XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Nghiên cứu thực hiện dựa trên việc xác định môi trường phù hợp cho hạt nảy mầm, nồng độ khoáng đa lượng của môi trường MS phù hợp với cây nắp ấm, ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tạo chồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Sinh viên thực hiện : HUỲNH PHƯỚC Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 06/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành cám ơn

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ

môn Công nghệ sinh học, thầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý

thầy cô truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học và làm đề tài

Cô Tôn Trang Ánh và cô Tô Thị Nhã Trầm đã giúp đỡ cũng như đã chỉ dẫn em

trong khi thực hiện đề tài tốt nghiệp

Các bạn của lớp DH09SH, bạn Nguyễn Thị Nhật Lệ, Lê Thị Ngân Hà, Nguyễn

Hoàn Nguyên, cùng các bạn làm đề tài ở bộ môn đã giúp đỡ mình trong thời gian qua

Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn

tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Huỳnh Phước

TÓM TẮT

Cây nắp ấm (Nepenthes mirabilis Druce) là một trong các loài cây ăn thịt phổ

biến ở Việt Nam Cây có gân lá kéo dài thành tua cuốn, phần cuối tua hình thành ấm nhiều màu sắc, có chức năng chính là bắt côn trùng Cây có giá trị về kinh tế và y học Việc vi nhân giống cây nắp ấm nếu thành công sẽ mang lại lợi nhuận cao

Nghiên cứu thực hiện dựa trên việc xác định môi trường phù hợp cho hạt nảy mầm, nồng độ khoáng đa lượng của môi trường MS phù hợp với cây nắp ấm, ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tạo chồi ở cây, nồng độ than hoạt tính phù hợp cho cây phát triển và ảnh hưởng của 2,4-D, BA lên sự tạo sẹo

Kết quả cho thấy hạt nảy mầm thuận lợi trên môi trường 1/2MS bổ sung 60g đường với tỉ lệ nảy mầm đạt 72,3 % Môi trường 1/2MS là thích hợp nhất cho sự phát triển của cây nắp ấm, chiều dài thân đạt 0,76 cm Cụm chồi được phát sinh trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,1 – 0,5 mg/l NAA sau 60 ngày nuôi cấy với số chồi là 3,73 và 4 Than hoạt tính với nồng độ 1mg/l + 1/2MS cho ấm to, đẹp với 4,3 ấm, trong khi đó môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,3 - 0,5 g/l than hoạt tính thích hợp với sự phát sinh chồi đạt 4,3 – 3,5 chồi Sẹo hình thành từ lá ở môi trường 1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1,5 – 2,0 mg/l BA với tỉ lệ là 67% và 80%

SUMMARY

The thesis: In vitro mutiplication of Nepenthes mirabilis Druce

The Pitcher Plant (Nepenthes mirabilis) is the very popular carnivoruos plants

in Vietnam The tip of tendril, which is created from its midribs, will develop into many colourful pitcher The primer aim of pitcher is catching insect Picher plant has a high economic value and be used for medication If the micropropagation of nepenthes is success, it will make a more benefit in economy

The study is about selection of medium, that’s accord for seeds germination Influence of different strengths of MS to nepenthes’s generation, effect of NAA, BA and 2,4-D in multiplication shoot and callus induction

The in vitro seed germination show that a haft-stregth Murashige and Skoog

(1962) media formulation with high sucrose level enhanced seed germination compared to other media (72.3 %) The 1/2MS medium dive the highest results for the nepenthes’s development, which average height is 0.76 cm Following 60 days of culture, the 1/2MS medium supplemented with BA 1.5 mg/l + NAA 0.1 – 0.5 mg/l give the highest multiple shoots (3.73; 4 shoot) The development of shoots from nodes in medium 1/2MS + BA 1.5 mg/l + activated carbon 0.3 – 0.5 g/l is highest (4.3 – 3.5 shoot) The high average number of pitchter (4.3 pitcher) form the plant which cultured in 1/2MS medium contained with activated carbon 1 g/l Callus was efficiently induced when leaf segments were cultured on 1/2MS medium supplemented with 2.4-D 0.3 mg/l and BA1.5 – 2.0 mg/l after 2 months

Key words: MS, nepenthes mirabilis, multiplication shoot, callus, pitcher plant

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về loài nắp ấm 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm 3

2.1.2 Cấu tạo cây nắp ấm 3

2.1.2.1 Thân cây nắp ấm 3

2.1.2.2 Lá cây nắp ấm 3

2.1.2.3 Hoa cây nắp ấm 5

2.1.3 Phân loại cây nắp ấm 6

2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm 6

2.1.5 Mô tả cây nắp ấm 8

2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm 8

2.1.7 Nhân giống truyền thống cây nắp ấm 8

2.2 Nhân giống in vitro 10

2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro 10

2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng 10

2.3 Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Vật liệu 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng 13

3.3.2 Khảo sát môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường 15

3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS 16

3.3.4 Khảo sát sự phát sinh cụm chồi 16

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường 1/2MS 17

3.3.6 Khảo sát sự tạo sẹo của lá nắp ấm 18

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% 19

4.2 Môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng 23

4.3 Hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS 26

4.4Sự phát sinh chồi từ mẫu thân trên môi trường 1/2MS 29

4.5 Ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính 31

4.6 Sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH SÁCH CÁC CHữ VIếT TắT

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA 6-Benzyl-adenin

CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild

Fauna and Flora

IBA Indole-3-butiric acid

KC KnudsonC

1/2KC Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2

3/4KC Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 3/4

MS Murashige và Skoog, 1962

1/2MS Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2

1/4MS Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/4

1/8MS Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/8

NAA α-Naphthalene acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm 14

Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu thân nắp ấm 14

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá nắp ấm 14

Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường và đường đến việc nảy mầm hạt 15

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng MS lên cây nắp ấm in vitro 16

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA đến sự sinh cụm chồi 17

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BA và than đến phát triển của mẫu thân 17

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro 18

Bảng 4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu lá nắp ấm 19

Bảng 4.2 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu thân 21

Bảng 4.3 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá 22

Bảng 4.4 Môi trường và đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt 24

Bảng 4.5 Nồng độ khoáng đa lượng MS ảnh hưởng đến cây nắp ấm 27

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi 29

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi 29

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu nắp ấm 31

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu khi bổ sung 1,5 mg/l BA 34

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 2,4–D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm 36

Bảng4.11 Màu sắc và hình dạng mô sẹo 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997) 4

Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007) 7

Hình 2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986) 9

Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm 13

Hình 3.2 Quả và hạt nắp ấm 15

Hình 4.1 Tình trạng mẫu lá sau khi khử trùng 20

Hình 4.2 Tình trạng mẫu thân sau khi khử trùng 21

Hình 4.3 Tình trạng mẫu cuống lá sau khi khử trùng 22

Hình 4.4 Quá trình phát triển hạt nắp ấm trên môi trường nghiệm thức 24

Hình 4.5 Cây nắp ấm phát triển trên các môi trường nghiệm thức 27

Hình 4.6 Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi ở cây nắp ấm 33

Hình 4.7 Ảnh hưởng của than hoạt tính theo các nồng độ 34

Hình 4.8 Sự ảnh hưởng của than hoạt tính kết hợp với BA 37

Hình 4.9 Ảnh hưởng của BA, 2,4 – D đến sự phát sinh sẹo ở lá cây nắp ấm 38

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây nắp ấm (Nepenthes sp.) là một trong các loại cây ăn thịt được biết nhiều ở

Việt Nam Nổi bật với gân lá kéo dài tạo thành cấu trúc dạng bình nhiều màu sắc, có chức năng chính để bắt các loại sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng cho cây Nắp ấm

có khoảng 90 tới 130 loài chính và các loài lai tự nhiên cũng như nhân tạo Cây thường yêu cầu độ ẩm cao, thích nghi với môi trường nghèo dinh dưỡng Cây mọc leo, cao1 – 2 m, thân rất dai, lá hình bầu dục, dài khoảng 10 cm, có cuống dài, ôm vào thân, phía trên lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong, dài Ở Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở các vùng miền Trung và Nam bộ (Pietropaolo và ctv, 1986; Phạm Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009; McPherson, 2009)

