KHẢO sát sự vấy NHIỄM VI SINH vật TRÊN THỊT tươi tại NHÀ HÀNG, QUÁN ăn THUỘC địa bàn THÀNH PHỐ hồ CHÍ MINH

Trước tình hình đó, để tìm hiểu mức độ nhiễm vi sinh vật trên thịt tươi tại các nhà hàng, quán ăn tại TP HCM, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ thực phẩm thuộc Khoa Công nghệ thực phẩm

Tp.HCM, tháng 10 năm 2008

Với tất cả tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – Thiết kế mỹ thuật Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tận tâm chỉ dạy, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong những năm học ở trường Đặc biệt TS Hoàng Kim Anh đã hướng dẫn và giúp đỡ rất nhiều trong thời gian em thực hiện và hoàn thành bài báo cáo

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban lãnh đạo Chi Cục Thú Y Thành Phố Hồ Chí Minh, Cử nhân Hồng Thị Bích Ngọc cùng các cô, chú, anh, chị đang công tác tại Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị – Chi Cục Thú Y Thành Phố đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập và hoàn thành bài luận văn

Đề tài của chúng tôi được thực hiện từ 08/2008 đến 10/2008 tại Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị, Chi Cục Thú Y TP.HCM

Mục đích đề tài là khảo sát sự vấy nhiễm vi sinh vật trên thịt tươi tại các nhà hàng, quán

ăn trên địa bàn 3 quận 1, 3, 5 TP.HCM theo TCVN 7046:2002 Qua khảo sát thực tế 120 mẫu thịt tươi chúng tôi ghi nhận được kết quả:

 Tỷ lệ các mẫu thịt đạt yêu cầu về từng chỉ tiêu vi sinh theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7046:2002) như sau:

 Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có tổng số vi sinh vật hiếu khí trung bình là 3,63.106 khuẩn lạc/g, tỷ lệ đạt là 25%

 Chỉ tiêu E.coli có số lượng vi khuẩn E.coli trung bình là 1,9.104 khuẩn lạc/g, tỷ lệ đạt là 7,5%

 Chỉ tiêu Staphylococcus aureus có số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus trung

bình 3,11.102 khuẩn lạc/g, tỉ lệ đạt 68,3%

 Chỉ tiêu Salmonella có tỷ lệ đạt là 15,83%

 Tỷ lệ các mẫu thịt tươi đạt yêu cầu tất cả 4 chỉ tiêu vi sinh là 5% trong đó tỷ lệ đạt ở các quận 1, 3, 5 lần lượt là 7,5%, 5%, 2,5%

Đề mục Trang

Trang bìa .i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt .iii

Mục lục .iv

Danh sách hình vẽ vi

Danh sách bảng biểu vii

Danh sách các từ viết tắt viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

I Giá trị dinh dưỡng của thịt 3

II Những biến đổi của thịt sau khi giết mổ 5

III Nguồn gốc lây nhiễm vi sinh vật trên thịt 9

IV Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật 10

V Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm 19

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

I Thời gian và địa điểm 21

II Nguyên liệu 21

III Phương pháp tiến hành 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

I Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 41

II Chỉ tiêu E.coli 44

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

I Kết luận 56

II Kiến nghị 57 Tài liệu tham khảo .I Phụ lục A II Phụ lục B .VI Phụ lục C .IX

Hình Trang

Hình 2.1: Vi khuẩn E.coli 11

Hình 2.2: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 14

Hình 2.3: Vi khuẩn Salmonella 17

Hình 3.1: Kết quả thử phản ứng ngưng kết coagulase 33

Hình 3.2: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD và kết quả thử sinh hoá 36

Hình 4.1: Vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA khi phân tích mẫu thịt tươi lấy tại các địa điểm khảo sát .42

Hình 4.2: Vi khuẩn E.coli trên môi trường Rapid’E.coli khi phân tích mẫu thịt tươi lấy tại các địa điểm khảo sát 45

Hình 4.3: Vi khuẩn Staphylococcus aureus trên môi trường BP khi phân tích mẫu thịt tươi lấy tại các địa điểm khảo sát 48

Hình 4.4: Kết quả thử phản ứng ngưng kết coagulase 48

Hình 4.5: Nuôi cấy Salmonella trong môi trường tăng sinh Rappaport và Tetrathionate 51

Hình 4.6: Vi khuẩn Salmonella trên môi trường XLD 52

Hình 4.7: Vi khuẩn Salmonella trên môi trường BGA 52

Hình 4.8: Kết quả cấy sinh hóa Salmonella 53

Hình 4.9: Kết quả thử sinh hóa mẫu dương tính với Salmonella 53

Bảng Trang

Bảng 2.1: Thành phần dưỡng chất trong 100g thịt 4

Bảng 2.2: Thành phần các acid amin thiết yếu có trong thịt 4

Bảng 2.3: Chỉ tiêu cảm quan đối với thịt tươi (TCVN 7046:2002) 19

Bảng 2.4: Chỉ tiêu vi sinh đối với thịt tươi (TCVN 7046:2002) 20

Bảng 2.5: Chỉ tiêu hóa lý của thịt tươi (TCVN 7046:2002) 20

Bảng 3.1 Bảng bố trí mẫu thịt tươi khảo sát 23

Bảng 4.1: Kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí/ 1g thịt tươi trên các mẫu khảo sát 41

Bảng 4.2: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 43

Bảng 4.3: Kết quả số lượng vi khuẩn E.coli/ 1g thịt tươi trên các mẫu khảo sát 44

Bảng 4.4: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu E.coli 46

Bảng 4.5: Kết quả số lượng Staphylococcus aureus/ 1g thịt tươi trên các mẫu khảo sát 47

Bảng 4.6: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu Staphylococcus aureus 49

Bảng 4.7: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu Salmonella 50

Bảng 4.8: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu 4 chỉ tiêu vi sinh 54

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu đạt chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí .44

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu đạt chỉ tiêu E.coli 47

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ mẫu đạt chỉ tiêu Staphylococcus aureus 50

Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu đạt chỉ tiêu Salmonella 54

Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ mẫu đạt 4 chỉ tiêu vi sinh 55

TSVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí

E.coli: Escherichia coli

S.aureus: Staphylococcus aureus

MR: Methyl Red

VP: Voges Proskauer

BP: Baird Parker

PCA: Plate Count Agar

XLD: Xylose Lysine Desoxycholate

BGA: Brilliant Green Agar

TSI: Triple Sugar Iron

LDC: Lysin Decarboxylase

RVS: Rappaport Vassiliadis Broth

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

I ĐẶT VẤN ĐỀ: [11]

