trường bên ngoài bị dừng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây, đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy (Trần Văn Minh, 1999)

Một số phương pháp hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể:

Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong môi

trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao

Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy và tiếp xúc với mẫu cấy ít nhất

Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA

Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy

Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.2.6 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật

Sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã được khám phá ra cuối

thế kỷ 20 Trong đó chất Auxin là chất được khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là

các chất Gibbérellines và chất Cytokinin trong những năm 1950 Chất chất điều hòa sinh

trưởng thực vật hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) Chúng có tác dụng điều tiết

các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Tuy nhiên, các chất chất điều hòa

sinh trưởng thực vật chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng Chất

chất điều hòa sinh trưởng thực vật gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé

lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm

Mỗi một chất chất điều hòa sinh trưởng thực vật đều mang một chức năng riêng, nhưng

trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất Tuỳ mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau

2.2.6.1 Auxin

Auxin được khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đường cong của loài Coléoptiles họ Graminées Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh Trong nuôi cấy mô thường sử dụng: Indol acetic acid (IAA); Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4 - D Dichlorophenol acetic acid (2,4 - D); Indol butyric acid (IBA)

Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất (Trần Thị Dung, 2003)

2.2.7 Một số thành tựu về nuôi cấy mô cây dược liệu ở Việt Nam

Kỹ thuật nhân giống in vitro ở Đại học Huế cũng giúp bảo tồn và tạo ra nhiều cây

dược liệu Điển hình là cây qua lâu, một loài dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học

có giá trị như các loại protein có thể kháng virus Mẫu cây qua lâu để nhân giống được lấy

từ Vườn Quốc gia Bạch Mã rồi khử trùng, sau đó đưa vào môi trường dung dịch Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt tới 88% Cây con giống qua lâu đã được trồng phổ

biến trên đất thịt, cát cho tỷ lệ sống và năng suất cao Ngoài ra, kỹ thuật nhân giống in

vitro còn thành công với các cây dược liệu khác như nha đam cho tỷ lệ sống đến 75%; đặc

biệt là sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy

cây hà thủ ô đỏ

Năm 2009, Võ Châu Tấn và Huỳnh Minh Tư (thuộc khoa Sinh - Môi trường,

trường Đại học Sư Phạm – ĐHĐN) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật in

vitro Sau thời gian 2 năm thử nghiệm (2009 - 2011) với nhiều con đường phát sinh hình

thái khác nhau, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công “Quy trình nhân giống in vitro

cây ba kích tím” có nguồn gốc từ huyện Tây Giang Quảng Nam với chất lượng cây giống tốt, sạch bệnh Đặc biệt, nhóm nghiên cứu đã tiến hành trồng thử nghiệm, đánh giá khả năng thích nghi trên các điều kiện sinh thái khác nhau của loài cây này Kết quả cho

thấy, giống cây ba kích in vitro có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, thích nghi tốt

với điều kiện vùng gò đồi có độ dinh dưỡng thấp với hiệu quả kinh tế cao, một giải pháp phát triển kinh tế cho người dân ở các khu vực này, đặc biệt là đồng bào dân tộc thiểu số

Ngoài ra, còn có một số cây dược liệu đã được nhân giống thành công bằng

phương pháp in vitro như: cây sâm cau (là cây dược liệu với đặc tính chống ung thư có

nguy cơ tuyệt chủng được đăng trên tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Đà Nẵng số 6(47) năm 2011), cây sâm Ngọc Linh (Dương Tấn Nhựt, 2008), cây Lô Hội (Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang, 2008)

2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu cây vông vang trong và ngoài nước

Năm 2010, tác giả Trương Thị Đẹp và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng của cây vông vang BS Nguyễn Ngọc Tựng (2008) viết về những công dụng của cây vông vang và những bài thuốc có vông vang Ngoài ra còn có một số tác giả nước ngoài như: Nautiyal và Tiwari, 2011; Orwa và ctv, 2009

Về lĩnh vực nuôi cấy mô cây vông vang, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu vấn

đề này Năm 2005, Maheshwari và Anil Kumar đã thực hiện nghiên cứu về tái sinh chồi

cây vông vang bằng phương pháp in vitro Năm 2008, Renu Sharma và Anwar Shahzad,

trường đại học Aligarh Muslim, Ấn Độ đã nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tạo chồi cây vông vang Năm 2011, Ashish và cộng sự ở đại học R.T.M Nagpur, Ấn Độ,