Cây nắp ấm có nhiều ứng dụng trong y học, kinh tế Về phương diện làm thuốc, nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát Nắp ấm chữa vàng da do viêm gan, đau do loét dạ dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà Về mặt kinh tế, cây nắp ấm với các dạng bình nhiều màu sắc đẹp rất được ưa chuộng để làm cảnh và tiểu cảnh như hoa lan Những năm gần đây, thị trường cây nắp ấm đã phát triển mạnh và đi vào ổn định Bên cạnh đó, giá thành của một cây nắp ấm lại cao so với các loại cây kiểng khác và khả năng sống của cây tăng dần theo kinh nghiệm của người mua Từ

đó, ta có thể thấy rằng đây một nhánh thị trường tiềm năng to lớn cần được khai thác, nếu thành công sẽ đem lại lợi nhuận cao cho người trồng lẫn người kinh doanh

Phương thức sinh sản hữu tính thông thường của cây nắp ấm gặp nhiều khó khăn Việc thụ phấn cần cả cây đực, cây cái và phải đảm bảo ra hoa cùng lúc Một số hạt giống có thể nảy mầm trong vòng vài ngày, trong khi những loại khác có thể phải mất nhiều tháng có khi là vài năm Khả năng nảy mầm bị mất hoặc hạn chế sau vài tuần hoặc vài tháng lưu trữ phụ thuộc loài Hạt giống nắp ấm khá nhỏ thường bị xâm nhiễm bởi các bào tử nấm trong tự nhiên, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn

Thực tế, người ta thường sử dụng phương pháp giâm cành để tạo cá thể mới Đây cũng là phương pháp sinh sản cơ bản của các loài nắp ấm trong tự nhiên để duy trì

số lượng Tuy nhiên, phương pháp giâm cành lại cho ra số lượng cá thể con ít, tốn

nhiều công sức, diện tích, thời gian, phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi trường, và quan trọng nhất là cần kinh nghiệm của cá nhân phải cao.Vì vậy khi đưa vào sản xuất

sẽ không đạt được hiệu quả Trong những năm trở lại đây phương pháp nhân giống in

vitro được sử dụng rộng rãi do các ưu điểm như hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời

gian, diện tích, tạo được các cây con có chất lượng tốt Một số loài nắp ấm đã được nhân giống bằng phương pháp này và đạt được khá nhiều kết quả Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu còn chưa được bao quát và tối ưu, hệ số nhân chồi còn thấp

Với thực trạng trên, cây nắp ấm là một loài cây có giá trị kinh tế cao, có thể nói

là rất cao, mà các phương pháp truyền thống không phù hợp vào sản xuất và mang lại

lợi nhuận Vì vậy đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống cây nắp ấm (Nepenthes

mirabilis Druce) in vitro” cần được thực hiện, để khảo sát môi trường thích hợp cho

việc nhân giống cây nắp ấm cho hệ số nhân giống cao nhất, phù hợp việc sản xuất nhất mang lại hiệu quả kinh tế cao và đáp ứng kịp thời số lượng cây con giống

1.2 Yêu cầu

Xác định được môi trường và nồng độ đường thích hợp cho sự nảy mầm của hạt

cây nắp ấm in vitro

Xác định được hàm lượng khoáng đa lượng của MS, tỉ lệ than hoạt tính phù hợp

cho sự sinh trưởng của câynắp ấm in vitro

Xác định được nồng độ thích hợp của các chất kích thích sinh trưởng trên môi

trường 1/2MS cho sự phát sinh cụm chồi, mô sẹo cây nắp ấm in vitro

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện đầu tiên bằng việc xác định thời gian xử lý HgCl20,1% phù hợp để khử trùng các loại mẫu loài cây nắp ấm(mẫu lá, cuống lá và đốt thân non) Bên cạnh

đó là khử trùng hạt cây nắp ấm và nuôi trên các môi trường khác nhau với các nồng độ đường khác nhau để xác định môi trường phù hợp nhất cho sự nảy mầm Sau khi nuôi khoảng 2 tháng, mẫu lá, thân không có cảm ứng, lấy các mẫu cây sinh trưởng từ hạt cấy chuyền sang môi trường MS có hàm lượng khoáng thay đổi để khảo sát hình thái sinh trưởng của cây Cây được 30 ngày, chuyển qua môi trường 1/2MS bổ sung nồng độ BA và NAA thay đổi để khảo sát sự phát sinh cụm chồi Do có sự tiết phenol từ mẫu, sau 2 tháng tiếp tục cấy chuyền mẫu sang môi trường có nồng độ than hoạt tính thay đổi, để khảo sát sự tác động

của than lên cây cũng như ngăn chặn việc tiết phenol từ mẫu Bên cạnh đó, cấy chuyền lá của cây sang môi trường bổ sung 2,4-D và BA thay đổi để theo dõi sự hình thành sẹo

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về loài nắp ấm

Nắp ấm(Nepenthes mirabilis) là loài cây ăn thịt được biết đến rất phổ biến

Cũng như các loài cây ăn thịt khác, nắp ấm có chiếc bẫy để bắt côn trùng được gọi là

ấm (Temple, 1993) Hiện nay có khoảng 120 loài nắp ấm, phân bố chủ yếu ở miền Nam Trung Quốc, Indonesia, Malaysia và Philippines,kéo dài về phía Tây tới Madagascar và Seychelles, Ấn Độ và Sri Lanka về phía Nam tới Australia và New Caledonia (McPherson, 2009) Nhiều loài nắp ấm được coi là loài bị đe dọa hay nguy cấp và được liệt kê trong phụ lục 1 và 2 của CITES (1992)

2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm

Năm 1658, Etienne de Flacourt tại Madagascar đã công bố miêu tả một loài nắp

ấm trong công trình chuyên đề của ông Histoire de la Grande Isle de Madagascar Cái tên “Nepenthes” được sử dụng vào năm 1689 bởi J.P.Breney Năm 1790, Joao de Loureiro miêu tả cây nắp ấm ở Việt Nam Vào năm 1874, J.D.Hooker đã công bố về

sự tiêu hoá của nắp ấm

2.1.2 Cấu tạo cây nắp ấm

2.1.2.1 Thân cây nắp ấm

Nắp ấm là loại cây sống lâu năm với thân cây rất dai, có đường kính khoảng 5 cm (Pietropaolo và ctv, 1986) Độ dày của thân rất khác biệt ở mỗi loài, từ vài mm ở loài

N.gracilis tới khoảng 3 cm ở loài N.bicalcarata Thân cây có thể cao tới hơn 20 m,

nhưng thường thì cây trưởng thành cao từ 2 – 5 m (Clarke, 1997) Thân cây thường bám vào các bụi cây, thân cây khác hoặc bò trên mặt đất (Pietropaolo và ctv, 1986)

2.1.2.2 Lá cây nắp ấm

Lá của nắp ấm rất đa dạng về hình dạng, màu sắc, kết cấu và kích cỡ Kích thước có thể từ 5 cm cho tới 1m (Clarke, 1997) Lá cây thường dài và dai, một số loài

lá có thể dài tới 6m Các phiến lá thường có màu xanh đến màu vàng xanh với các gân

lá kéo dài ra khỏi giới hạn của lá trở thành các dây nho Các dây nho này sẽ phát triển trở thành ấm ở môi trường thích hợp (Pietropaolo và ctv, 1986) Ấm của cây được giữ

bởi cấu trúc dây nho cho tới phiến lá Đó là chiếc bình tự nhiên được cây sử dụng để bắt các loài sinh vật như côn trùng Ví dụ như loài sinh vật chủ yếu hoặc được hiểu là

con mồi được tìm thấy trong ấm của loài N gracilis là kiến (Beaver, 1979) Màu sắc

của ấm rất đa dạng từ xanh đến xanh đốm tím hoặc đốm đỏ (Pietropaolo và ctv, 1986)