Trong xã hội ngày nay, sự phát triển của nền kinh tế đã đem đến cho người dân một cuộc sống đầy đủ hơn, vì thế nhu cầu cuộc sống ngày càng tăng, từ việc phải lo ăn no mặc ấm người dân nay đã nghĩ đến việc ăn ngon mặc đẹp Chất lượng bữa ăn hàng ngày đã được cải thiện đáng

kể, tỉ lệ đạm trong bữa ăn tăng cao mà thịt heo là một nguồn cung cấp đạm được sử dụng phổ biến Tuy nhiên hiện nay quá trình vận chuyển, phân phối, bảo quản thịt đã qua giết mổ không đảm bảo vệ sinh và là nguồn lây nhiễm vi sinh vật rất lớn vào thịt khiến cho thịt cung cấp cho người tiêu dùng không thật sự an toàn

Theo thống kê của Viện vệ sinh y tế công cộng, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250 - 500

vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật, hóa chất, nấm mốc, độc tố nấm mốc… mà trong đó nguyên nhân chủ yếu là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật Số ca ngộ độc thực phẩm tập trung nhiều nhất tại các bếp ăn tập thể, nhà hàng, quán ăn, trường học, khu công nghiệp, khu chế xuất… Từ đó có thể thấy nhà hàng, quán ăn là nơi tiêu thụ nhiều thịt tươi nhưng vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm chưa được quan tâm đúng mức

Trước tình hình đó, để tìm hiểu mức độ nhiễm vi sinh vật trên thịt tươi tại các nhà hàng, quán ăn tại TP HCM, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ thực phẩm thuộc Khoa Công nghệ thực phẩm – Thiết kế mỹ thuật Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ và Trạm chẩn đoán xét nghiệm và điều trị- Chi cục Thú y Thành Phố, dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Kim Anh và cử nhân Hồng Thị Bích Ngọc em thực hiện đề tài: “Khảo sát sự vấy nhiễm vi sinh vậttrên thịt tươi tại nhà hàng, quán ăn thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh”

II MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU:

Mục tiêu: Đánh giá tình hình vệ sinh và mức độ vấy nhiễm vi sinh trên thịt tươi tại nhà hàng, quán ăn trên địa bàn TP Hồ Chí Minh

Yêu cầu: Xác định mức độ vấy nhiễm các vi sinh vật thường gặp trên thịt tươi khảo sát theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046:2002 gồm các chỉ tiêu:

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CỦA THỊT: [6], [7]

Thịt gia súc là nguồn dinh dưỡng giàu năng lượng, giá trị dinh dưỡng của thịt chủ yếu là nguồn protein Protein của thịt là protein hoàn thiện chứa tất cả các acid amin cần thiết cho cơ thể Ngoài ra còn có lipid, thành phần này làm cho thịt có giá trị năng lượng cao hơn và góp phần tăng hương vị thơm ngon của thịt

Protein của thịt là protein hoàn thiện, chứa đủ 8 loại acid amin không thay thế (valine, leucin, izoleucin, methionine, threonine, phenylalanine, tryptophan và lysine) và có tỉ lệ cân đối

Protein có sẵn hay được đưa vào trong thực phẩm tạo cho thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Nó là thành phần không thể thiếu trong tất cả các cơ thể sống, nó tham gia tạo cấu trúc và đảm nhận một số chức năng quan trọng như: vận chuyển, xúc tác, điều hoà…

Protein là hợp phần chủ yếu, quyết định các đặc trưng của khẩu phần thức ăn Nếu thiếu protein trong chế độ ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khoẻ như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn đối với trẻ em, giảm khả năng miễn dịch và khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh

Thiếu protein sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh, làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng canxi giảm, lượng magie tăng cao) Do vậy mức protein chất lượng tốt (protein chứa đầy đủ các acid amin không thay thế với tỉ lệ hợp lý) là cần thiết trong khẩu phần thức ăn cho mọi lứa tuổi

Thịt cung cấp các chất cần thiết cho cơ thể: sắt (Fe), đồng (Cu), photpho (P), magie (Mg) cùng một số các vitamin B1 (thiamin), B2 (riboflavin), PP (niacin), vitamin A

Vitamin hầu hết là các coenzim, nó có vai trò thúc đẩy các phản ứng sinh học trong cơ thể

để tạo năng lượng cho quá trình sống và phát triển của con người Nguồn thịt động vật cung cấp khá đầy đủ những loại vitamin mà cơ thể cần tới Thịt heo chứa nhiều vitamin B1 (0,76 – 0,94 mg), B6 (0,42 – 0,5 mg), thịt bò chứa nhiều B12 (2,0 – 2,7 mg), acid pantotenic (0,7 – 2,0 mg)

Bảng 2.1: Thành phần dưỡng chất trong 100g thịt [6]

Loại thịt

Nước (g)

Protein (g)

Lipid (g) Ca(mg) P(mg) Fe(mg) B1(mg) B2(mg) B3(mg)

Thành phần thịt gồm các mô sau: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô máu, mô xương Các

mô có tính chất và thành phần cấu tạo khác nhau, do đó đặc tính và tỉ lệ các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô quyết định tính chất của thịt Người ta thừa nhận mô cơ và mô mỡ có giá trị sử dụng cao nhất vì con người sử dụng thịt làm thực phẩm để đáp ứng nhu cầu protein cho cơ thể, còn lipid quyết định mức năng lượng của thịt Ngoài ra, theo khái niệm hiện nay, giá trị thịt phụ thuộc chủ yếu vào protein và các thành phần cân bằng thích hợp của các acid amin và đầy đủ các acid amin thiết yếu

Bảng 2.2: Thành phần các acid amin thiết yếu có trong thịt [7]

Hàm lượng (% trong protein) Acid amin

Methionine 2,4 2,5 3,4

II NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA THỊT SAU KHI GIẾT MỔ: [5], [6], [8]

Sau khi giết mổ các tính chất quan trọng của thịt đều thay đổi cơ bản Hướng chung của

sự phá hủy này là sự phá hủy hệ sinh học khi còn sống Nguyên nhân phân hủy này là sự trao đổi chất trong các mô chết ngừng lại, quá trình sinh hóa thuận nghịch bởi enzym chuyển thành quá trình không thuận nghịch Quá trình tổng hợp bị đình chỉ nên hoạt động phá hủy bởi enzym nổi lên hàng đầu Do đó sự phân hủy của mô chính là sự tự phân hủy, bao gồm các giai đoạn:

+ đình chỉ trao đổi chất

+ phân hủy các mối liên kết của những chất cấu tạo mô

+ phân hủy chất phức tạp thành chất đơn giản

Trên thực tế người ta chia các quá trình đó thành 2 nhóm:

+ sự chuyển hóa trong hệ protein dẫn đến biến đổi độ chắc của thịt

+ sự biến đổi trong hệ chất trích ly làm thịt có mùi vị thơm ngon nhất định

Tuy nhiên dựa vào những biểu hiện bên ngoài, người ta chia một cách quy ước những sự biến đổi đó thành bốn giai đoạn:

+ giai đoạn tê cứng

+ giai đoạn chin tới

+ giai đoạn tự phân sâu

+ giai đoạn thối rữa

Ngoài ra còn có trường hợp thịt bị biến chất như: thịt nhạt (pale), mềm (soft), rỉ dịch (exudative) thường gọi chung thịt PSE, thịt thối rữa, mỡ biến chất

