nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây sâm nam núi dành

1.2.5 Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào 11 1.2.6 Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật 13 1.2.7 Ứng dụng của nhân giống in v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MINH HIỀN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY SÂM NAM NÚI DÀNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS ĐINH TRƯỜNG SƠN

2 PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hiền

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh và TS Đinh Trường Sơn, đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Viện Sinh học Nông nghiệp và Khoa Công nghệ Sinh học của Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn ông Vũ Văn Tĩnh, Giám đốc Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang, ông Trần Đình Dũng, Phó Giám đốc Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp thông tin, hạt giống và cây giống Sâm nam núi Dành để chúng tôi có thể thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 02 tháng 6 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hiền

1.2.5 Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào 11 1.2.6 Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật 13 1.2.7 Ứng dụng của nhân giống in vitro trong nhân giống cây thuốc và một

1.3 Một số kết quả nổi bật về nghiên cứu thành phần hoạt chất và nhân

giống vô tính in vitro một số loài thuộc chi Millettia 19

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng và

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và

2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và

2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi

2.2.5 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam

2.2.6 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành 26 2.2.7 Nghiên cứu sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành 28 2.2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng và

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và phát

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm nam

3.5 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam

3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp

3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của lớp

3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của lớp

3.6 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành 43 3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của

3.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA, αNAA và ABA đến sự

3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu nuôi cấy và nồng độ đường

đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành 47 3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3 đến sự phát sinh hình thái của

3.7 Nghiên cứu sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành 51 3.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi

3.7.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA và IBA đến sự hình thành rễ của

3.7.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp mỏng

DANH MỤC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến sinh trưởng và phát triển của cây

3.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của

3.3 Ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và phát triển của

3.4 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm nam

3.5 Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế

3.6 Ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế

3.7 Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào

3.8 Ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam

3.9 Ảnh hưởng phối hợp của BA, αNAA và ABA đến sự phát sinh hình

thái của callus Sâm nam núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy) 46 3.10 Ảnh hưởng của nguồn mẫu nuôi cấy và nồng độ đường đến sự phát sinh

hình thái của callus Sâm nam núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy) 48 3.11 Ảnh hưởng của AgNO3 đến sự phát sinh hình thái callus Sâm nam

3.12 Ảnh hưởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm nam

3.13 Ảnh hưởng của αNAA và IBA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm nam

3.14 Ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp mỏng tế bào

DANH MỤC HÌNH

1.3 Tiêu bản Callerya nitida (Benth.) Geesink tại vườn thực vật Kew ở

3.1 Cây Sâm nam núi Dành trong các môi trường nuôi cấy (sau 6 tuần

3.2 Sự tái sinh tạo callus của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

trên môi trường có bổ sung 2,4-D (sau 8 tuần nuôi cấy) 40 3.3 Các hình thái callus tái sinh từ lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành 41 3.4 Sự tái sinh tạo callus của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

trong môi trường có bổ sung BA (sau 8 tuần nuôi cấy) 43 3.5 Ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm

3.6 Callus Sâm nam núi Dành từ 3 nguồn mẫu khác nhau (sau 6 tuần

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

BA (6-BA) Benzyladenine (6-Benzyladenine)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong dân gian, sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loài cây mà củ và rễ được sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nước châu Á Chính vì vậy, có rất nhiều loài sâm thuộc nhiều chi, họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loài thuộc chi Sâm (Panax) Rất nhiều loại củ sâm có hình dáng hao hao giống hình người, đặc biệt là nhân sâm; do đó một số vị thuốc khác không thuộc chi, họ sâm nhưng có hình dáng củ tương tự cũng thường được gọi là sâm Thêm vào đó, sâm là một vị thuốc bổ nên nhiều vị thuốc khác có tác dụng bổ cũng được gọi là sâm hoặc gắn với chữ sâm Ở Việt Nam có nhiều loại thảo dược có tên sâm được sử dụng từ rất lâu đời nhưng với công dụng khác nhau

Sâm nam núi Dành - một loại sâm quý là sản vật tiến vua trong các triều đại phong kiến xưa, hiện đang được nhân dân trong vùng thường dùng trong các bài thuốc dân gian có thể chữa được rất nhiều bệnh Trong sách “Đại Nam nhất thống chí” có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế Cát sâm sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn…” Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là núi Dành thuộc 2 xã Việt Lập và Liên Chung, huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang Ngoài tên Sâm nam núi Dành, cây sâm này còn

có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn (Kim Sa, 2012)