Nắp ấm thường chia thành hai dạng ấm, tuy hình dạng của các loại ấm rất đa dạng về loài, nhưng thường các ấm nằm gần mặt đất có hình trụ với hai cánh chạy song song nhau từ đầu tới chân ấm (Pietropaolo và ctv, 1986) Thường các cây còn nhỏ sản xuất ra loại ấm ngắn, mập lùn được gọi là ấm thấp và cánh hai bên được cho là để dụ các loài côn trùng bò vào trong ấm Khi thân cây leo cao, nó sản xuất

ra một loại ấm dài hơn và có hình trụ được gọi là ấm cao (Clarke, 1997) Các ấm ở trên cao thường có dạng hình ống, nhỏ dần về phía tua cuốn Thường các tua cuốn này uốn cong lại trở thành một dạng cấu trúc nâng đỡ ấm, đưa ấm lên cao hơn Các tua cuốn ở ấm thấp thường không uốn cong (Pietropaolo và ctv, 1986) Mặc dù ấm của các loài nắp ấm thường giống nhau về cấu trúc, nhưng chúng rất khác nhau về kích cỡ, hình dạng, màu sắc Chính sự khác nhau đó là nhân tố cơ bản để phân biệt các loại nắp ấm khác nhau (Clarke, 1997) Không phải toàn bộ các loại ấm đều dùng để bắt côn trùng (Joel, 1988) Gần đây đã phát hiện ra rằng một số loài

Nepenthes với các loại ấm đặc biệt lớn bắt được chuột chù Tupaia montana (Chin

và ctv, 2010), phân giải thành các chất dinh dưỡng dùng để cung cấp cho

Hình2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997)

cây(Adlassnig và ctv, 2011) Loài N.meririlliana ở Philippines sản xuất ra loại ấm

lớn nhất cao tới 50 cm và có đường kính 25 cm Chim nhỏ, chuột và một số loài thú nhỏ cũng bị bắt vào ấm (Pietropaolo và ctv, 1986)

Ấm thường được chia làm bốn phần chính: nắp, môi, phần trên ấm, phần dưới

ấm Trên cùng của ấm là nắp, nắp rất đa dạng từ hình dáng đến màu sắc, phụ thuộc vào loài (Clarke, 1997) Nắp gắn với ấm vào phía sau lưng của ấm, nó gắn vào phía trên của ấm, được coi như nón của ấm có tác dụng để hạn chế lượng nước mưa rơi vào ấm,phần nối giữa ấm và nắp gọi móc.Phần miệng của ấm được bao phủ bởi một cấu trúc dày được gọi là môi (Pietropaolo và ctv, 1986) Chức năng chính của môi là ngăn cản con mồi thoát khỏi ấm Ngoài ra, nó còn có công dụng là tác nhân thu hút con mồi vào ấm do có màu sắc sặc sỡ (Clarke, 1997) Thân ấm thường được chia làm hai phần: vùng sáp và vùng tiêu hoá Vùng sáp hay còn gọi là vùng trên được phủ một lớp sáp mỏng trên bề mặt, hạn chế sự trốn thoát của côn trùng, tăng khả năng côn trùng rớt xuống dịch phía dưới Phần tiêu hoá ở phía dưới được bao phủ gồm các tuyến tiết ra các loại acid và enzyme để phân huỷ con mồi Mẫu của enzyme gồm ribonuclease, lipase, esterase, acid phosphatase và protease (Slack, 1979) Pavlovic và ctv (2007) đã công bố về sinh lý của phiến lá và ấm Chất lỏng trong ấm thường có tính acid và có chứa các enzyme thực vật (Peroutka và ctv, 2008; Adlassnig và ctv, 2011) Mật là sản phẩm phụ của ấmđể thu hút côn trùng,nó được sản xuất từ các tuyến trên môi và nắp Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng môi của bình rất ướt và côn trùng có thể trượt khi đậu trên nó để ăn mật, rơi vào các bình bên dưới, nơi chúng chết và được tiêu hóa, chỉ khi môi bị khô là côn trùng có thể đi trên đó dễ dàng, nhưng họ vẫn có thể bị mắc kẹt khi chúng bò trên mặt trong của ấm được phủ sáp (Bohn và Federle, 2004) Điều thú vị

là kiến Camponotus schmitzi sống cộng sinh với Nepenthes bicalcarata, và có thể bò

trên cả môi ướt (Kitching, 2000)

2.1.2.3 Hoa cây nắp ấm

Nắp ấm gồm có cây đực và cái, để tạo hạt cần có hoa đực và hoa cái cùng lúc

Cả hoa đực và hoa cái đều rất sặc sỡ Chúng khá nhỏ, không có cành hoa, có bốn đài hoa, nhị và nhuỵ nằm ngay giữa và nhìn rất giống nhau Có thể phân biệt hoa cái

bằng cách xem xét noãn phồng to lên ngay trên các lá đài Hoa được sinh ra theo chùm hoặc bụi (Pietropaolo và ctv, 1986)

2.1.3 Phân loại cây nắp ấm

Trong khi đa số cái loài nắp ấm mọc ở vùng nhiệt đới, một số loài khác thì phát triển ở vùng đất cao hơn, nơi mà nhiệt độ thấp hơn Dựa vào mục đích phát triển, nắp

ấm được chia làm hai loại: loài mọc ở vùng cao, mọc ở vùng đất cao hơn 1000 m, nơi nhiệt độ trung bình từ 10 - 21 oC; loài mọc ở vùng thấp, dưới 1000m, nhiệt độ trung bình khoảng từ 21 - 35 oC (Temple, 1993)

Loài ấm vùng thấp: N ampullaria, N gracilis, N mirabilis…

Loài ấm vùng cao: N alta, N.lamii, N.maxima…

2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm(Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce)

Tên gọi: Trư lủng thảo, trư tử lung (Trung Quốc), nắp ấm (miền Trung và Nam Việt Nam), cây bắt ruồi (Đỗ Tất Lợi, 2003)

Phân loại thực vật học (Hoàng Thị Sản, 2006)

Nepenthes mirabilis var anamensis (Weiner, 1985)

Nepenthes mirabilis var biflora (J.H.Adam và Wilcock, 1992)

Nepenthes mirabilis var echinostoma(Burbidge, 1988)

Nepenthes mirabilis var globosa (Catal, 2010)

Nepenthes mirabilis var simensis (Westphal, 1991)

Nepenthes mirabilis var smilesii(Weiner, 1985)

Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007)

2.1.5 Mô tả cây nắp ấm

Nắp ấm là một cây chủ yếu mọc hoang dại ở các tỉnh miền Trung và Nam Bộ, còn thấy ở chân núi đá vôi các tỉnh nói trên Tại miền Bắc chỉ mới gặp ở Vĩnh Linh, cây mọc leo, cao 1 – 2 m, thân rất dai, lá có cuống dài, một nửa ôm vào thân, phần lá hình bầu dục, dài khoảng 10 cm; phía đầu lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong, dài chừng 15 cm, với đầu biến thành cái bình, trông như cái hoa nhưng không phải hoa nên có tên bình nước Bình hình trụ, hơi phồng ở gốc, mặt bình có nắp đậy, mặt trên nắp trơn, mặt dưới có nhiều phiến phân phối đều, trong bình tiết ra một chất nhầy, khi nào có côn trùng vào trong bình, thì lập tức nắp đậy chặt lại, chất nhầy trong bình tiêu huỷ sâu bọ Cụm hoa là một chùm thưa gồm hoa đực hoặc hoa cái Lá dài hình bầu dục, mặt trong có nhiều phiến nhỏ, cột nhị dài bằng các lá đài, 16 – 20 bao phấn cong, xếp thành hai dãy Bầu hình trứng, phủ lông trắng, vòi ngắn, đầu nhị chia làm 4 thuỳ, quả nặng, hạt mảnh và dài Mùa hoa thường gặp vào tháng giêng Người ta thu hái toàn cây, quanh năm, rửa sạch, chặt thành từng đoạn 2 – 3 cm, phơi nắng cho khô dùng dần (Phạm Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009)