2.1 Giai đoạn tê cứng:

Là quá trình sinh hóa phức tạp dưới tác dụng của emzym, đó là quá trình phân giải bao gồm: phân giải glycogen, phân giải ATP, tạo thành phức hợp actomyosin, giải phóng amoniac

2.1.1 Phân giải glycogen:

Sau khi hạ thịt, oxy ngừng cung cấp, giai đoạn này trao đổi năng lượng trong điều kiện hiếu khí suy giảm dần Tuy nhiên, trong khoảng một giờ sau khi hạ thịt lượng oxy vẫn tồn tại một

ít trong Hb (hemoglobin) ở hệ thống mao quản và trong Mb (memoglobin) của tế bào cơ, trao đổi năng lượng hiếu khí còn xảy ra nên cơ co rút mạnh và thoát ra lượng nhiệt đáng kể, hậu quả là nhiệt độ thân thịt tăng lên khoảng 2- 3oC Ngay sau khi hạ thịt độ pH của thịt khoảng 6,8- 7,0 Trị

số này giảm dần và đạt giá trị cuối cùng khoảng 5,3- 5,7 sau khi bảo quản từ 18- 24h ở 0- 4oC

Nguyên nhân của sự giảm pH là do sự tích lũy của acid lactic, sản phẩm phân giải glycogen ở bắp cơ Sự tích lũy acid lactic phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường, lượng glycogen dự trữ của bắp cơ, pH và vị trí của bắp cơ

Hàm lượng acid lactic và trị số pH là chỉ tiêu đánh giá phẩm chất thịt, nó xác định sự bền vững của thịt bảo quản và các chỉ tiêu lý hóa cho quá trình công nghệ Sự acid hóa môi trường có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa Ngoài ra môi trường acid gây phá vỡ màng lysosome để giải phóng các emzym thủy phân protein phát huy tác dụng và có ý nghĩa rất lớn đến quá trình chín tới sau này

Tuy nhiên sự sụt giảm pH quá nhanh hoặc quá chậm sẽ gây ra tình trạng phẩm chất thịt xấu, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển Thịt có pH cao thì có khả năng giữ nước cao giúp cho vi sinh vật dễ phát triển hơn, trái lại thịt PSE vì pH quá acid nên cấu trúc sợi cơ bị hư hỏng nhiều, các protein bị cắt đứt bởi enzym cathepsin thành các sản phẩm mà vi sinh vật dễ dàng sử dụng Do đó hai loại thịt này đều kém bền vững khi bảo quản và dễ bị hư hỏng

2.1.2 Phân giải ATP và sự hình thành phức hợp actomyosin (AM):

Dưới tác dụng của enzyme Myozin-ATPase, ATP bị phân giải thành ADP và giải phóng năng lượng dành cho sự co cơ Vì hàm lượng Ca2+ trong cơ tương luôn đủ cao để hoạt hóa Myozin-ATPase, chúng tiếp tục xúc tác sự thủy phân ATP Các nguồn tái tổ hợp ATP vẫn hoạt động đến một giới hạn pH môi trường nhất định nào đó thì bị đình trệ Nếu sự tổng hợp ATP

không cung cấp đủ cho nhu cầu co rút cơ thì bắp cơ đạt đến giai đoạn cứng đơ (tạo phức chất actomyosin) Sự cứng cơ xảy ra tuần tự từ bắp cơ cổ, chi trước và chi sau, khi đó sự cứng cơ hoàn toàn xảy ra (sự phát triển tê cứng cực đại) trong điều kiện hạ thịt bình thường

2.2 Giai đoạn chín tới:

Chín tới là tập hợp những biến đổi về tính chất của thịt, kết quả là thịt có những biến đổi tốt về hương thơm và vị Thịt trở nên mềm mại và ngon hơn so với thịt cứng, có độ ẩm lớn và dễ

bị tác dụng của enzym tiêu hóa

Sau khi sự tê cứng phát triển cực đại, phức chất actomyosin bắt đầu phân li thành actin và myosin nghĩa là bắp cơ chuyển từ trạng thái co rút sang trạng thái suy yếu Như vậy, vấn đề mềm

mô trong kì đầu của giai đoạn chín tới xảy ra hoàn toàn ngược lại với quá trình tê cứng Chính sự phân ly actomyosin làm gia tăng số trung tâm ưa nước của protein cơ Trong giai đoạn này các base Purine chuyển hóa thành hypoxanthin và xanthin làm thịt có mùi thơm

Kết quả của tiến trình tự phân làm cho thịt có tính acid hơn, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa, đồng thời làm cho thịt có biểu hiện tốt về mùi thơm và vị ngọt, thịt trở nên mềm mại, tươi ngon và dễ bị tác động bởi enzyme tiêu hóa

Khi giai đoạn tê cứng đạt đến mức độ cực đại, phần lớn actomyosin ở trạng thái co rút chuyển sang trạng thái suy yếu và một phần bị phân hóa, dẫn đến khả năng ngưng kết của các mô

cơ tăng lên (85-87%) vì vậy giai đoạn này thịt mềm mại trở lại và tạo điều kiện phân giải protein bởi các enzyme

2.3 Giai đoạn tự phân sâu:

Nếu tiếp tục bảo quản thịt chín tới ở nhiệt độ thấp (0- 4oC) trong điều kiện vô trùng thì sự

tự phân sâu trong thịt sẽ kéo dài

Tự phân sâu có đặc trưng là sự phân giải protein và lipid trong mô cơ sẽ xảy ra nhanh dưới tác dụng của hệ thống enzyne phân giải có sẵn trong bắp cơ Chính sự phân giải protein, lipid sẽ phá hủy hình thái, cấu trúc của mô cơ Hậu quả là độ rắn của thịt giảm đi, độ tích dịch gia tăng, thịt có màu hung nâu, vị chua khó chịu hơn Quá trình khử amin của các phân tử acid amin

sẽ tích lũy NH3 làm cho pH tăng dần theo hướng phù hợp với điều kiện phát triển của vi sinh vật gây thối rữa thì quá trình thối rữa sẽ xảy ra nhanh hơn

2.4 Giai đoạn thối rữa:

Sự thối rữa có thể xảy ra trên bề mặt thịt (thối rữa hiếu khí) hoặc xảy ra trong sâu của khối thịt (thối rữa kỵ khí)