Tuy nhiên, việc nhân giống Sâm nam núi Dành trong tự nhiên gặp rất nhiều khó khăn, hầu hết các hạt đem gieo đều không nảy mầm, khi giâm cành cho tỷ lệ sống thấp, lại là giống sâm quý bị nhiều người săn tìm Do đó, Sâm nam núi Dành còn lại rất ít và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng Từ năm 2009, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang đã thực hiện đề

án nhân giống loại sâm quý này tại chính các gia đình đang sống ở khu vực núi Dành, đến nay bước đầu đã cho kết quả khả quan Mặc dù vậy, những kết quả điều tra thực tế của chúng tôi cho thấy số lượng cây Sâm nam núi Dành nhân ra được chưa tới một ngàn cây Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Sâm nam núi Dành” nhằm

góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh cây giống, bảo tồn và phát triển giống Sâm nam núi Dành

- Tạo được nguồn vật liệu ban đầu (tạo cây in vitro sạch vi sinh vật)

- Xác định được phương thức và môi trường nuôi cấy phù hợp trong giai đoạn nhân nhanh chồi

- Xác định môi trường phù hợp trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Giới thiệu về cây Sâm nam núi Dành

Hình 1.1 Hoa và quả Sâm nam núi Dành

Hình 1.2 Củ Sâm nam núi Dành

(Hình ảnh được cung cấp bởi tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học

Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang)

Thông thường, để có thể có được phương pháp nghiên cứu cũng như cách

tiếp cận hợp lý nhằm xây dựng được quy trình nhân giống in vitro thì việc tham

khảo các công trình công bố có liên quan là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, Sâm nam núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu ở Việt Nam Chính vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu trong nước là vô cùng hạn chế Thêm vào đó, bản thân cây Sâm nam núi Dành cũng chưa được phân loại thực vật Do vậy, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước càng thêm khó khăn Trước tình hình đó, chúng tôi tiến hành điều tra và sơ bộ phân loại thực vật cây Sâm nam núi Dành nhằm mục đích định hướng nghiên cứu cho có hiệu quả hơn

1.1.1 Điều tra cây Sâm nam núi Dành ngoài tự nhiên

Sâm nam núi Dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang, trong đó có bài “Săn lùng sâm quý tiến vua” trên báo điện tử An ninh Thủ

Đô ra ngày 30/8/2012, tác giả lấy bút danh là Kim Sa Chúng tôi đã tìm gặp tác giả Trần Đình Dũng và đến núi Dành trực tiếp điều tra, tìm hiểu sự tồn tại với những câu chuyện về tác dụng của cây Sâm nam núi Dành tại gia đình ông Lư, ông Đông, ông Cẩm và ông Thành, những gia đình trồng Sâm nam núi Dành có tiếng ở vùng Kết quả điều tra (bảng phụ lục 2) cho thấy, do Sâm nam núi Dành là một giống sâm quý, bị nhiều người săn tìm, lại khó nhân giống ở ngoài tự nhiên nên một thời gian dài người dân ở khu vực núi Dành không còn nhìn thấy cây sâm Cách đây gần hai chục năm, ông Nguyễn Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung, huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang trong một lần cuốc đất trồng rừng tại núi Dành đã cuốc phải những củ nhỏ có mùi thơm, ông nếm thử thấy ngọt mát, vốn là gia đình

có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết đó là sâm nam và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ Cũng theo ông Lư, loại sâm này phải có từ trên 10 năm tuổi dùng mới có tác dụng tốt Từ gốc sâm ban đầu, ông Lư đã nhân ra và hướng dẫn một số

hộ dân khác trồng để giữ giống

Sâm nam núi Dành còn có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn Trung tâm khoa học công nghệ và môi trường huyện Tân Yên (Bắc Giang) đã thực hiện

Đề án để nhân giống loại sâm quý này từ năm 2009 tại chính các gia đình đang sống

ở núi Dành Tuy nhiên, hệ số nhân giống rất thấp Hiện tại (năm 2015), làng Hậu có khoảng 100 gốc sâm 3 lá và làng Đầm Sen, xã Việt Lập có trên 600 gốc sâm 5 lá

Từ xa xưa người dân trong vùng đã coi Sâm nam núi Dành như một loại thần dược dùng để chữa bệnh và bồi bổ sức khỏe Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu khoa học cụ thể nào khẳng định điều này Chính vì vậy, cần có những nghiên cứu, đánh giá đồng thời tìm cách nhân giống để bảo tồn và phát triển loại thảo dược quý này

1.1.2 Sơ bộ phân loại thực vật cây Sâm nam núi Dành

Mô tả:

* Đặc điểm hình thái

Cây Sâm nam núi Dành là cây nhỡ leo, dài 1,5 - 5m hay hơn, cành non phủ

lông dày màu nâu nâu

Lá kép lông chim, lá chét 3 - 7, hình bầu dục dài hay trái xoan, dài 3 - 8 cm, rộng 1 - 3 cm, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh xám nâu; gân bên 5 - 6, dính nhau ở gần mép lá (Hình 1.1)