Loại cây này có rễ dạng chùm và mỏng Lá mỏng có lông, phiến lá thuôn dài hình ngọn giáo Ấm thấp phình to ở phần thân, nhất là ở phần hông của ấm, nắp có hình tròn hoặc ovan Ấm cao hình trụ, có một số nơi bị phình lên Hoa đực và hoa cái sinh sản đơn độc trên các cành mỏng Các phần non thì thường có lông nhỏ bao phủ, cây trưởng thành thì nhẵn với mép lá có rìa lông bao quanh (Mey, 2010)

2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm

Trồng làm cảnh:Ở nước ta thị hiếu về hoa cảnh của các loài cây bắt mồi nói chung và nắp ấm nói riêng còn rất mới mẽ, tiềm năng rất lớn nhưng chưa được khai thác đúng mức, nhất là các loài có sẵn trong nước (Nguyễn Thị Thư, 2005) Thị trường nấp ấm hiện nay đã khá ổn định, với số lượng người sưu tầm cây tăng mạnh trong những năm gần đây Giá thành của cây cũng khá cao do việc chăm sóc khó khăn đồng thời do số lượng người bán khá ít

Sử dụng làm dược liệu: Nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, hoá đờm, giảm đau Nắp ấm còn có tác dụng trị vàng da do viêm gan, đau do loét dạ dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà, còn

dùng trong điều trị các chứng phù thủng toàn thân (Lê Quí Ngưu và Trần Thị Như Đức,1993) Rễ của cây nắp ấm trị huyết áp, trị bệnh vàng da (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Dịch của ấm chưa mở được sử dụng như thuốc nhuận trường, viêm họng, trị bỏng, viêm mắt và các bệnh về da (Pietropaolo và ctv, 1986)

2.1.7Nhân giống truyền thống cây nắp ấm

Gồm có nhân giống hữu tính (gieo hạt) và nhân giống vô tính (giâm cành) Sau khi thụ phấn, hạt phát triển thành dạng dài và mảnh Hạt được gieo bằng cách rải trên mặt đất, phải bảo đảm độ ẩm và nhiệt độ phù hợp (Pietropaolo và ctv, 1986) Hạt có thể được gieo trên xơ dừa và đá nhỏ sạch giữ ở 26oC Tưới phun sương

và không được để môi trường khô, sự nảy mầm diễn ra từ hai đến sáu tuần Hạt dễ bị

hư và cần phải bảo vệ tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp (Temple, 1993) Tuy nhiên phương pháp nhân giống bằng hạt gặp nhiều khó khăn do đòi hỏi cây đực và cây cái phải ra hoa cùng lúc, hạt khá nhỏ, sinh trưởng chậm, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn (Lavarack, 1981; Lee, 2008)

Phương pháp thông dụng nhất để nhân giống nắp ấm là giâm cành Phương pháp này không những tạo ra nhiều cây con mà còn giải quyết vấn đề về cây có thân quá già và leo quá cao trên giàn, lúc này cây cho ít bình và nhỏ dần (Nguyễn

Hình2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986)

Thị Thư, 2005) Yêu cầu cành giâm là cây nắp ấm đang khỏe mạnh, thân phải chắc Điều kiện môi trường là nhiệt độ không quá 34oC, độ ẩm càng cao càng tốt trên 90%, ánh sáng 2500 – 3000 lux Chọn cành giâm khỏe mạnh, cắt bớt 1/2 tất cả các

lá, cắt từng đoạn từ 3 - 5 lá, sau đó giâm xuống giá thể, cắt các đốt nghiêng 45 độ, sau đó trùm bọc nilon trong suốt để cây ở môi trường thích hợp, sau 1,5 - 2 tháng cây ra rễ tốt, 4 - 6 tháng cây to khỏe mới, tỉ lệ thành công phụ thuộc rất nhiều vào môi trường (Châu Kiến Đạt, 2010)

Tuy nhiên phương pháp này còn có nhiều hạn chế: không ổn định về mặt duy truyền, hệ số nhân giống thấp, tốn nhiều thơi gian và công sức, chiếm diện tích, khả năng sống sót kém do phụ thuộc vào môi trường Vì thế phương pháp vi nhân giống

có lẽ là một lựa chọn lý tưởng nhằm giải quyết các vấn đề khó khăn liên quan đến nhân giống truyền thống

2.2 Nhân giống in vitro

2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công kiên, 2002)

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá,

thân, hoa hoặc rễ Phương pháp này có nhiều ưu điểm Nhân giống in vitro tiết kiệm

thời gian, nhân giống các loài mà phương pháp nhân giống tự nhiên không cho phép

hay không thuận lợi Sự tăng trưởng của cây in vitro thường mạnh hơn cây bình

thường, tạo được cây sạch bệnh, dễ dàng chọn lọc cá thể, giảm chi phí và diện tích, sản xuất quanh năm, tạo ra các dòng đột biến, tạo ngân hàng gene (Pierik, 1975; Anonymous, 1980; Assche, 1983; Gebhard và ctv, 1983; Kunneman, 1984)

2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền

phù tế bào và điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Cytokinin là một trong nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật Cytokinin ít

có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái Khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chồi bên Về phương diện này thì cytokinin có tác động ngược lại với auxin nội sinh (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.3Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm trong và ngoài nước

Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước về việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào thực vật trong việc nhân giống cây nắp ấm và đạt được một số thành công nhất định

Vào năm 2005, Nguyễn Thị Thư đã thực việc nuôi cấy trên đối tượng là

đốt thân loàiN.mirabilis Kết quả đạt được là tìm ra môi trường phù hợp để tăng

trưởng chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 3 mg/l + NAA 2mg/l và môi trường tối

ưu cho việc phát sinh cụm chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 5mg/l

Ngoài ra, theo Nguyễn Bảo Toàn và Lê Hồng Giang (2011) thực hiện trên

đối tượng là đốt thân loài N.mirabilis Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi

trường WPM phù hợp hơn môi trường MS trong sự cảm ứng mầm bên phát triển

và môi trường WPM bổ sung 0,05 mg/l NAA + 8 mg/l BA cho tỷ lệ tạo cụm chồi cao nhất 81,3%

Năm 2000, Sani và ctv đã thực hiện nghiên cứu trên hạt của loài

N.ampullaria Từ đó đã chỉ ra rằng môi trường thích hợp nhất cho hạt nảy mầm là

1/2MS với nồng độ đường lên tới 60%, môi trường 1/2MS + 1 mg/l IBA phù hợp nhất cho việc phát triển của thân rễ, bên đó môi trường 1/2MS + 2 mg/l 2, 4 – D thích hợp cho sự phát sinh sẹo từ thân, và cuối cùng môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l BAP cho tỉ lệ phát sinh cụm chồi cao

Năm 2005, Rasco Jr và Maquilan đã thực hiện nghiên cứu trong việc cảm

ứng hạt loài N.truncata nảy mầm Một số kết luận được rút ra, môi trường

1/4KC và 3/4KC phù hợp nhất cho việc nảy mầm và phát triển của cây, tỉ lệ sống và nảy mầm của hạt tỉ lệ nghịch với nồng độ khoáng đa lượng của môi trường MS