2.4.1.Sự hư hỏng hiếu khí: thường bắt đầu trên bề mặt thịt rồi dần dần chuyển vào gian tầng mô liên kết đến các sợi cơ Sự phân giải protein gây ẩm ướt bề mặt thịt và xuất hiện chất nhầy Thời gian tạo chất nhầy phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật nhiễm ban đầu, độ ẩm và nhiệt độ môi trường sẽ làm cho sự vấy nhiễm tăng cao Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện

có men hỗn hợp phân giải đồng thời protein, lipid, glucid, sau đó các men đơn phân giải protein phá hủy mạnh và triệt để các chất đạm tạo mùi khó chịu và gây độc Vi sinh vật hiếu khí phân giải đạm theo 3 cơ chế: thủy phân acid amin, khử acid amin và loại nhóm NH3 của acid amin Kết quả tạo ra NH3 có mùi khó chịu và làm mất màu đặc trưng của thịt Các acid hữu cơ được tạo ra với hàm lượng thấp không gây ngộ độc nhưng làm thịt có mùi khó chịu Các acid amin có lưu huỳnh ngoài sự tạo thành NH3 còn sản sinh H2S có mùi trứng thối, H2S bị oxy hóa tạo S

H2S + ½ O2 → H2O + S

Sau đó: S + Hb → Thiohemoglobulin, methemoglobulin, sulmoglobin có màu lục 2.4.2 Sự thối rữa kỵ khí: thường bắt đầu trong lớp cơ dày gần xương và khớp xương đồng thời giải phóng khí vào tầng liên kết làm cho thịt trở nên xốp, khi ấn tay nghe tiếng lạo xạo Thịt có màu đỏ xanh hay xanh nhạt, màu thịt trên vết cắt ngang bị biến đổi rất nhanh Mùi thịt trở nên khó ngửi, pH trở nên kiềm (khoảng 8- 9) Các vi sinh vật kỵ khí hay kỵ khí tùy nghi lấy oxy của hemoglobin (HbO2) thực hiện sự oxy hóa các acid amin giải phóng NH3 và H2S

NH3 và H2S bên trong thịt kết hợp với Hb và sắc tố thịt trong điều kiện kỵ khí sẽ tạo ra dihydrosulfua có mùi thối và màu đỏ tía

Các vi sinh vật kỵ khí tùy nghi phân giải protein, lipid, glucid tạo các acid hữu cơ, NH3,

H2S, indol, scatol… gây độc Các vi sinh vật kỵ khí như Clostridium khi nhiễm sâu trong thịt sẽ

gây ra sự hư hỏng kỵ khí và tạo ra các amin gây độc rất mạnh dễ dẫn đến tử vong

Mỡ cũng là môi trường thuận lợi cho một số vi khuẩn và nấm mốc phát triển Các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, nước, kim loại, oxy … tác động lên các nối đôi làm thay đổi cấu trúc hóa học của mỡ làm cho mỡ biến chất Mỡ biến chất thường trải qua giai đoạn hóa chua và oxy hóa Dưới

nhiệt độ cao, mỡ hình thành acrolein từ phản ứng của glycerol (nó sẽ có tác động gây độc cho người tiêu dùng)

III NGUỒN GỐC LÂY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT: [3]

Vi sinh vật nhiễm vào thịt qua 2 con đường chính: nhiễm nội sinh và nhiễm ngoại sinh 3.1 Nhiễm nội sinh: nguồn gốc vi sinh vật từ cơ thể động vật Vi sinh vật có nhiều trên

da, lông, hệ hô hấp và hệ tiêu hóa của động vật Ở động vật khỏe mạnh thì số lượng vi sinh vật trên ít hơn Con vật mang mầm bệnh có thể do làm việc quá sức, ăn uống kém, điều kiện nuôi dưỡng kém vệ sinh làm con vật suy kiệt, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh xâm nhập và phát triển, hoặc do con vật có vết thương bên ngoài nhưng không được chữa trị dẫn đến

sự nhiễm trùng máu, hoặc do chất chứa trong dạ dày, ruột bị vỡ ra trong quá trình giết mổ đã

- Bảo quản ở nhiệt độ 20 – 30oC

- Không che đậy kỹ

- Tay người phục vụ nhiễm khuẩn

nhiễm vào thịt Việc vệ sinh đối với động vật giết thịt sẽ giảm khả năng lây truyền vi sinh vật từ bản thân chúng vào thịt

3.2 Nhiễm ngoại sinh:

Nguồn gốc từ người: vi sinh vật có trên quần áo, đầu tóc, tay chân của người mổ giết Đặc biệt những người mắc bệnh truyền nhiễm còn có khả năng truyền vi trùng gây bệnh vào thịt

Nguồn gốc từ môi trường chung quanh: môi trường mổ giết thịt có nhiều bụi bẩn, phân rác chắc chắn là nguồn lây nhiễm vi sinh vật lớn vào thịt Đặc biệt nguồn nước rửa bị ô nhiễm sẽ

là nguồn ô nhiễm vi sinh vật trực tiếp

Nguồn gốc từ dụng cụ: bàn mổ, dao, dụng cụ đựng, phương tiện chuyên chở đều là nguồn lây nhiễm vi sinh vật vào thịt

IV NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT:

4.1 Vi sinh vật hiếu khí:

Vi sinh vật hiếu khí hay vi sinh vật ưa khí sống trong điều kiện có oxy tự do Chỉ tiêu này cho chúng ta ước lượng về tổng số vi khuẩn (hiếu khí) trong một mẫu thực phẩm nhất định, dựa trên giả định rằng cứ mỗi khuẩn lạc nhìn thấy được là kết quả từ sự nhân lên của một tế bào đơn

lẻ trên bề mặt thạch dinh dưỡng Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ tiêu dùng để đánh giá tổng quát

vệ sinh thực phẩm

4.2 E.coli: [4], [8], [12]

E.coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Chúng có nhiều trong tự

nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột chúng có nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Chúng nhiễm vào đất, nước từ phân của động vật, chúng trở nên gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi

4.2.1 Lịch sử:

1885, Theodor Escherich phát hiện vi khuẩn trong phân trẻ em bị tiêu chảy, ông gọi là

Bacterium coli commune

1889, vi khuẩn được đổi tên là Escherichia

1896, vi khuẩn được đổi tên là Bacterium coli

4.2.3 Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa:

Là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp là 37oC nhưng có thể phát

triển ở 40- 44oC pH thích hợp là 7,4

Trên môi trường Rapid E.coli khuẩn lạc E.coli có màu hồng và tím

Trên các môi trường đường: lên men sinh hơi đường glucose, lactose, galactose Lên men không đều saccharose, không lên men dextrin, glycogen

Các phản ứng sinh hóa đặc trưng: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-), Nitrate (+), ONPG (+), LDC (+)

4.2.4 Sức đề kháng:

Dễ bị diệt ở nhiệt độ trên 60oC trong vòng 30’

Nhiệt độ lạnh 0- 2oC bị diệt trong 2h

Đề kháng với các hóa chất: acid formic, HgCl2/5’

Nhạy cảm với kháng sinh: Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamide, Colestin

4.2.5 Kháng nguyên và độc tố:

Cấu tạo kháng nguyên E.coli rất phức tạp với 4 loại O, H, K, và kháng nguyên pili (F)

Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì tính gây bệnh cũng khác nhau

Các vi khuẩn E.coli gây bệnh được chia làm 5 nhóm:

(1) ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gây tiêu chảy bằng cách tiết 2 loại độc tố: ST (Stable