Hoa sâm có màu trắng ngà, mùi thơm nhẹ, mọc thành chùm kép ở đầu cành tạo thành chùy dài 10 - 20 cm, cuống có lông Đài 5 mảnh dính với nhau, tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang nhị và nhụy Nhị

10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả (Hình 1.1) Quả hình quả đậu dẹt, có lông mềm, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ Hạt không có nội nhũ, phôi cong,

2 lá mầm dầy và lớn chứa nhiều chất dinh dưỡng

Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt (Hình 1.2)

Công thức hoa: K(5)C5A(9)1G1

* Đặc điểm sinh thái:

Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân và mùa hè Mùa hoa vào tháng 6 - 9, mùa quả vào tháng 9 - 12

Cây mọc hoang ở vùng rừng núi chỗ dãi nắng, trong rừng thưa, trong lùm

cây bụi, ở độ cao 100 – 350 mét, thường leo trùm lên những cây bụi và cây gỗ nhỏ Theo người dân ở khu vực núi Dành kể lại, Sâm nam núi Dành tái sinh chủ yếu bằng chồi sau khi đổ đất vào đốt của thân cây hoặc sau khi cắt lấy rễ củ, phần gốc lấp đất vào là cây có thể tái sinh Cây ưa đất ẩm mát, thành phần cơ giới trung bình, nhiều mùn, tơi xốp và không chịu được đất bị úng

Qua mô tả kết hợp với so sánh hình thái cũng như tham khảo ý kiến chuyên gia là những nhà Thực vật học, chúng tôi kết luận cây Sâm nam núi Dành là một loài cây thuộc Họ đậu

Hình 1.3 Tiêu bản Callerya nitida (Benth.) Geesink

tại vườn thực vật Kew ở nước Anh

Kết hợp mô tả với so sánh hình thái thân, lá, hoa, quả, hạt… cho thấy cây

Sâm nam núi Dành có rất nhiều nét tương đồng với loài Callerya nitida Bên cạnh đó, khi so sánh với hình ảnh phân loại các cây thuộc chi Millettia, chúng

tôi cũng thấy có rất nhiều nét tương đồng của cây Sâm nam núi Dành với một

số loài thuộc chi này Các chi Callerya Endl được tách ra từ chi Millettia bởi

Geesink (1984) và Schot (1994) dựa trên hình dạng của cụm hoa Thêm vào đó,

có một số chi khác trong

Tông (tribus) Millettieae

cũng có cụm hoa có hoa

hình chùy Chính vì vậy,

việc phân loại giữa các loài

thuộc Tông Millettieae

thường khó khăn

Từ những kết quả

quan sát và so sánh trên, do

không có được tiêu bản

chuẩn của các loài nên cho

đến bây giờ chúng tôi chỉ

khẳng định Sâm nam núi

Dành có thể thuộc chi

Millettia hoặc chi Callerya Tuy nhiên, cần nghiên cứu kĩ hơn nữa để có thể đưa ra

kết luận chính xác tên loài của cây Sâm nam núi Dành

Cây Sâm nam núi Dành có phân loại khoa học như sau:

PHÂN LOẠI KHOA HỌC:

Giới: Plantar (Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật hạt kín – Ngọc lan)

Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm thực sự - Ngọc lan)

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng)

Bộ: Fabales (Bộ đậu)

Họ: Fabaceae (Họ đậu)

Phân họ: Faboideae (Phân họ đậu)

Chi: Millettia (Chi thàn mát) hoặc Callerya (Chi thàn mát lưỡng thể)

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

1.2 Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng, bao gồm:

Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

Nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, noãn chưa thụ tinh)

Nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trưởng thành)

Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào) (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

1.2.2 Cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902 Theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trong đó, sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào

có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào như sơ đồ sau:

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới còn một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Nguyễn Như Khanh, 2006)

1.2.3 Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro

Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn

mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Các giai đoạn này

cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Mẫu cấy phù hợp nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá Ngoài ra, người ta cũng có thể sử dụng hạt làm

nguồn mẫu để nuôi cấy khởi động tạo cây in vitro

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định hay tạo phôi

vô tính Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích

hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung: môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 - 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây, khối lượng tươi); có giá thể tiếp nhận

cây in vitro thích hợp, giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước; có thể chủ động điều chỉnh

được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Lê Văn Hoàng, 2007)

1.2.4 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính Theo

khái niệm chung về dòng vô tính trong chọn giống thì dòng vô tính là một nhóm

cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính Các dòng vô tính này có thể được tạo ra theo các phương thức sau:

* Tái sinh cây trực tiếp

Là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh (Bhojwani, 1980) Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các

điểm sinh trưởng phụ sau đó tái sinh thành cây con Xác suất biến dị và đột biến thường cao hơn so với tái sinh từ đỉnh sinh trưởng (Đỗ Năng Vịnh, 2002)

* Tái sinh gián tiếp

Mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp có chứa auxin và cytokinin

có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức Đó chính là các tế bào mô sẹo Sự tăng sinh của các tế bào callus có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên,

tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma Từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo

Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy; vì chính các yếu tố này quyết định đường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây giống thu được

1.2.5 Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp nhân giống vô tính Đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao mà gặp

khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là

công cụ vô cùng hữu ích Trên thực tế, nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính

bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro; vì khi

nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và khả năng tích lũy các thành phần hoá học (Bammi and Randhava, 1975) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp; vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ như đối với các

cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất Cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến 11,3%, hàm lượng lynalyl acetat từ 11% đến 78%; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Staritsky, 1970)

Đối với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như ô dầu, bạch thược có hạt nảy mầm chậm; đan sâm thì hạt chín không đều và thời gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà Các cây tam thất, nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu hoạch đến đâu cần gieo ngay đến đó, gây nhiều khó khăn cho sản xuất… (Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Chương, 1980) Mặt khác, phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu rất phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: xuyên khung 2 - 5 cây/cây mẹ (Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Chương, 1980), chuối là 2 - 3 cây/cây mẹ (Đoàn Thị Ái Thuyền và cs., 1993) Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém

Để khắc phục những nhược điểm trên, nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học to lớn thực sự Việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ làm cho mô nuôi cấy

dễ phân hóa và dễ tái sinh hơn Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà

các phương pháp khác không có được: Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường),

hệ số nhân rất cao và cho các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền Kỹ

thuật nhân nhanh in vitro có thể được ứng dụng vào các mục đích như duy trì và

nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống; nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt; duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác; nhân nhanh kết hợp làm sạch virut; bảo quản tập đoàn gen (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

1.2.6 Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.6.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một vấn đề cần thiết vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh mang rất nhiều vi sinh vật Tuy nhiên, mức độ nhiễm và đặc điểm của từng loại mẫu là khác nhau Do đó, ta cần

có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều nhất

mà tốn ít nguyên liệu ban đầu

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ, thời gian

xử lý và mức độ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ và những phần gồ gề trên bề mặt của mô cấy Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70% trong 30 giây hoặc sử dụng tween nhằm làm giảm sức căng bề mặt mẫu, sau đó mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng Đối với các mẫu quá bẩn, việc rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn có trong mẫu cấy (Bhojwani, 1980)

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại

bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm khuẩn

Sau khi khử trùng, mẫu cấy được đặt vào các môi trường nuôi cấy; từ đây

giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh

hưởng quyết định tới quá trình nuôi cấy

1.2.6.2 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các

bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất

cả các ion khoáng cần thiết; nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin; nguồn các bon cố định và nước Các yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp suất thẩm thấu cũng phải được duy trì trong giới hạn cho phép

Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần Ba hợp phần

của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc dù nồng

độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp (Vũ Văn Vụ, 1999)

* Các nguyên tố đa lượng

Nitơ, phốt pho, kali, magie, canxi và lưu huỳnh là cần thiết và thay đổi theo đối tượng nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy, nồng độ các nguyên tố này khoảng trên 30 mg/l và được cung cấp dưới dạng muối vô cơ Nó có mặt trong các hợp chất quan trọng (protein, diệp lục, axit nucleic…), tham gia vào các quá trình: điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp và quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào…

Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi Nitơ được

sử dụng ở 2 dạng là NH4+ và NO3- riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau Điều đáng lưu

ý là nếu chỉ dùng NH4+ thì sinh trưởng của tế bào giảm hoặc ngừng hoàn toàn Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào bị lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH của môi trường Cụ thể, khi chỉ dùng NO3-, độ pH của môi trường tăng dần và khi chỉ dùng NH4+ thì độ pH của môi trường giảm dần do tế bào hấp thụ chúng và thải ra ngoài môi trường loại ion có giá trị tương đương

Lưu huỳnh: chủ yếu và tốt nhất là dùng dạng muối SO42- còn các dạng khác thường kém tác dụng, thậm chí còn độc

Phốt pho: Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu phốt pho rất cao Nó không chỉ là một trong những thành phần cấu trúc của tế bào mà khi phot pho ở dạng H2PO4- và HPO42- còn có tác dụng như một hệ đệm làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy (Nguyễn Văn Uyển, 2000)

* Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường không thể thiếu nếu muốn tác động đến các con đường phát triển của tế bào thực vật Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các phytohoocmon hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng Trong 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng của thực vật là auxin, giberellin, cytokinin, etylen và axit abcicic thì auxin và cytokinin là hai chất

được sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy in vitro

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử Trong

nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân chia và

giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi…(Hoàng Minh Tấn và cs., 2004)

Auxin được chia thành hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau Trong đó, auxin tự nhiên quan trọng nhất là IAA nhưng nó chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy vì IAA không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA, αNAA, picloram…(Vũ Văn Vụ, 1999)

• Nhóm cytokinin có tác dụng tích cực trong việc kích thích sự phân chia

và ảnh hưởng tới sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ

ưu thế ngọn (Hoàng Minh Tấn và cs., 2004)

Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Vũ Quang Sáng, 2005) Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BA được sử dụng nhiều hơn trong nuôi cấy mô

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 1999) Do vậy, khi

sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô cần đặc biệt lưu tâm tới vấn đề này Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển, 1985)

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong

nuôi cấy in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh (Võ Châu Tuấn, 2014) Zhao và cs

(2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và αNAA phối hợp với BA ở các nồng

độ khác nhau lên sinh trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết

(Saussurea medusa) Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BA với

2,4-D thì không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng, khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp giữa BA với αNAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận

với sự gia tăng nồng độ của αNAA (Zhao, 2001) Mô của cây cà trái vàng (Solanum

xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì cây tích lũy solasodine nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì cây lại không tích lũy được chất này (Narayanaswany, 1994)

* Nguồn cacbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo phương

thức dị dưỡng Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ

là điều bắt buộc Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của

tế bào Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất (Zhong and Yoshida, 1995) Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 – 40 g/l Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là nguồn carbon tốt nhất; trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose, galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) Ảnh hưởng của nồng độ sucrose

trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam thất (Panax

notoginseng) Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/l, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60 g/l thì dường như

ức chế sự sinh trưởng của tế bào (Sheper, 2001) Môi trường có chứa 30 g/l sucrose hoặc phối hợp giữa đường sucrose (15 g/l) và glucose (15 g/l) là thích hợp

nhất cho sinh trưởng của tế bào (Gunter and Ovodo, 2003)

* Chất hữu cơ bổ sung

Gồm có vitamin và amino acid Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ

và cs., 2007) Mặc dù cây in vitro có thể tự tổng hợp vitamin, nhưng không đủ

cho nhu cầu nên phải bổ sung thêm vào môi trường như B1, B6, myoinositol…Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái Amino acid thường được sử dụng là glysine ngoài ra arginine, asparagine, aspartic acid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết

* Một số thành phần khác

Tùy thuộc vào loài cây mà một số môi trường còn được bổ sung thêm các thành phần khác như than hoạt tính, nước cốt dừa, dịch chuối, khoai tây… để thay thế cho nguồn cacbon hữu cơ hoặc chất điều tiết sinh trưởng giúp làm tăng sự phát

triển của mô sẹo hay cơ quan của cây

1.2.6.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy

* Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường; nhưng ánh sáng là cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy mà yêu cầu cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng khác nhau, nuôi cấy mô sẹo thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động lên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như dinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy, người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14 – 16 giờ/ngày với

cường độ 2000 lux

* Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C Tuy nhiên, tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù

tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có

ý nghĩa Nó cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia hay sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác động tới cấu trúc

của các chất điều tiết sinh trưởng như IAA, IBA…

* pH môi trường

pH môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái

lý, hóa của các chất trong môi trường Do đó, nó ảnh hưởng tới khả năng điện li của các muối, sự thủy phân các hóa chất…Tùy từng loại cây nuôi cấy mà điều chỉnh pH môi trường về giá trị thích hợp pH thích hợp cho đa số các loại cây dao động từ 5,5 - 6,0 pH cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng, nếu thấp hơn 5,0 thì

agar khó đông

* Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường thạch đông, thạch lỏng (bán lỏng hoặc lỏng) Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng Tuy nhiên, môi trường lỏng cũng gây ra hiện

tượng thủy tinh hóa, cây biến dạng Khả năng ngậm nước của thạch khá cao Nồng

độ của thạch dùng trong nuôi cấy thường dao động từ 6 – 12 g/l môi trường

1.2.7 Ứng dụng của nhân giống in vitro trong nhân giống cây thuốc và một số loại cây trồng khác

Khi lĩnh vực sản xuất giống cây trồng được thực hiện trên quy mô công

nghiệp thì phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được khai thác và sử dụng

một cách triệt để Có rất nhiều loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng được nhân nhanh bằng phương pháp này Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra

26 vạn cây cam thảo trong năm tháng chỉ từ một lát cắt ban đầu (Chaturvedi and Sinha, 1979) Ở Việt Nam, đối với khoai tây đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng

1 năm (Mai Thị Tân và cs., 1993); hệ số nhân giống của cây hà thủ ô đỏ là 105/ năm; cây trinh nữ hoàng cung có hệ số nhân giống vô tính truyền thống là 6 - 7 cây/năm

nhưng khi nhân bằng phương pháp in vitro thì hệ số này có thể lên tới 2 x 35 cây từ một lát cắt của củ giống (Tạ Như Thục Anh, 2002) Đặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10 - 15 năm mới cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt, nhưng khi áp

dụng nhân nhanh in vitro cho đối tượng này, người ta có thể cung cấp được 500.000

cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970)

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng (Limasset and Cornel, 1949), riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952) Nguyên nhân của hiện tượng này là đỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập; đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus; quá trình phân chia tế bào phôi sinh (đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus

Nuôi cấy mô tế bào có thể được dùng để phục tráng, làm sạch bệnh và nhân nhanh theo các hướng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo Qua nuôi

cấy in vitro, tế bào được trẻ hoá do vậy có thể tạo được những cây con có tuổi

sinh lý trẻ hơn, làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Murashige, 1980) Những kỹ thuật này ở nước ngoài đã được áp dụng trên nhiều loại cây trồng như cây thuốc địa hoàng ở Trung Quốc, Hàn Quốc; bạch truật ở Nhật Bản…

Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro với các ưu thế về hệ số nhân

giống, tiềm năng công nghiệp hoá cao và tính khả thi rộng đã thực sự trở thành công cụ cần thiết trong công tác giống cây trồng

1.3 Một số kết quả nổi bật về nghiên cứu thành phần hoạt chất và nhân giống

vô tính in vitro một số loài thuộc chi Millettia

Millettia nitida Benth var hirsutissima Z Wei là một loại thảo dược lâu năm

được phân bố tại các tỉnh Giang Tây và Phúc Kiến, Đông Nan Trung Quốc Trong y học dân gian Trung Quốc, nó được sử dụng để điều trị đau bụng kinh, kinh nguyệt không đều, đau khớp, đau nhức, cũng như tê liệt (Cui and Chen, 2002) Các nghiên cứu

dược lý cho thấy Millettia nitida Benth var hirsutissima Z Wei có thể phục hồi chức

năng gan bằng cách thúc đẩy sự sao chép DNA của tế bào gan (Xu et al., 1990) Chiết xuất thảo mộc này cũng có tác dụng hạn chế các gốc tự do (Yu et al., 2007) Thành phần flavonoid thường được coi như là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học

của Millettia nitida Benth var hirsutissima Z Wei (Atmani et al., 2009) Tổng cộng

đã phân tích được 32 flavonoids, trong đó có 10 isoflavones, 3 chalcone, 5 flavanone, 1 pterocarpan, 2 flavans và 11 glycosides flavonoid (Min et al., 2012)

Ở liều thấp, genistein (15mM) là hợp chất được chiết xuất từ Millettia

nitida Benth var hirsutissima Z Wei cho tác dụng ức chế và giảm sự tăng sinh tế

bào ung thư dạ dày trong cơ thể, làm cơ sở để sử dụng genistein trong việc điều trị các bệnh nhân bị ung thư dạ dày (Weifeng al., 2014)

Millettia speciosa là một cây thuốc thuộc Họ đậu, có nguồn gốc Đông Nam

Á, gốc và rễ của cây này đã được áp dụng trong nhiều thế kỷ trong y học cổ truyền

Trung Quốc để điều trị viêm khớp dạng thấp (Zong et al., 2009) Trong các bài

thuốc dân gian, rễ của cây này cũng được sử dụng để nấu canh, làm thuốc bổ và rượu bổ (Li et al., 2010)

Millettia speciosa rất hữu ích trong việc thúc đẩy tuần hoàn máu hoặc làm giảm tắc nghẽn mạch Rễ dùng để điều trị đau hoặc tê ở cổ tay, đầu gối, hoặc các khớp khác và kinh nguyệt không đều Gần đây, người ta mới xác định được hai loại saponin mới - oleanane, cùng với hai pterocarpans Trước đó, sáu glycosides phenolic đã được phân lập và cấu trúc của chúng đã được xác định, bao gồm ba hợp chất mới là millettiaspecoside A, millettiaspecoside B, millettiaspecoside C và

ba hợp chất đã được biết đến là khaephuoside B, seguinoside K, albibrissinoside B (Ting et al., 2007)