Vào năm 2007, Khompat và ctv đã công bố nghiên cứu trên loài

N.mirabilis Môi trường rắn MS + 3 mg/l BA cho tỉ lệ nảy mầm tốt, môi trường

lỏng cho tỉ lệ nảy mầm nhanh hơn môi trường rắn chỉ sau 6 tuần nuôi cấy Môi trường MS bổ sung 5 mg/l BA thích hợp cho sự phát sinh cụm chồi Môi trường 1/2MS phù hợp cho sự phát triển của cây

Theo Fong (2008), môi trường WPM + 0,5 mg/l IBA phù hợp nhất cho sự

phát sinh rễ ở loài N.gracilis

Năm 2009, Kumaria và Tandon đã thực hiện nghiên cứu và thấy rằng môi trường 1/2MS là phù hợp nhất cho sự nảy mầm và môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l

NAA là phù hợp nhất cho sự phát sinh ấm ở loài N.khasiana tại Ấn độ

Dinarti và ctv (2010) đã tiếp tục thực hiện việc nghiên cứu sự nảy mầm

của loài N.mirabilis Và đạt được các kết quảmôi trường 1/4KC và 1/2MS có bổ

sung TDZ, IAA, GA3 phù hợp cho sự nảy mầm của hạt, giúp tăng phần trăm số hạt nảy mầm cũng như giảm số ngày nảy mầm Môi trường 1/2MS và 1/4 KC chứa 0 – 1 mg/l BAP phù hợp cho sự phát triển của chồi và lá

Đến năm 2011, Sukamto và ctv thực hiện các nghiên cứu trên loài

N.albomarginata đã kết luận rằng, môi trường 1/2MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l

NAA là phù hợp nhất cho sự phát triển của cây, 1/2MS + 1,5 mg/l NAA thích hợp cho việc phát sinh chồi nách, và cuối cùng 1/2MS + 1 mg/l BA + 2mg/l NAA cho sự cảm ứng sẹo tốt

Trong cùng năm 2011-2012, Jala đã kết luận nuôi cấy loài N.mirabilis

dưới ánh sáng đỏ phù hợp với việc thúc đẩy sự nảy mầm của hạt, trong khi ánh sáng vàng tốt nhất cho sự tăng trưởng của cây Môi trường 1/2MS + 2 mg/l BA phù hợp cho sự phát triển của cây và có sự hình thành cấu trúc sẹo sau 20 tuần nuôi cấy

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 06/2013 tại phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm là cành cắt cây nắp ấm dài 30 – 50 cm, hạt từ 2 đến 3 tuần tuổi mua ở vườn ươm, mẫu cấy ban đầu gồm lá, đoạn thân, hạt

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS, WPM, KC

Điều kiện nuôi cấy là thời gian chiếu sáng: 16 h/ngày; nhiệt độ: 25 ± 20C; độ ẩm: 50 - 60%; cường độ chiếu sáng: 2000 - 3000 lux

3.3.Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl 2 0,1% đến khả năng sống của mẫu cây nắp ấm

Các bước tiến hành: Lá cây cắt thành nhiều mảnh nhỏ dài 6 cm, cuống lá từng đoạn dài 6 cm, thân cây cắt từng đoạn ngay chồi ngủ khoảng 5cm, sau đó dùng cồn 700

rửa sạch theo 1 chiều từ trên xuống để tránh tổn thương mẫu Chuyển mẫu sang bình tam giác vô trùng và đưa vào tủ cấy Thực hiện thao tác khử trùng mẫu cấy trong điều

Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm

kiện vô trùng Mẫu cấy được lắc qua cồn 700 trong 30 giây - 1 phút, sau đó được khử

trùng với vitamin C trong 15 phút; kháng sinh (nồng độ 1 g/l) trong 30 phút;

HgCl20,1% bổ sung vào 3 giọt Tween 20 lắc trong các khoảng thời gian khác nhau và

được bố trí trên từng nghiệm thức Sau khi khử trùng xong loại bỏ những phần hư hại,

mẫu được cắt thành từng đoạn dài từ 1 - 1,5 cm đối với mẫu thân chồi, đối với mẫu lá

cắt mẫu thành từng mảnh 1x1 cm, cuống lá cắt từng lát mỏng dày 0,5 – 1 cm sau đó

được cấy vào môi trường MS

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với mẫu lá, thân, cuống lá cây

nắp ấm.Mẫu lá, cuống lá được đặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, thân cây

cấy trên môi trường MS Gồm có 4 nghiệm thức, mẫu lá mỗi nghiệm thức 5 chai, mẫu

thân mỗi nghiệm thức 4 chai, mẫu cuống lá mỗi nghiệm thức 4 chai, thực hiện lặp lại 3

lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

Bảng 3.1Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm

Bảng 3.2Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu thân

Bảng 3.3Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu cuống lá

Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng (phút) Mẫu/chai Tổng mẫu

Chỉ tiêu theo dõi:

Tỉ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống và sạch nấm khuẩn/tổng số mẫu thí

nghiệm) x 100

Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch nấm khuẩn/tổng số mẫu thí nghiệm) x 100

3.3.2 Khảo sát môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng đến sự

nảy mầm của hạt nắp ấm

Cách tiến hành: Hạt nắp ấm được rửa dưới vòi nước chảy, tiếp theo rửa sạch

mẫu với xà phòng loãng Chuyển mẫu sang bình nước cất vô trùng và đưa vào tủ

cấy.Mẫu cấy được lắc qua cồn 70o trong 30 giây Tiếp theo, lắc mẫu với hỗn hợp javel

và nước có tỉ lệ 1:3, rửa lại với nước cất vô trùng Đặt mẫu hạt lên trên bề mặt môi

trường theo như nghiệm thức, theo dõi trong 30 ngày nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên, gồm 8 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai,

lặp lại 3 lần

Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường và đường đến sự nảy mầm hạt cây nắp ấm in vitro

Nghiệm thức Môi trường Nồng độ đường (g/l) Mẫu/chai Tổng mẫu

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian nảy mầm của hạt (ngày) = ngày hạt đầu tiên nảy mầm ở nghiệm

thức – ngày cấy mẫu

Tỉ lệ hạt nảy mầm (%) = (tổng số hạt nảy mầm/tổng số hạt đã cấy) x 100

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS đến

sự phát triển của cây nắp ấm in vitro

Cách tiến hành: chọn chồi có chiều cao 0,5 cm và 2 – 3 lá, cấy chuyền các cây

con khoẻ mạnh lên các môi trường MS với nồng độ khoáng đa lượng khác nhau, các

môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Quan sát hình thái cây

trong 30 ngày nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên, gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 chai, mỗi chai 1 mẫu, lặp lại 3 lần

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng MS lên cây nắp ấm in vitro

E1 MS 1 15

Chỉ tiêu theo dõi:

Kích thước của cây (cm)

Số ấm, chiều dài lá (cm), số lá trên một cây (lá)

3.3.4 Khảo sát sự phát sinh cụm chồi cây nắp ấm trên môi trường 1/2MS có bổ sung

BA và NAA

Các bước tiến hành: Mẫu được cấy chuyền trên môi trường nuôi cấy 1/2MS có

bổ sung chất kích thích sinh trưởng thực vật với các nồng độ khác nhau BA (1,5; 1,0;

0,5 mg/l) và NAA (0,1; 0,5 mg/l) Sự hình thành và phát triển cụm chồi được theo dõi

sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm

7 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA đến sự sinh cụm chồi của mẫu nắp ấm in vitro

Nghiệm thức Môi trường NAA BA Mẫu/ chai Tổng mẫu

Chỉ tiêu theo dõi:

Kích thước của mẫu (cm)

Số lá (lá)trên một mẫu

Số chồi hình mới hình thành trên bề mặt môi trường ở mỗi nghiệm thức (chồi)