Toxins) và LT (Labile Toxins)

(2) EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây tiêu chảy, chúng không sinh độc tố ruột, chúng

có yếu tố kết dính nên bám vào màng nhầy ruột và phá hủy các vi nhung mao ruột

(3) EaggEC (Entero aggregative E.coli): gây viêm tế bào ruột và dẫn đến tiêu chảy (4) EIEC (Entero invasive E.coli): E.coli này bám lên niêm mạc ruột làm tróc niêm mạc

gây loét Do đó gây tiêu chảy có màng nhầy lẫn máu

(5) EHEC (Enterohemorrhagic E.coli): chỉ tác động lên ruột già Chúng xâm nhập và

khuếch tán qua tế bào của niêm mạc ruột gây đau bụng quặn, tiêu phân có máu

4.2.6 Tính xâm nhập:

E.coli là một vi khuẩn đường ruột, phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Nếu quá trình giết

mổ, phân phối, bảo quản, vận chuyển, bày bán,… không đảm bảo yêu cầu vệ sinh thì E.coli có

khả năng xâm nhiễm vào thịt và các sản phẩm từ thịt Tỉ lệ nhiễm cao sẽ là nguyên nhân dẫn đến ngộ độc ở người tiêu dùng

4.2.7 Triệu chứng trúng độc:

Liều nhiễm trùng qua thức ăn, uống là 106- 108 vi khuẩn/ml (g) thực phẩm Thời gian ủ

bệnh 8- 44h tùy thuộc dòng E.coli gây độc

Người bị trúng độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng nhiều lần trong nhiều ngày, ít khi nôn mửa, bệnh phát đột ngột Nhiệt độ cơ thể có thể bình thường hay tăng nhẹ, bệnh có thể kéo dài 1- 3 ngày thì khỏi Trường hợp trúng độc nặng có thể sốt cao, mệt mỏi, tay chân co quắp, đổ

mồ hôi, thời gian khỏi bệnh lâu (3- 7 ngày)

Hình 2.2: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

4.3.3 Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa:

Hiếu khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 30- 37oC pH thích hợp 7,0- 7,5

Trên thạch BP (Bairn Packer): tạo khóm đen quanh khóm có vòng sáng

Trên môi trường đường: lên men sinh hơi glucose, mannit, lactose Không lên men glyxerin, ducitol, inulin

Các phản ứng: catalase (+), coagulase (+), phosphatase (+), Dezoxynuclease (+), H2S (-),

MR (+), VP (+), khử NO3 thành nitrit NO2

4.3.4 Kháng nguyên và độc tố:

Kháng nguyên O: bao gồm peptidoglucan, protit A, axit teichoic và một số enzyme gây độc Các enzyme gây độc gồm: catalase, coagulase, hemolynase, staphylokinase làm tan tơ huyết

Nội độc tố: như leukocidin diệt bạch cầu, exfoliative tạo nốt mụn nước trên da,…

Các ngoại độc tố (exotoxin): như α toxin (hemolyzin) và β toxin gây độc cho nhiều loại tế bào và làm tan hồng cầu Ngoại độc tố ruột enterotoxin gây trúng độc thực phẩm

Enterotoxin là độc tố ruột: có khoảng 50% các chủng Staphylococcus aureus có ngoại độc

tố ruột, gồm 6 loại độc tố ruột A B C D E F trong đó A và D thường gây trúng độc thực phẩm Các ngoại độc tố ruột thường bền với nhiệt, sự phá hủy độc tố ruột phải ở nhiệt độ trên 100oC

4.3.5 Tính xâm nhập:

Staphylococcus aureus hiện diện khắp nơi trong thiên nhiên (đất, nước, không khí) thường

có trên da và niêm mạc của người và gia súc, trong các sản phẩm động vật như: thịt, trứng, sữa…

Staphylococcus aureus là vi trùng có tính cơ hội, lan truyền do tiếp xúc trực tiếp qua vết thương

Thực phẩm nhiễm vi khuẩn chủ yếu do người và động vật (bò cho sữa bị viêm vú), nguồn chế biến, nguồn mua thực phẩm bị nhiễm khuẫn da

 Điều kiện cần thiết để bệnh bộc phát:

Thực phẩm phải nhiễm độc tố ruột của tụ cầu vàng

Thực phẩm phải là môi trường tốt cho vi khuẩn phát triển và sinh độc tố

Nhiệt độ phải thích hợp cho sự phát triển của tụ cầu vàng và thời gian cần thiết để sản

sinh đủ lượng độc tố để gây bệnh

4.4 Salmonella: [4], [8], [9], [14]

4.4.1 Lịch sử:

1885 Daniel E.Salmon (Mỹ) phát hiện vi khuẩn từ heo bệnh gọi là Bacterium

choleraesuis

Những năm sau được đổi tên là Salmonella choleraesuis

Trước 1983, Salmonella được chia thành 34 nhóm nhỏ A, B, C, … Các nhóm khác nhau

chủ yếu dựa vào kháng nguyên O, H

Sau 1983 dựa vào phương pháp mã di truyền AND, La Monin và cộng sự (1987) chia

Salmonella làm 2 nhóm chính trong đó có 6 nhóm phụ 2 nhóm chính là: Salmonella enteric ( bao

gồm các Salmonella gây bệnh) và Salmonella bongori ( gồm các Salmonella không gây bệnh)

1994, theo khóa phân loại của Bergey chia Salmonella ra nhiều loài chủ yếu là loài

Salmonella choleraesuis (gây bệnh)

Hiện nay, người ta biết được có đến 2500 loài của Salmonella Chủ yếu gây bệnh thương

hàn, phó thương hàn và trúng độc thực phẩm

4.4.2 Đặc điểm hình dạng:

Thuộc họ vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae

Bắt màu gram âm, trực khuẩn nhỏ

Có khả năng di động bằng tiên mao quanh tế bào

Không tạo bào tử, không tạo giáp mô

Hình 2.3: Vi khuẩn Salmonella

4.4.3 Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa:

Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi pH thích hợp 6,5- 7,5 Nhiệt độ thích hợp 35-37oC

Dễ phát triển trên môi trường dinh dưỡng thông thường, trên môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) có khuẩn lạc đen, tròn, ướt và hơi lồi, trên môi trường BGA (Brilliant Green Agar) có khuẩn lạc trắng hồng, tròn, đục

Trên môi trường đường: lên men sinh hơi glucose, mannit, sorbitol, arabinose Lên men không đều saccharose (tùy chủng) Không lên men lactose, salicin

Các phản ứng sinh hóa: Indol (-), MR (+), VP (-), Citrat (+), H2S (+), ure (-), LDC (+), chuyển hóa NO3→ NO2

4.4.4 Sức đề kháng:

Salmonella dễ bị diệt ở nhiệt độ cao Ở 60oC bị diệt trong 1h, ở 70oC bị diệt trong