đã nghiên cứu về khả năng tạo mô sẹo ở cây vông vang in vitro bằng cách sử sụng nồng

độ hormone khác nhau

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 15/1 - 15/6/2012 tại Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học, Sở Khoa học - Công nghệ Đồng Nai

3.2 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên hạt cây vông vang (Abelmoschus moschatus)

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế,

kệ đặt bình, đèn neon,…

Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai,lọ thuỷ tinh, đèn cồn…

3.3.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962)

Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lượng NH4NO3 1650

Vitamin myo - Inositol 100 Thiamin (B1) 0,1

Than hoạt tính 1 g/l Môi trường được điều chỉnh về pH 5,8 (± 0,1) bằng dung dịch KOH 1N và HCl 1N trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm (1210C) trong 20 phút

Điều kiện nuôi cấy in vitro: thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày; nhiệt độ 25  2oC;

Rửa hạt bằng xà phòng 30%, rửa lại dưới vòi nước sạch

Sau đó, chuyển mẫu vào chai đã hấp khử trùng Thêm vào 30mL cồn 700 và lắc trong

5 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất đã hấp khử trùng

Lắc javel (1:3, v/v) trong 15 phút Rửa lại 3 lần bằng nước cất đã hấp khử trùng

Nhúng cồn 900 và đốt nhanh dưới đèn cồn, thao tác lặp lại 2 hoặc 3 lần Dùng kẹp giữ chặt hạt trên giấy cấy, lấy dao cấy cắt 1 phần hạt ở đầu rễ mọc ra Cấy hạt vô chai thủy tinh chứa 30 ml môi trường MS + 10% nước dừa

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu đến khả năng nảy chồi của hạt vông vang

Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gieo 10 hạt Trong mỗi bình cấy một mẫu Mỗi chai chứa 30ml môi trường

Mục tiêu: xác định hiệu quả của mỗi phương pháp đến khả năng nảy chồi của hạt Vật liệu thí nghiệm: hạt vông vang

Thí nghiệm gồm 2 phương pháp:

A: cấy trực tiếp mẫu vừa khử trùng vào môi trường MS bổ sung 10% nước dừa

B: Ngâm hạt trong nước ấm 540C trước khi khử trùng, khử trùng mẫu và chuyển mẫu vào chai tam giác chứa bông ẩm đã hấp khử trùng Để qua đêm Sau đó cấy vào môi trường

MS bổ sung 10% nước dừa

Mỗi phương pháp gieo 10 hạt với 3 lần lặp lại ; tổng số mẫu hạt ở mỗi phương pháp là 30 hạt ; thời gian thí nghiệm 4 tuần

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ nảy chồi (%) = Tổng số hạt nảy mầm / Tổng số hạt cấy ban đầu

Tỷ lệ nhiễm (%) = Tổng số hạt bị nhiễm / Tổng số hạt cấy ban đầu

3.4.3 Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây vông vang

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại cấy 3 chai

3.4.3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng phát sinh

chồi của cây vông vang in vitro

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BA và NAA thích hợp cho quá trình phát

sinh chồi của cây vông vang in vitro, làm nguồn nguyên liệu cho quá trình vi nhân giống

Vật liệu thí nghiệm: chồi con in vitro mọc lên từ hạt vông vang đã được vô trùng

và nuôi cấy trong môi trường MS + 10% nước dừa ở nội dung 1 sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm gồm 15 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại

có 3 chai ; tổng số mẫu: 135 mẫu ; thời gian thí nghiệm: 4 tuần

Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng phát sinh

chồi của cây vông vang in vitro

Nghiệm thức Số mẫu BA(mg/l) NAA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi

Chiều cao chồi (cm) = Đo từ nách chồi bên đến đỉnh chồi

Hệ số nhân chồi = Tổng số chồi đếm được / mẫu cấy

3.4.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh chồi của cây vông

vang in vitro

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ thích hợp BA cho quá trình phát sinh chồi

của cây vông vang in vitro, làm nguồn nguyên liệu cho quá trình vi nhân giống tiếp theo

Vật liệu thí nghiệm: chồi con in vitro mọc lên từ hạt vông vang đã được vô trùng

và nuôi cấy trong môi trường MS + 10% nước dừa ở nội dung 1 sau 4 tuần nuôi cấy