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính và

chất kích thích sinh trưởng BA đến sự phát triển của cây nắp ấm

Các bước tiến hành: Mẫu chồi được cắt với kích thước 0,5 cm, 2 - 3 lá, được

cấy chuyền trên môi trường nuôi cấy 1/2MS có bổ sung than hoạt tính với các nồng độ

khác nhau (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1 g/l) và BA (0; 1,5 mg/l) Sự phát triển và tạo thành cụm

chồi được theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm

10 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần

Bảng 3.7Ảnh hưởng của BA và than đến phát triển của mẫu thân nắp ấm in vitro

Nghiệm thức Môi trường BA(mg/l) Than hoạt tính

Chỉ tiêu theo dõi:

Kích thước của mẫu

Số lá (lá), chiều dài lá (cm) trên một mẫu

Số chồi (chồi), chiều cao chồi (cm) hình thành trên một mẫu

Số ấm (ấm), chiều dài ấm (cm) trên một mẫu

3.3.6 Khảo sát sự tạo sẹo của lá nắp ấm trên môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA

Các bước tiến hành: Cắt mẫu lá 1 - 3 cm Mẫu được đặt trên môi trường

nuôi cấy 1/2MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thực vật 2,4-D (0,3 mg/l)

và BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l) Sự nuôi

cấy mô sẹo được thực hiện trong điều kiện tối hoàn toàn trong 2 tuần sau cấy

Tiếp đó chuyển những mẫu mô sẹo này sang điều kiện ánh sáng nhẹ để kích thích

mẫu tạo thêm diệp lục tố Mẫu theo dõi liên tục sau 2 tháng nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,

gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần

Bảng 3.8Ảnh hưởng của 2,4D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro

Nghiệm thức Môi trường 2,4-D(mg/l) BA (mg/l) Mẫu/chai Tổng mẫu

H1 1/2MS 0,3 0 3 45 H2 1/2MS 0,3 0,5 3 45 H3 1/2MS 0,3 1,0 3 45 H4 1/2MS 0,3 1,5 3 45 H5 1/2MS 0,3 2,0 3 45 H6 1/2MS 0,3 2,5 3 45 H7 1/2MS 0,3 3,0 3 45 Chỉ tiêu theo dõi

Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%) = (số mẫu có tạo sẹo/tổng số mẫu cấy) x 100%

Màu sắc, đặc điểm, trọng lượng mô sẹo (g), thời gian cảm ứng sẹo (ngày)

Tỉ lệ khối lượng sẹo (%) = (khối lượng tươi/khối lượng khô) x 100%

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập được sẽ được xử lý trên máy tính bằng phần mềm xử lý thống kê MSTATC Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức (bằng phương pháp LSD)

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thời gian khử trùng HgCl 2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu cây nắp ấm

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô, giai đoạn ban đầu nhằm tạo nguồn mẫu in vitro

là giai đoạn mang tính quyết định và tỉ lệ thành công thấp Đặc biệt là mẫu nắp ấm do

có tiết phenol và sống trong môi trường có độ ẩm cao, thường mọc sát đất, mẫu lá có lông nhỏ bao phủ làm tăng khả năng nhiễm nấm, khuẩn

Mẫu trước khi khử trùng được rửa thật sạch, khử trùng bằng dung dịch khử trùng mạnh là HgCl2 0,1% Kết quả xử lý mẫu sau 2 tuần được ghi nhận như sau:

Bảng 4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu lá nắp ấm

Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05)

Đối với mẫu lá nắp ấm, thời gian khử trùng ở nghiệm thức A2 (2 phút) là tốt nhất, với tỉ lệ mẫu sống đạt 77,3%, tỉ lệ mẫu sạch đạt 78,7% Thời gian khử trùng càng tăng thì tỉ lệ mẫu lá sạch càng cao, do HgCl2 là một chất khử trùng mạnh Tuy nhiên, tỉ lệ sạch của mẫu lá giữa các nghiệm thức không có sự sai biệt

về mặt thống kê Tỉ lệ sạch của mẫu lá đạt trên 50% ở tất cả các nghiệm thức

Ngược lại, thời gian khử trùng càng cao thì tỉ lệ mẫu lá sống càng thấp Mẫu hoá nâu được ghi nhận do sự ngộ độc thuỷ ngân sau 2 tuần nuôi cấy Nếu mẫu nuôi cấy chuyển màu nâu và trắng, chứng tỏ mẫu nuôi cấy đã khử trùng quá giới hạn cho phép Cần giảm thời gian khử trùng hoặc giảm nồng độ chất khử trùng (Trần Văn Minh, 1997) Tỉ lệ sống của mẫu lá không có sự sai biệt

Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng

(phút)

Tỉ lệ sống (%)

Tỉ lệ mẫu sạch (%)

về mặt thống kê giữa các nghiệm thức nhưng độ biến thiên của tỉ lệ mẫu lá sống giữa các nghiệm thức lại cao Điều đó cho thấy, mẫu lá nắp ấm nhạy cảm đối với chất khử trùng HgCl2

Từ tỉ lệ sạch và sống của mẫu lá, nhận thấy nghiệm thức có tỉ lệ mẫu sống càng cao thì tỉ lệ mẫu sạch càng thấp và ngược lại Vậy thời gian ở nghiệm thức A2 (2 phút) là phù hợp nhất để khử trùng mẫu lá nắp ấm Không chọn nghiệm thức A1 do tỉ lệ mẫu lá sạch thấp nhất (61,7%) dù tỉ lệ mẫu sống là cao nhất (83,7%) Nghiệm thức A3 và A4 cũng không thích hợp do tỉ lệ mẫu sạch cao (81,3%; 86,7%) nhưng tỉ lệ mẫu sống lại thấp hơn (53%; 38,7%) Việc giảm nồng

độ HgCl2 có thể tăng tỉ lệ mẫu lá sống và sạch cao hơn

a 

b 

c 

Bảng 4.2 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng của mẫu thân nắp ấm

Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05)

Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử

trùng (phút)

Tỉ lệ mẫu sống (%)

Tỉ lệ mẫu sạch (%)

Thời gian khử trùng 5 phút là phù hợp nhất cho việc khử trùng mẫu thân Vì thời gian khử trùng ở nghiệm thức B2 (5 phút) cho tỉ lệ mẫu thân sống cao (80,7%) và

tỉ lệ mẫu thân sạch cao (83,3%) Tỉ lệ mẫu thân sống của các nghiệm thức tỉ lệ nghịch với thời gian khử trùng do HgCl2 là chất khử trùng mạnh Tỉ lệ mẫu thân sống cao hơn 50% và độ biến thiên của các nghiệm thức thấp Từ đó, nhậnthấy mẫu thân nắp ấm thích hợp cho việc khử trùng bằng HgCl2, do mẫu thân dai và chắc Theo Nguyễn Thị Thư (2005), khữ trùng mẫu thân với dung dịch NaClO 7,5% cho tỉ lệ sống và sạch chỉ đạt 27,74% và 28,4%, tương ứng với thời gian khử trùng là 20 và 30 phút Không có

sự sai biệt giữa các nghiệm thức về mặt thống kê ở tỉ lệ mẫu sống Nhưng nếu xét về

độ lớn thì ở các nghiệm thức B1 (4 phút), B2 (5phút), B3 (6 phút) có tỉ lệ mẫu sống

c

a 

b 

Hình 4.2 Tình trạng mẫu thân sau khi khử trùng

(a) Mẫu thân sống và sạch, (b) Mẫu thân hoá nâu, (c) Mẫu thân bị nhiễm

cao, lần lượt là 83,3%; 80,7%; 72,3%, nghiệm thức B4 thì có tỉ lệ mẫu thân sống thấp hơn (50%) Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu sạch ở mỗi nghiệm thức cũng không có sự sai biệt

về mặt thống kê Nghiệm thức B1 có tỉ lệ mẫu thân sạch thấp nhất (41,7%), trong khi ở nghiệm thức B2 (83,3%), B3 (75%) và B4 (83,3%) cao hơn Qua đó nhận thấy thời gian 5 phút phù hợp nhất cho việc khử trùng mẫu thândo có tỉ lệ mẫu sạch cao và tỉ lệ mẫu sống cao nhất