20’.Trong thực phẩm đông khô tồn tại lâu

Các loại kháng sinh chloramphenicol, gentamycine, colistin, … diệt khuẩn tốt

Kháng nguyên H là kháng nguyên lông, không chịu nhiệt (bị diệt ở 70oC bị tác dụng của cồn và enzyme phân giải protein, nhưng chịu được phenol) Kháng nguyên H có hai pha (pha đặc hiệu và pha không đặc hiệu) Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh và không gây nhiễm dịch, nó đặc hiệu cho mỗi loài vi khuẩn

Kháng nguyên Vi (virulence) là loại kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O, bao gồm hỗn hợp glucid, lipid và protein Kháng nguyên có tác dụng ức chế sự ngưng kết của kháng nguyên O, và nó bị hủy bởi sức nóng ở 120oC

 Độc tố:

Vi khuẩn Salmonella có 2 loại độc tố là nội độc tố (endotoxin) và ngoại độc tố Trong đó

ngoại độc tố gồm độc tố ruột (enterotoxin) và độc tố thần kinh (neuroroxin)

Ngoài tác dụng gây tiêu chảy, độc tố ruột còn gây viêm loét xuất huyết và thủng ruột Do

vậy tiêu chảy do Salmonella phân thường lẫn máu

Độc tố thần kinh tác động lên thần kinh gây choáng, shock và run rẩy, đi lại khó khăn 4.4.6 Tính xâm nhập:

Nhiễm trước khi giết mổ: Salmonella tồn tại trong cơ thể các loài động vật, khi gặp điều

kiện thuận lợi sẽ gây ra bệnh truyền nhiễm (thương hàn hoặc phó thương hàn) là thể nguyên phát

Còn một số Salmonella có trong đường ruột nhưng không gây bệnh, khi sức đề kháng của con thú

bị suy giảm thì vi khuẩn vào máu gây bệnh thì gọi là thể thứ phát

Vi khuẩn nhiễm vào cơ thể theo đường tiêu hóa Đến ruột non, vi khuẩn thấm qua màng ruột non vào hệ bạch huyết và hạch bạch huyết gây sưng hạch, hủy hoại hạch, sau đó vào máu gây nhiễm trùng máu Vi khuẩn theo máu đến gan, mật nhưng do ưa ruột nên vi khuẩn lại vào ruột

4.4.7 Tính gây bệnh:

Con người và thú là 2 nguồn vấy nhiễm Salmonella trực tiếp và gián tiếp cho thực phẩm,

vi khuẩn xâm nhập sang thịt từ những trường hợp thú bệnh hay thú mang trùng Salmonella có

trong cơ thể người và gia súc với tỷ lệ 5- 10% Khi cơ thể suy nhược hay vì một nguyên nhân nào

đó làm sức khỏe suy yếu, dẫn đến hệ thống miễn dịch giảm, vi khuẩn sẽ dễ gây bệnh

Bệnh thương hàn và ngộ độc thực phẩm cấp gây viêm ruột- dạ dày và nhiễm trùng huyết Thời gian ủ bệnh 12- 24h, có khi 6- 7 ngày Biểu hiện lâm sàng: tiêu chảy, đau bụng, nôn

ói, sốt Bệnh nhẹ kéo dài 2- 3 ngày, không gây biến chứng Trường hợp nặng có thể chuyển sang bệnh thương hàn: sốt cao, đi tiêu nhiều lần lẫn máu có thể thủng ruột nguy hiểm đến tính mạng

 Điều kiện cần thiết để Samonella gây bệnh là:

Thực phẩm nhiễm phải số lượng lớn vi khuẩn (10 triệu tế bào/cơ thể)

Vi khuẩn vào trong cơ thể phải tiết ra một lượng lớn độc tố

Sức đề kháng của cơ thể bị suy yếu

V TIÊU CHUẨN VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM: [1]

Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046: 2002 do Bộ Khoa Học và Công Nghệ ban hành theo quyết định 22/202/QĐ- BKHCN

Bảng 2.4: Chỉ tiêu cảm quan đối với thịt tươi (TCVN 7046:2002)

Trạng thái

- Bề mặt khô, sạch, không dính lông và tạp chất lạ, mặt cắt mịn

- Có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thịt không để lại dấu ấn trên bề mặt khi bỏ tay ra Tủy bám chặt vào thành ống (nếu có)

Màu sắc Màu đặc trưng của sản phẩm

Mùi Đặc trưng của sản phẩm, không có mùi lạ

Nước luộc thịt Thơm, trong, váng mỡ to

Bảng 2.5: Chỉ tiêu vi sinh đối với thịt tươi (TCVN 7046:2002)

1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí (số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm)

2 E.coli (số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm)

3 Salmonella (số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm)

4 Staphylococcus aureus (số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm)

106

102Không được có

102

Bảng 2.6: Chỉ tiêu hóa lý của thịt tươi (TCVN 7046:2002)

Phản ứng dihydrosulfur (H2S) Âm tính

Hàm lượng ammoniac (NH3) (mg/100g) ≤ 35

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM:

Thời gian thực hiện từ: 08/2008 –10/2008

Địa điểm:

Nơi lấy mẫu: tại nhà hàng, quán ăn trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh

Nơi phân tích mẫu: Phòng xét nghiệm vi sinh – Trạm chẩn đoán xét nghiệm và điều trị - Chi cục Thú Y TP Hồ Chí Minh

II NGUYÊN LIỆU:

+ Khẩu trang, bao tay

+ Túi nilon vô trùng

+ Thùng đá bảo quản mẫu

2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

BP (Baird Parker): môi trường chuyên biệt nuôi cấy Staphylococcus aureus

PCA (Plate Count Agar): môi trường nuôi cấy dùng đếm số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí

XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): môi trường phân lập Salmonella

BGA (Brilliant Green Agar): môi trường phân lập Salmonella

TSI (Triple Sugar Iron): kiểm tra đặc tính lên men glucose, lactose, saccharose và sinh

H2S của vi khuẩn Salmonella

LDC (Lysin Decarboxylase): kiểm tra đặc tính sử dụng lysin của vi khuẩn Salmonella

Pepton đệm: dùng pha loãng mẫu

RVS (Rappaport Vassiliadis Broth ): môi trường dùng tăng sinh Salmonella

Tetrathionate: môi trường dùng tăng sinh Salmonella

Rapid' E Coli: môi trường nuôi cấy dùng đếm số khuẩn lạc E coli

2.4 Hóa chất:

Thuốc thử Kovac's

α- naphthol, KOH - 40% (NaOH 10%)

Đĩa giấy thử các phản ứng sinh hóa: Indol, Urease

III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH:

3.1 Đối tượng khảo sát: Mẫu thịt tươi ở nhà hàng, quán ăn tại 3 quận 1, 3, 5 trên địa bàn

TP Hồ Chí Minh

3.2 Các chỉ tiêu xác định và phương pháp xử lý số liệu:

 Cách bố trí lấy mẫu:

Bảng 3.1 Bảng bố trí mẫu thịt tươi khảo sát

Địa điểm lấy mẫu Số lượng (mẫu)

