LỜI CẢM ƠN Bài báo cáo nghiên cứu của chúng em có được thành quả như hôm nay là nhờ sự giúp đỡ và quan tâm tận tình của các thầy cô và các anh chị đi trước. Chúng em xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp chân thành và những lời động viên của các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Lạc Hồng. Chúng em xin cảm ơn chị Trịnh Thị Thanh Huyền, người trực tiếp hướng dẫn đề tài nghiên cứu của chúng em đã quan tâm và tận tình hướng dẫn các thao tác kỹ thuật, cũng như các kiến thức về lý thuyết chuyên ngành. Chúng em xin chân thành cảm ơn các anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị Thu Hiền… làm việc tại Phòng Nuôi Cấy Mô Thực Vật, thuộc Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai đã hướng dẫn và giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu. Và cuối cùng em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, người thân, tập thể các bạn khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường khóa 2008, đã giúp đỡ và động viên chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. i MỤC LỤC Mục Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC .i TÀI LIỆU THAM KHẢO iii PHỤ LỤC . iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU .iv DANH MỤC HÌNH ẢNH . v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .vi PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU . 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu, mục đích của đề tài . 1 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài . 2 5. Những đóng góp và mặt hạn chế 2 6. Kết cấu của đề tài . 2 PHẦN II: NỘI DUNG . 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ . 3 1.1.1. Nguồn gốc và hình thái 3 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý 3 1.2. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi . 5 1.2.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật . 5 1.2.2. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro . 5 ii 1.2.3. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi 6 1.2.4. Tăng sinh cụm chồi in vitro . 6 1.2.5. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm 6 1.3. Những vấn đề trong nuôi cấy mô 6 1.3.1. Sự tạp nhiễm . 6 1.3.2. Tính bất định về mặt di truyền . 7 1.3.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 7 1.3.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể . 8 1.4. Các công trình nghiên cứu liên quan 9 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 2.1. Thời gian và địa điểm . 10 2.2. Trang thiết bị và dụng cụ . 10 2.3. Nội dung nghiên cứu . 11 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý lên mẫu cây hà thủ ô đỏ . 11 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ 12 2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ . 14 2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con hoàn chỉnh 15 2.3.5. Thí nghiệm 5: Nuôi trồng trong nhà kính 15 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 17 iii 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý thích hợp để khử trùng mẫu cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb . 17 3.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ 20 3.3. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ . 25 3.4. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con hoàn chỉnh cây hà thủ ô đỏ 29 3.5. Nuôi trồng trong nhà kính . 32 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 35 4.1. Kết luận 35 4.2. Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tình trạng mẫu sau xử lý . 18 Biểu đồ 3.2: Biểu diễn sự tương tác giữa các nồng độ javel sử dụng và thời gian xử lý 19 Biểu đồ 3.3 : Biểu diễn môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ . 26 Biểu đồ 3.4: Biểu diễn môi trường ảnh hưởng đến chiều cao chồi 27 Biểu đồ 3.5: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy 30 Biểu đồ 3.6: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy . 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin và physcion 4 Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng mẫu 11 Bảng 2.2: Khảo sát môi trường tối ưu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ 12 Bảng 2.3: Khảo sát môi trường tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ 14 Bảng 2.4: Khảo sát môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh 15 Bảng 3.1: Tình trạng mẫu hà thủ ô đỏ sau khi khử trùng 3 tuần 18 Bảng 3.2: Kết quả tái sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy 21 Bảng 3.3: Kết quả tăng sinh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy 25 Bảng 3.4: Kết quả chồi tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy . 29 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây hà thủ ô đỏ 3 Hình 3.1: Mẫu hà thủ ô đỏ phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần nuôi cấy .19 Hình 3.2: Các chồi tái sinh phát triển trên các môi trường nuôi cấy sau 4 tuần nuôi cấy . 24 Hình 3.3: Cụm chồi phát triển trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy . 28 Hình 3.4: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 31 Hình 3.5: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 32 Hình 3.6: Cây con hà thủ ô trồng trên giá thể xơ dừa 33 Hình 3.7: Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb 34 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA: Deoxyribonucleic acid ĐHSTTV: Điều hòa sinh trưởng thực vật NAA: Naphthaleneacetic acid KIN: Kinetin BA: N 6 -benzyladenin MS: Murashige & Skoog, 1962 1 PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thảo dược là một nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con người. Trong đó, hà thủ ô đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713 và được sử dụng như một loại thảo dược trường sinh của con người. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây hà thủ ô phân bố chủ yếu ở miền núi phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… hà thủ ô đỏ chủ yếu được biết đến như là một vị thuốc bổ, trị suy nhược thần kinh, ích huyết, khỏe gân cốt, đen râu tóc. Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, chữa đau mỏi tay chân, chữa tóc hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc và kéo dài tuổi thọ [3]. Trong cây hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng hạt hoặc dâm cành [3]. Tuy nhiên, Lin (2003), đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên [1]. Trước đây, nguồn hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nước ta khá dồi dào nhưng gần đây do bị khai thác quá mức và do nạn phá rừng nên lượng hà thủ ô đỏ bị giảm sút, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa bệnh cho con người. Do đó, việc nhân nhanh số lượng cây hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro để đáp ứng nhu cầu cung cấp nguồn dược liệu là hết sức cần thiết. Để góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”. 2. Mục tiêu, mục đích của đề tài - Mục tiêu: xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ. - Mục đích: Tạo cây giống hà thủ ô đỏ có chất lượng cao bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”, được thực hiện trên giống hà thủ ô đỏ do Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai cung cấp. Phạm vi nghiên cứu của đề tài là nuôi cấy từ đoạn thân có chứa chồi ngủ cho đến tái sinh được hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro và chuyển cây ra vườn ươm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài - Tổng quan tài liệu - Thực nghiệm + Bố trí thí nghiệm + Nuôi cấy mô thực vật - Phân tích và xử lý số liệu thống kê 5. Những đóng góp và mặt hạn chế Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”, đã được thực hiện và thu được những kết quả thiết thực trong việc tìm ra các môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi, nhân nhanh cụm chồi, tạo rễ và tìm ra được quy trình khử trùng mẫu. Từ đó nhân giống được số lượng cây nhiều có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu về giống cây hà thủ ô đỏ của thị trường. Tuy nhiên đề tài còn một số hạn chế chưa khắc phục được như: chưa khảo sát được một số yếu tố có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hà thủ ô trong điều kiện in vitro như: độ pH, ánh sáng và nhiệt độ nuôi cấy. 6. Kết cấu của đề tài Đề tài “ Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb ” được chia làm 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3 PHẦN II: NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ 1.1.1. Nguồn gốc và hình thái Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb) - Ngành (Division) : Magnoliophyta - Lớp (Class) : Eudicots - Bộ (Ordo) : Caryophyllales - Họ (Familia) : Polygonaceae - Chi (Genus) : Fallopia - Loài (Species): Fallopia multiflora Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp. Hà thủ ô đỏ là loài dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ, thân quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2 mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống. Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [8]. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc Lào. Ở Việt Nam, chúng phân bố chủ yếu ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát như: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…[3]. 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý Hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ Cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol. Thuốc Hình 1.1: Cây Hà thủ ô đỏ . tiêu: xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ. - Mục đích: Tạo cây giống hà thủ ô đỏ có chất lượng cao bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. . tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb , được thực hiện trên giống hà thủ ô đỏ do Trung tâm Ứng dụng Công