Bảng 4.3 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu cuống lá nắp ấm

Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05)

Mẫu cuống lá khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 2 phút ở nghiệm thức C1 là tốt nhất, do tỉ lệ mẫu sống (49,3%) và tỉ lệ mẫu sạch (91,7%) là cao nhất so với các nghiệm thức khác Xét về tỉ lệ mẫu cuống lá sống, thời gian khử trùng mẫu càng tăng thì tỉ lệ mẫu cuống lá sống càng thấp Số mẫu cuống lá sống giữa các nghiệm thức không có sự sai biệt về mặt thống kê Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu sống của cuống lá nhìn chung là khá thấp, tất cả nghiệm thức đều thấp hơn 50% (49,3%; 40%; 35,3%; 24%) trong đó nghiệm thức C1 có tỉ lệ mẫu sống cao nhất (49,3%) Nguyên nhân

do mẫu cuống lá không thích hợp với chất khử trùng mạnh như HgCl2 hoặc thời gian khử trùng không thích hợp đối với mẫu cuống lá Vô trùng trực tiếp mẫu thường gây hại mẫu nuôi cấy ở các mức độ khác nhau do chất khử trùng gây ra

Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng

(phút)

Tỉ lệ mẫu sống (%)

Tỉ lệ mẫu sạch (%)

Hình 4.3 Tình trạng mẫu cuống lá sau khi khử trùng

(a) Mẫu cuống lá sống và sạch, (b) Mẫu cuống lá hoá nâu

(Trần Văn Minh, 1997) Ngược lại với tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ mẫu sạch rất cao, luôn hơn 90% ở cả 4 nghiệm thức (91,7%; 95%; 95%; 96,7%) Sự sai biệt về mặt thống

kê của tỉ lệ mẫu sạch ở các nghiệm thức là không có Dựa vào tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu sống của mẫu cuống lá kết luận nghiệm thức C1 (2 phút) là thời gian phù hợp nhất cho việc xử lý mẫu cuống lá Để đạt được kết quả tốt hơn cho việc khử trùng mẫu cuống lá, nên giảm thời gian hoặc nồng độ của HgCl2 dùng để khử mẫu

Mẫu lá thích hợp với thời gian khử trùng 3 phút, trong khi mẫu cuống lá là 2 phút và mẫu thân là 5 phút Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu sạch và sống ở từng loại mẫu vẫn chưa đạt được sự tối ưu Do ngoài tác động của HgCl2, mẫu còn bị ảnh hưởng bởi cồn 70% và chất kháng sinh dùng trong khử trùng Ngoài ra, tuổi của mô cấy, vị trí lấy mẫu và mùa trong năm cũng ảnh hưởng đến sự nhiễm nấm và khả năng đáp ứng

của mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002)

4.2Môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt nắp ấm

Do khả năng nảy mầm của hạt nắp ấm trong tự nhiên là khá thấp và thời gian nảy mầm lên tới 30 ngày, nên thực hiệnthí nghiệm này có thể giúp tăng khả năng nảy mầm của hạt Hạt là nguồn nguyên liệu nhân giống tiềm năng với

số lượng lớn Hạt nắp ấm sau khi khử trùng, đặt trên môi trường nuôi cấy và theo dõi liên tục trong 30 ngày với các chỉ tiêu về số lượng hạt nảy mầm, tỉ lệ sống và thời gian nảy mầm

Bảng 4.4 Môi trường và đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt nắp ấm in vitro

Nghiệm thức Môi trường Nồng độ đường

(g/l)

Số ngày nảy mầm (ngày)

Tỉ lệ hạt nảy mầm (%)

a  b 

Hình 4.4Quá trình phát triển hạt nắp ấm trên môi trường nghiệm thức

Cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05)

Nghiệm thức D4 (1/2MS + 60 g/l) phù hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt nắp

ấm Thời gian nảy mầm ở nghiệm thức D4 khá sớm, chỉ sau 22 ngày kể từ ngày nuôi cấy với tỉ lệ nảy mầm đạt tới 72,3% Tỉ lệ nảy mầm của hạt nắp ấm phụ thuộc

nhiều vào nồng độ đường ở từng loại môi trường Trong nuôi cấy in vitro, nguồn

cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là do nguồn cacbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Đường cung cấp năng lượng giúp hạt thoát ra khỏi miên trạng, rút ngắn thời gian nảy mầm và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm

Trong môi trường MS, 1/2 MS, WPM tỉ lệ nảy mầm của hạt nắp ấm cao ở nồng độ đường 60 g/l Trong môi trường MS, tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ đường 30 g/l

là 28,7% trong khi ở nồng độ 60 g/l là 39,7%, có sự sai biệt về thống kê so với các

nghiệm thức khác Trong môi trường WPM, tỉ lệ nảy mầm là 37% ở nồng độ đường

30 g/l, tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ 60 g/l đường là 49%, có sự sai biệt thống kê so với các nghiệm thức khác Đặc biệt trong môi trường 1/2 MS, tỉ lệ sống đạt 72,3% ở nồng độ 60 g/l đường, trong khi nồng độ 30 g/l đường tỉ lệ nảy mầm giảm mạnh chỉ còn 29% và có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 2 nồng độ Tuy nhiên ở môi trường

KC không có sự sai biệt về mặt thống kê khi thay đổi nồng độ đường Nồng độ đường 60g/l cho tỉ lệ nảy mầm cao hơn nồng độ 30 g/l trong từng loại môi trường Vậy nồng độ đường phù hợp cho sự nảy mầm của hạt nắp ấm là 60 g/l

Sự khác biệt tỉ lệ nảy mầm giữa hai nồng độ đường còn do lượng nước trong môi trường Hạt hấp thụ nước cung cấp điều kiện cần thiết để thuỷ phân các chất dự trữ bởi enzym như amilaza phân giải tinh bột (Vũ Đức Lưu, 2002) từ đó bắt đầu quá trình nảy mầm của hạt Ở nồng độ đường 30g/l, lượng nước trong môi trường cao có thể gây ức chế sự nảy mầm của hạt nắp ấm Nồng độ đường 60g/l tạo áp suất thẩm thấu (Gate and Greenwood, 1991) tốt hơn cho sự nảy mầm của hạt do giảm đi lượng nước mà hạt hấp thụ

Ngoài ra, ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt còn có thể do hàm lượng GA3 Trong mô thực vật, GA tồn tại ở dạng tự do (dạng hoạt tính) và dạng liên kết (dạng bất hoạt) GA có thể liên kết với đường, tạo GA glucozit nhờ các liên kết đồng hoá trị Dạng liên kết không hoạt tính là dạng dự trữ và vận chuyển (Nguyễn Như Khanh, 2010) Khi nồng độ đường ngoài môi trường tăng, dẫn đến sự chênh lệch nồng độ thì GA dạng dự trữ sẽ bị chuyển hoá thành dạng tự do để hoạt động

do cơ chế điều hoà ở thực vật Hàm lượng GA tăng lên sẽ kích thích quá trình nảy

mầm ở hạt, tăng số lượng hạt nảy mầm

Nếu so sánh giữa các loại môi trường khác nhau, tỉ lệ nảy mầm cũng thay đổi

và số ngày cần để nảy mầm cũng giảm đi hoặc tăng lên Môi trường KC hoàn toàn không phù hợp cho hạt nắp ấm nảy mầm Tỉ lệ nảy mầm thấp, không có sự sai biệt

về mặt thống kê ở 2 nồng độ đường (30 g/l:16%; 60 g/l: 16,7%) và hạt cần tới 30 ngày để nảy mầm Ở môi trường WPM, thời gian cần để nảy mầm là như nhau ở 2 nồng độ đường (20 ngày), tỉ lệ nảy mầm là khá cao (30 g/l: 37%; 60 g/l: 49%) Nguyên nhân của tốc độ nảy mầm cao là do trong môi trường WPM có nồng độ Ca cao nhất so với các môi trường khác Không có Ca, sự bài tiết α – amylase không

xảy ra (Nguyễn Như Khanh, 2010) Bước đầu tiên của việc sinh sản năng lượng để hoạt động của hạt là hoạt động của các enzym thuỷ phân năng lượng dự trữ Vật chất dự trữ được phân cách và chuyển đến những vùng tăng trưởng (Phan Kim Ngọc, 2003) Tuy vậy, thành phần khoáng của WPM không thích hợp để hạt phát triển, nên tỉ lệ nảy mầm không quá 50%