 Phương pháp lấy mẫu:

Mẫu kiểm tra vi sinh: Mẫu thịt tươi được lấy tại các nhà hàng, quán ăn, mẫu phải mang tính đại diện cho quày thịt (các thao tác phải vô trùng) Khối lượng mẫu được lấy khoảng 600g

Cách lấy mẫu: dùng dao vô trùng cắt tại vị trí bất kỳ, cho vào túi nilon 2 lớp có ghi mã số

để vào giữa 2 lớp nilon Cột chặt, để vào thùng đá bảo quản ở nhiệt độ khoảng 0- 40C và chuyển ngay về phòng Vi Sinh - trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục Thú Y Thành phố

Hồ Chí Minh và tiến hành xét nghiệm

 Các chỉ tiêu cần xác định:

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh theo tiêu chuẩn Việt Nam

 Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí:

- Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gam thịt tươi

- Tỉ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

 Chỉ tiêu vi khuẩn E.coli:

- Số lượng vi khuẩn E.coli trên 1 gam thịt tươi

- Tỉ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu E.coli

 Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus:

- Số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus trên 1 gam thịt tươi

- Tỉ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu Staphylococcus aureus

 Chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella:

- Tỉ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella

Tỉ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn 4 chỉ tiêu vi sinh (Tổng số vi khuẩn hiếu khí, E.coli, Staphylococcus

aureus, Salmonella)

 Phương pháp xử lý số liệu: Xử lý số liệu từ các chỉ tiêu theo dõi bằng phương pháp xử

lý thống kê, sử dụng phần mềm Minitab Phần mềm Minitab phù hợp với đề tài và kết quả kiểm tra vi sinh Và độ tin cậy khi sử dụng phần mềm Minitab là 95%

3.3 Phương pháp phân tích mẫu thịt tươi: Phương pháp phân tích mẫu thịt tươi để kiểm tra vi sinh vật được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam

3.3.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (theo TCVN 4884:2005):

Nguyên tắc: đếm số khuẩn lạc có màu trắng đục mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định dựa trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật

Môi trường: PCA (Plate Count Agar)

 Qui trình xét nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khí:

 Tiến hành: trong tủ hút vô trùng

 Cân 25g mẫu và đong 225ml nước peptone đệm cho vào bao nylon vô trùng (các bao nylon đã đuợc nhà sản xuất vô trùng), tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách dập mẫu với máy dập mẫu trong 1 phút/lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Trong thời gian dập mẫu vi sinh vật bị đánh bật ra khỏi các khe kẽ của thực phẩm và hoà đều vào dung dịch mẫu, nâng cao tính đồng nhất (và đồng thời là tính đại diện) của dung dịch mẫu đối với mọi chỉ tiêu kiểm nghiệm

Pha loãng mẫu (nồng độ 10-2,10-3…)

Cấy mẫu (chọn nồng độ thích hợp)

1 ml mẫu/nồng độ/2 đĩa

Ủ 300C/±72h

Đọc kết quả

Đếm khuẩn lạc (chọn KL màu trắng đục)

Cho 10-15 ml PCA vào đĩa

Đồng nhất mẫu Mẫu 25g + 225 ml pepton (10-1)

 Dùng pipet vô trùng tiếp tục pha loãng tới hạn các nồng độ tiếp theo bằng cách lấy 1ml mẫu pha ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml nước peptone đệm đã tiệt trùng (121oC/30’) của ống sau Pha loãng mẫu (nước peptone đệm) tùy theo mức độ vệ sinh của mẫu cần kiểm nghiệm Mỗi độ pha loãng lấy 1ml cho vào đĩa petri rồi thêm vào khoảng 10- 15ml môi trường thạch dinh dưỡng PCA vô trùng đã để nguội 45- 500C Mỗi nồng độ pha loãng cấy 2 đĩa petri

 Trộn đều bằng cách dùng tay xoay tròn đĩa xuôi và ngược lại nhiều lần một cách nhẹ nhàng sao cho mẫu lan đều khắp đĩa, để đông tự nhiên

 Sau đó lật úp đĩa, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C/72h

 Đọc kết quả: đếm số khuẩn lạc màu trắng đục mọc trên các đĩa nuôi cấy, chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15- 300 để tính giá trị trung bình số khuẩn lạc đếm được từ các độ pha loãng và quy ra số lượng vi khuẩn có trong 1g mẫu

 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu được tính theo công thức:

N =

∑ a: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn từ 2 độ pha loãng liên tiếp

n1: số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ nhất

n2: số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ hai

V: thể tích chất cấy trên mỗi đĩa (ml)

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất đã chọn

3.3.2 Xác định số lượng vi khuẩn E.coli (theo ISO 16649-2:2001):

Nguyên tắc: đếm số khuẩn lạc màu tím và màu hồng mọc trên môi trường chuyên biệt

Rapid’ E.coli

Môi trường: Rapid’ E.coli

∑ a V(n1 + 0,1n2)d

 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn E.coli:

 Tiến hành: trong tủ hút vô trùng

 Cân 25g mẫu và đong 225ml nước peptone đệm cho vào bao nylon vô trùng (các bao nylon đã đuợc nhà sản xuất vô trùng), tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách dập mẫu với máy dập mẫu trong 1 phút/lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Trong thời gian dập mẫu vi sinh vật bị đánh bật ra khỏi các khe kẽ của thực phẩm và hoà đều vào dung dịch mẫu, nâng cao tính đồng nhất (và đồng thời là tính đại diện) của dung dịch mẫu đối với mọi chỉ tiêu kiểm nghiệm

Pha loãng mẫu (nồng độ 10-2,10-3…)

Cấy mẫu (chọn nồng độ thích hợp)

Đồng nhất mẫu Mẫu 25g + 225 ml pepton (10-1)

 Dùng pipet vô trùng tiếp tục pha loãng tới hạn các nồng độ tiếp theo bằng cách lấy 1ml mẫu pha ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml nước peptone đệm đã tiệt trùng (121oC/30’) của ống sau Pha loãng mẫu (nước peptone đệm) tùy theo mức độ vệ sinh của mẫu cần kiểm nghiệm Mỗi độ pha loãng lấy 1ml cho vào đĩa petri rồi thêm vào khoảng 10- 15ml môi trường thạch dinh dưỡng Rapid’ E.coli vô trùng đã

để nguội 45- 500C Mỗi nồng độ pha loãng cấy 2 đĩa petri

 Trộn đều bằng cách dùng tay xoay tròn đĩa xuôi và ngược lại nhiều lần một cách nhẹ nhàng sao cho mẫu lan đều khắp đĩa, để đông tự nhiên

 Sau đó lật úp đĩa, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 440C/24h

 Đọc kết quả: đếm số khuẩn lạc màu tím, hồng mọc trên các đĩa nuôi cấy, chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15- 300 để tính giá trị trung bình số khuẩn lạc đếm được từ các độ pha loãng và quy ra số lượng vi khuẩn có trong 1g mẫu