Các nghiên cứu về kỹ thuật chiết xuất cũng như hoạt tính dược học của

polysaccharide từ Millettia speciosa Champ ở Trung Quốc cho thấy, đây là một

loại cây có thể được sử dụng với mục đích kép là sử dụng như thực phẩm và thảo dược Trong nghiên cứu này, các đặc tính lý hóa chính của polysaccharide và các cấu trúc của chúng đã được xác định Tác dụng dược lý của nó trong việc chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư đã được nghiên cứu Các thành phần có hiệu

quả chính của Millettia speciosa Champ là các hợp chất hòa tan, trong đó có nhiều polysaccharides hòa tan trong nước Có 19 loại nguyên tố trong Millettia

speciosa Champ đã được xác định trong đó có các nguyên tố Ca, K, Mg, Al, Fe và

Mn Thành phần các nguyên tố đó trong polysaccharide lần lượt là 39,45% C, 6,27%

H, và 0,49%N Các polysaccharide của Millettia speciosa Champ rất đáng được khai

thác và sử dụng, do chúng là một loại sản phẩm tự nhiên với nhiều loại hoạt dược lý

và có chức năng chăm sóc sức khỏe tốt

Nghiên cứu về thành phần hóa học có trong rễ của Millettia speciosa cho thấy, năm hợp chất được chiết xuất bằng 95% EtOH của Millettia speciosa và cấu

trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bao gồm: Isoliquiritigenin (i), Maackiain (ii), Pterocarpin (iii), Medicarpin (iv) và Homopterocarpin (v) (Zong et al., 2009)

Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô Millettia speciosa Champ kết quả

là với môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA thì tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100% Sau khi cấy 20 ngày, các chồi nách bắt đầu nảy mầm

và phát triển bình thường Với môi trường nhân nhanh là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân đạt 7,0, sự sinh trưởng và phát triển của chồi là bình thường Môi trường tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất là 1/2MS + 0,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra rễ đạt 80%, chất lượng rễ tốt

nhất (Huang et al., 2008)

Pan và cs (2010) sử dụng các đoạn thân cây non của Millettia speciosa

Champ để làm mẫu cấy để khử trùng và kết luận là mẫu cấy khử trùng trong 15 phút với 0,1% HgCl2 là thích hợp nhất Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l αNAA Các chồi nách ở thân có thể tái sinh tạo chồi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm với 2,0 và 2,5 mg/l 6-BA, nhưng tỷ

lệ tái sinh tạo chồi cao nhất chỉ đạt 78,6% Môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi nách là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,05 mg/l αNAA, hệ số nhân là 4,0 - 5,0 sau khi nuôi cấy trong 30 ngày Tỷ lệ ra rễ của chồi đạt 66,7% trên môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l αNAA + 2,5 mg/l IBA và tỷ lệ sống của cây đạt 85% sau 30 ngày ở giai đoạn vườn ươm khi cây giống cấy mô được trồng trên giá thể là hỗn hợp chất đất và cát ở tỷ lệ (3:1) (Pan et al., 2010)

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây Sâm nam núi Dành Đến nay, cây Sâm nam núi Dành chưa được phân loại thực vật Tuy nhiên, dựa trên các đặc điểm hình thái về lá, thân, rễ, hoa, quả, màu sắc lá, củ… kết hợp với tra cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy Sâm nam núi Dành có rất nhiều đặc điểm sinh

học cũng như công dụng chữa bệnh giống với các cây dược liệu thuộc chi Millettia hoặc chi Callerya, loại dược liệu thuộc Họ đậu (Fabaceae) rất có giá trị đã được

nghiên cứu và ứng dụng ở một số quốc gia

* Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu thực vật: hạt Sâm nam núi Dành

Các loại hóa chất và thiết bị phục vụ cho nghiên cứu:

- Tủ sấy

- Nồi hấp vô trùng

- Box cấy vô trùng

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

* Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông

nghiệp Việt Nam

* Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2014 đến tháng 6 năm 2015

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Sâm nam núi Dành

Môi trường nuôi cấy cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho mẫu cấy Sâm nam núi Dành là một loại cây dược liệu mới chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu trên 5 loại môi trường nhằm tìm ra môi trường nền thích hợp nhất Các môi trường chỉ khác nhau ở thành phần khoáng đa lượng, còn khoáng vi lượng và vitamin lấy theo môi trường MS Sucrose: 30 g/l; Agar: 5,5 g/l Công thức thí nghiệm như sau:

Công thức Loại môi trường

Công thức Thành phần môi trường

Môi trường nền Đất núi Dành (g/l)