Thời gian cần để hạt nảy mầm trong môi trường MS cao (30 g/l: 25 ngày; 60 g/l: 24 ngày) Tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ đường 30 g/l không có sự sai biệt về mặt thống kê so với môi trường WPM ở cùng nồng độ đường, điều này cũng xảy ra tương tự ở nồng độ đường 60 g/l Tỉ lệ nảy mầm ở môi trường MS thấp do cây nắp

ấm cần hàm lượng dinh dưỡng thấp, môi trường MS giàu dinh dưỡng sẽ ức chế sự nảy mầm, đồng thời nồng độ NH4+ cao trong môi trường gây độc cho cây Điều đó được chứng minh khi so sánh môi trường MS với môi trường 1/2MS, tỉ lệ nảy mầm cao hơn đạt 72,3% ở nồng độ 60 g/l đường Môi trường MS có hàm lượng khoáng

đa lượng giảm đi 1/2 lần là tối ưu cho việc nảy mầm cũng được công nhận ở các công bố trước đó (Jala, 2012; Sani và ctv, 2000; Dinaroti và ctv, 2010)

4.3Hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS ảnh hưởng đến sự phát triển

của cây nắp ấm in vitro

Hạt sau khi nảy mầm được 30 ngày, được cấy chuyền qua môi trường MS với các nồng độ khoáng đa lượng khác nhau để quan sát sự phát triển do cây nấp

ấm không thích nghi với môi trường nhiều chất dinh dưỡng

Bảng 4.5 Nồng độ khoáng đa lượng MS ảnh hưởng đến cây nắp ấm in vitro

Nghiệm

thức

Chiều cao cây (cm)

Số lá Chiều dài lá

(cm)

Số ấm Chiều dài ấm

(cm) E1(MS) 0,42b ± 0,03 4,0a ± 0,28 0,59b ± 0,09 0,8bc ± 0,49 0,14b ± 0,02E2(1/2MS) 0,76a ± 0,07 3,7a ±0,19 0,90a ± 0,07 1,1b ± 0,34 0,19b ± 0,03E3(1/4MS) 0,39b ± 0,02 2,6b ± 0,57 0,96a ± 0,03 2,4a ± 0,16 0,39a ± 0,06E4(1/8MS) 0,23c ± 0,04 2,2b ± 0,00 0,61b ± 0,02 0,0c ± 0,00 0,00c ± 0,00

Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05)

Môi trường MS với hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi 1/2 thích hợp nhất hợp

việc tăng trưởng và phát triển của cây nắp ấm in vitro Các tác giả khác cũng đã công

bố môi trường 1/2MS là phù hợp nhất cho việc nảy mầm của hạt nấp ấm (Nguyễn Thị Thư, 2005, Kompat và ctv, 2007, Dinarti và ctv, 2010) Môi trường 1/2MS có chiều cao cây cao nhất là 0,76 cm và đạt trung bình 3,7 lá/cây

Ở môi trường MS, chiều cao cây chỉ đạt giá trị trung bình là 0,42 cm và có sự sai biệt về mặt thống kê so với môi trường 1/2MS Số lá trung bình của môi trường MS cao đạt

4 lá/cây nhưng không có sự sai biệt về thống kê so với môi trường 1/2MS Xét về chiều dài

lá, cây ở môi trường MS đạt 0,59 cm, sai biệt về thống kê so với môi trường 1/2MS Trong khi đó ở môi trường 1/2MS cây đạt giá trị cao nhất về chiều cao (0,76 cm), sai biệt so với các nghiệm thức khác, số lá đạt trung bình 3,7 lá/cây, chiều dài lá trung bình là 0,9 cm

a 

Hình 4.5 Cây nắp ấm phát triển trên các môi trường nghiệm thức

(a) Môi trường MS, (b) Môi trường 1/2MS, (c) Môi trường 1/4MS, (d) Môi trường 1/8MS

b

a

Nhận thấy môi trường 1/2MS phù hợp cho sự phát triển của cây nhất, vượt trội hơn môi trường MS Điều này do môi trường MS rất giàu muối khoáng gây hiệu quả ức chế lên sự tăng trưởng của các mô, gây độc cho mô (Dương Công Kiên, 2002) Môi trường MS còn chứa hàm lượng ion NH4+ cao có tác động tới việc ức chế cây (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Trong môi trường 1/2MS hàm lượng NH4+ thấp hơn, do hàm lượng khoáng đa lượng đã giảm đi 1/2

Ở môi trường 1/4 MS, ấm phát triển đạt 2,4 ấm/cây và chiều dài ấm đạt 0,39 cm,

có sự sai biệt về thống kê so với các nghiệm thức khác Sự hình thành ấm ở cây nắp ấm phục vụ cho viêc bắt sâu bọ Ở cây bắt mồi, bắt sâu bọ là phương thức căn bản để lấy thức ăn đạm (Vũ Đức Lưu, 2002) Ở một số cây lúc ra hoa, quá trình phát triển diễn ra mạnh thì quá trình sinh trưởng lại tiến hành chậm và có khi dừng hẳn (Nguyễn Như Khanh, 2010) Nhận thấy do ấm được hình thành và phát triển mạnh để đáp ứng nhu cầu thiếu chất dinh dưỡng trong môi trường, đây là phản ứng của cây

Ấm hình thành dẫn tới việc phát triển mạnh của lá (0,96 cm) ở môi trường 1/4MS, không có sự sai biệt về thống kê so với nghiệm thức E2 (1/2MS) Do ở môi trường 1/4MS cần phát triển lá to, vững chắc để hình thành ấm, trong khi ở môi trường 1/2MS lá phát triển là do cây đầy đủ dinh dưỡng Cây tập trung chất dinh dưỡng để phát triển kích thước lá và ấm, dẫn đến việc giảm số lượng lá chỉ đạt 2,6 lá/cây và kiềm hãm sự tăng trưởng cây (0,39 cm) trên môi trường 1/4MS Vậy để cây có ấm to, đẹp thì môi trường 1/4MS là phù hợp nhất

Trong khi đó, ở nghiệm thức E4 (1/8MS) các chỉ số đều không cao Cây cao 0,23 cm, số lá đạt trung bình 2,2 lá/cây và chiều dài lá đạt 0,61 cm, có sự sai biệt so với các nghiệm thức khác Nhận thấy môi trường 1/8MS không thích hợp cho cây nắp

ấm phát triển, do lượng chất dinh dưỡng thấp không đủ cung cấp cho cây

4.4Sự phát sinh chồi từ mẫu thân trên môi trường 1/2MS có bổ sung BA và NAA

Trên môi trường có bổ sung các hợp chất kích thích sinh trưởng phù hợp, cây sẽ phát sinh cụm chồi, do ưu thế ngọn bị ức chế Khi ứng dụng lên cây nấp ấm và theo dõi các chỉ tiêu phát triển cũng như các chỉ tiêu về chồi đạt được những kết quả rất khả quan Các chỉ tiêu được ghi nhận sau 30 ngày và 60 ngày nuôi cấy Tuy nhiên phản