 Số lượng E.coli trong 1g mẫu được tính theo công thức:

N =

∑ a: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn từ 2 độ pha loãng liên tiếp

n1: số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ nhất

n2: số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ hai

V: thể tích chất cấy trên mỗi đĩa (ml)

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất đã chọn

3.3.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (theo TCVN 4830-1:2005):

Nguyên tắc: Xác định trên cơ sở thử phản ứng ngưng kết huyết tương từ khuẩn lạc đặc

trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường phân lập BP

Môi trường: BP (Baird Parker)

∑ a V(n1 + 0,1n2)d

 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Staphylococcus aureus:

 Tiến hành: trong tủ hút vô trùng

 Cân 25g mẫu và đong 225ml nước peptone đệm cho vào bao nylon vô trùng (các bao nylon đã đuợc nhà sản xuất vô trùng), tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách dập mẫu với máy dập mẫu trong 1 phút/lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Trong thời gian dập mẫu vi sinh vật bị đánh bật ra khỏi các khe kẽ của thực phẩm và hoà đều vào dung dịch mẫu, nâng cao tính đồng nhất (và đồng thời là tính đại diện) của dung dịch mẫu đối với mọi chỉ tiêu kiểm nghiệm

 Lấy 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường BP, trang đều khắp bề mặt môi trường bằng que trang vô trùng

Ủ 370C/24-48h

Đồng nhất mẫu

Mẫu 25g + 225 ml pepton (10-1)

Cấy 0,1 ml dung dịch mẫu vào đĩa có chứa môi trường Baird Parker, trang đều

Chọn khuẩn lạc đen tròn, có vòng sáng

Ghi kết quả Thử phản ứng Coagulase

 Sau đó lật úp đĩa, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/24 - 48h

 Đếm số khuẩn lạc: chọn khuẩn lạc đặc trưng có màu đen, tròn, lồi, đường kính từ 1- 1,5mm được bao quanh bởi một vòng sáng trong quanh khuẩn lạc

 Số lượng Staphylococcus aureus trong 1g mẫu được tính theo công thức:

 Tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận trên mỗi đĩa đã chọn

a =

a: số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được nhận trên mỗi đĩa

đã chọn

Ac: là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase

Anc : là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase

bc : là số lượng khuẩn lạc điển hình có phản ứng dương tính với coagulase

bnc: là số lượng khuẩn lạc không điển hình có phản ứng dương tính với coagulase

Cc: là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa

Cnc: là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa

 Tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã được nhận dạng

n1: là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất

n2:là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai

d: là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng)

 Chú thích:

Khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc màu xám, bóng lồi (có đường kính 1- 1,5mm, sau khi ủ 24h) từ 1,5- 2,5mm sau khi ủ 48 giờ và được bao quanh bởi một vòng trong rõ rệt Sau khi

ủ trong ít nhất 24h, có thể xuất hiện một vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc

Các khuẩn lạc không điển hình có cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các đặc điểm sau:

+ Các khuẩn lạc đen bóng có hoặc không có viền trắng hẹp, không có vòng trong hoặc hầu như không nhìn thấy và không có vòng trắng đục hoặc rất khó nhìn thấy

+ Các khuẩn lạc màu xám không có vòng trong

+ Các khuẩn lạc khác là tất cả các khuẩn lạc còn lại có khả năng có mặt trên các đĩa mà không cho thấy biểu hiện bên ngoài như khuẩn lạc điển hình và không điển hình như mô

tả ở trên

 Thử khả năng đông huyết tương (COAGULASE TEST): [2]

Nguyên tắc: Kiểm tra khả năng của một vi sinh vật làm đông huyết tương do tác dụng của men coagulase (staphylocoagulase)

Cơ sở sinh hoá: Men staphylocoagulase (coagulase do staphylococcus tạo ra) khá bền

nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ đến 600C trong 30 phút Men có bản chất protein, được các

chủng S.aureus ở người tiết ra ngoại bào và dễ dàng bị bất hoạt hoá bởi các men phân giải protein

(protease) Tuy chưa rõ về cấu trúc hoá học và cơ chế chính xác của staphylocoagulase song có nhiều giả thiết được nêu ra về cơ chế tác động của men này Dưới đây là một số giả thiết đó:

Như đã biết, coagulase có vai trò trong sự đông kết Nó tác động lên vài hợp phần có trong huyết tương và tạo ra những khối đông Trong điều kiện in vitro, coagulase làm tăng mức

độ đông huyết tương , tao nên những sản phẩm cuối là khối đông kết dạng sợi

Huyết tương –(men coagulase của vi sinh vật) > khối đông

Cơ chế thông thường của qúa trình đông huyết tương có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Prothrombin - <Ca ++, thromboplastin (men thrombokinase)> > thrombin Fibrinogen <thrombin> > fibrin (khối đông)

Coagulase là một chất giống prothrombin có khả năng tác động lên những yếu tố bình thường của huyết tương để sinh ra một chất giống thrombin, chất này đến lượt mình lại biến fibrinogen thành fibrin

Quá trình đông huyết tương xảy ra theo hai bước:

- Phản ứng giữa men do vi sinh vật tạo ra, một loại tiền-coagulase(procoagulase) với một yếu tố hoặc một chất kích hoạt có trong huyết tương tạo nên coagulase:

- Sự đông kết thực sự của huyết tương do tác động của coagulase

Yếu tố vi sinh vật thực sự là procoagulase, yếu tố huyết tương là một phân đoạn globulin giống- nhưng không đồng nhất- với prothrombin

Có bằng chứng cho thấy rằng men coagulase (mà giả thiết trên coi thực ra là procoagulase) tồn tại ở hai dạng - coagulase liên kết (gắn liền với tế bào) và coagulase tự do Coagulase lien kết được phát hiện qua test đông huyết tương trên lam song không có trong dịch lọc sau khi đã giữ vi khuẩn lại Coagulase liên kết hay yếu tố ngưng kết (clumping factor) có khả năng biến trực tiếp fibrinogen thành fibrin mà không cần có sự tham gia của các yếu tố huyết tương và không bị ức chế bởi các kháng thể của coagulase tự do Phương pháp thử coagulase trong ống nghiệm cho phép phát hiện cả hai loại coagulase (dạng lien kết lẫn dạng tự do) mà sự khác biệt duy nhất giữa chúng là các tính chất kháng nguyên

 Phương pháp thử:

Nhỏ 1 giọt thuốc thử Staph Plus lên giấy thử Dùng đầu tăm vô trùng chấm vào khuẩn lạc thuần và hòa tan vào giọt thuốc thử để kiểm tra vi khuẩn này có men coagulase hay không Quan sát sự hình thành tức thời chất kết tủa trong dạng những đám ngưng kết màu đỏ Phản ứng (+) là phản ứng tạo kết tủa lợn cợn màu đỏ xuất hiện trong khoảng 5- 20 giây Chứng tỏ vi khuẩn này