+ Sucrose: 30,0 g/l + Agar: 5,5 g/l

Bốn thí nghiệm trên được thực hiện với nguồn mẫu ban đầu là các đoạn

thân chứa mắt ngủ của chồi Sâm nam núi Dành in vitro

2.2.5 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

Nguồn mẫu là lá Sâm nam núi Dành in vitro, lá được cắt ngang gân chính

với độ dày từ 1- 2 mm và đặt úp trên môi trường nuôi cấy

2.2.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng

tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

2.2.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng

tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

Công thức thí nghiệm:

Môi trường nền αNAA (mg/l)

ĐC

DCR + Sucrose: 30,0 g/l

2.2.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

Công thức thí nghiệm:

Môi trường nền BA(mg/l)

2.2.6 Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

Để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus, đề tài tiếp tục cấy chuyển callus sang các môi trường nuôi cấy có nồng độ đường khác nhau, có

bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng như picloram, BA, αNAA, axít abscisic (ABA), AgNO3 và theo dõi sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

2.2.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

Công thức thí nghiệm:

ĐC

DCR + Sucrose: 30,0 g/l

ABA (mg/l)

ĐC

DCR + Sucrose: 30,0 g/l

BA (mg/l)

αNAA (mg/l)

CT1

M1 (DCR + 0,5 mg/l 2,4-D) DCR

2.2.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO 3 đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

2.2.7 Nghiên cứu sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành

Nguồn mẫu cấy là chồi ngọn Sâm nam núi Dành in vitro

2.2.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành

Công thức thí nghiệm:

Môi trường nền αNAA (mg/l)

ĐC

DCR + Sucrose: 30,0 g/l

Công thức Thành phần môi trường

Môi trường nền IBA (mg/l) αNAA (mg/l)

+ Sucrose: 30,0 g/l + Agar: 5,5 g/l + Đất núi Dành: 20,0 g/l

lá Sâm nam núi Dành in vitro Công thức thí nghiệm như sau:

ĐC

DCR + Sucrose: 30,0 g/l

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hiện hành (Pierik, 1997; Roberta, 2013)

2.3.1 Khử trùng mẫu và tạo nguồn mẫu ban đầu từ hạt

Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này

cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt Các bước tiến hành:

- Hòa 1 viên Presept trong 0,5 lít nước cất tạo thành dung dịch khử trùng (Viên Presept có thành phần: Natri dichloroisocyanutrale khan: 50%; Adipic acid 22,5%; Thành phần khác: 27,5% Tác dụng: diệt khuẩn nhanh, phổ tác dụng rộng

có tác dụng đối với tất cả các loại vi khuẩn sinh dưỡng, nấm, virus và nha bào)

- Cho hạt vào bình, đổ dung dịch khử trùng vào bình sao cho hạt ngập dưới dung dịch khoảng 2 - 3 cm rồi lắc liên tục trong 7 phút

- Đổ bỏ toàn bộ lượng nước khử trùng

- Làm lại bước 2 và 3, sau đó tráng lại hạt bằng nước cất vô trùng 5 lần

- Cấy hạt vào ống nghiệm Môi trường gieo hạt: MS, agar 5,5 g/l, 10 ml/ống Nuôi ở nhiệt độ: 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng là 2500 lux, thời gian nuôi là 8 tuần

2.3.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn (Complete Randomized Design) Đoạn thân mang mắt ngủ hoặc chồi ngọn được cấy vào 10 - 15 bình, mỗi bình 1 mẫu, lặp lại 2 – 3 lần Với nguồn mẫu là callus hoặc mô lá thì mỗi công thức cấy 5 - 7 bình, mỗi bình 5 mẫu, lặp lại 2 - 3 lần Thể tích môi trường là 65ml/bình thủy tinh 250 ml Điều chỉnh giá trị pH = 5,8 - 6,0 và bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng trước khi hấp khử trùng ở 121oC, trong 20 phút

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy

- Ánh sáng: ánh đèn huỳnh quang với cường độ từ 2000 - 2500 lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày

- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 25 ± 20C

Hệ số nhân chồi (lần) =

Tổng số chồi tạo thành Tổng số mẫu theo dõi

Chiều cao chồi (cm) =

Tổng chiều cao các chồi theo dõi

Tổng số chồi theo dõi

Số lá (lá/chồi) =

Tổng số lá của các chồi theo dõi

Tổng số chồi theo dõi

Tỷ lệ tạo rễ (%) =

Tổng số mẫu tạo rễ

x 100 Tổng số mẫu theo dõi

Số rễ (rễ/mẫu)

=

Tổng số rễ các mẫu theo dõi

Tổng số mẫu theo dõi

Quan sát hình thái: rễ, thân, lá, callus…

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel và InfoStat