KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VẤY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT HEO TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ NHÀ HÀNG QUÁN ĂN THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VẤY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT HEO TƯƠI TẠI MỘT SỐ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VẤY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT HEO TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ NHÀ HÀNG QUÁN ĂN THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Họ và tên sinh viên : ĐÀM THỊ THẢO MY

Niên khóa : 2004 – 2009

Tháng 09/2009

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VẤY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT HEO TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ NHÀ HÀNG, QUÁN ĂN THUỘC ĐỊA

BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực tập: ĐÀM THỊ THẢO MY

Tên luận văn: “KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VẤY NHIỄM VI SINH VẬT TRÊN THỊT HEO TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ NHÀ HÀNG QUÁN ĂN THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH”

Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp ngày 17/09/2009

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ ANH PHỤNG

LỜI CẢM TẠ

Luôn luôn ghi nhớ

Công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ suốt đời tần tảo, hy sinh, vất vả nuôi dạy con ăn học

Các anh chị em đã động viên, giúp đỡ mọi mặt và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập

Chân thành cám ơn sâu sắc

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Toàn thể thầy cô khoa chăn nuôi Thú Y

Đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi

ở giảng đường

Chân thành ghi ơn

Thầy LÊ ANH PHỤNG

Đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Anh NGUYỄN THANH LONG

Đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Chân thành biết ơn

Ban lãnh đạo Chi cục Thú Y TP Hồ Chí Minh

Các anh, chị tại Trạm Chẩn Đoán - Xét nghiệm và Điều Trị - Chi cục Thú Y TP

Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Gia đình và bạn bè đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ trong thời gian thực tập tốt nghiệp

Đàm Thị Thảo My

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài được tiến hành từ 02/ 2009 đến 06/ 2009 tại Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm

và Điều Trị thuộc Chi Cục Thú Y Thành phố Hồ Chí Minh, mục đích để khảo sát tình trạng vấy nhiễm vi sinh vật trên thịt heo tại một số chợ và nhà hàng quán ăn trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh Qua kết quả xét nghiệm trên 154 mẫu thịt heo được lấy tại các chợ và nhà hàng quán ăn thuộc các quận A, B và C

Tỷ lệ các mẫu thịt heo đạt yêu cầu về từng chỉ tiêu vi sinh theo TCVN 7046-

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn iii

Tóm tắt luận văn iv

Mục lục v

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các sơ đồ x

Danh sách các biểu đồ xi

Danh sách chữ viết tắt xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giá trị dinh dưỡng của thịt 3

2.2 Những biến đổi của thịt sau khi giết mổ 5

2.2.1 Giai đoạn tê cứng 5

2.2.1.1 Phân giải glycogen 5

2.1.1.2 Phân giải ATP và sự hình thành phức hợp actomyosin (AM) 6

2.1.2 Giai đoạn chín tới 6

2.1.3 Giai đoạn tự phân sâu 6

2.1.4 Giai đoạn thối rửa 6

2.1.4.1 Sự thối rửa hiếu khí 7

2.1.4.2 Sự thối rửa kỵ khí 7

2.3 Nguồn gốc lây nhiễm vi sinh vật 7

2.3.1 Vấy nhiễm giai đoạn trước khi giết mổ 7

2.3.2 Vấy nhiễm giai đoạn giết mổ 8

2.3.3 Vấy nhiễm giai đoạn vận chuyển và bày bán 8

2.4 Vấy nhiễm thực phẩm do vi sinh vật 9

2.4.1 Vi sinh vật hiếu khí 9

2.4.2 Escherichia coli 9

2.4.3 Salmonella 11

2.4.4 Staphylococcus aureus 12

2.4.5 Clostridium perfringens 14

2.4.6 Bacillus cereus 15

2.4.7 Clostridium botulinum 16

2.5 Các phương pháp thử nhanh trong kiểm tra vi sinh vật 17

2.5.1 Kỹ thuật mới phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm 17

2.5.2 Sử dụng công nghệ nano để phát hiện vi sinh vật vấy nhiễm thực phẩm 18

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 19

3.1 Thời gian và địa điểm 19

3.1.1 Thời gian 19

3.1.2 Địa điểm 19

3.2 Vật liệu 19

3.2.1 Đối tượng khảo sát 19

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 19

3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20

3.2.4 Hóa chất 20

3.2.5 Chế phẩm sinh học 20

3.3 Nội dung đề tài 20

3.4 Phương pháp tiến hành 21

3.4.1 Cách bố trí lấy mẫu 21

3.4.2 Phương pháp kiểm tra vi sinh mẫu thịt tươi 21

3.4.2.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí 23

3.4.2.2 Kiểm tra vi khuẩn E coli 24

3.4.2.3 Kiểm tra vi khuẩn Staphylococcus aureus 25

3.4.2.4 Kiểm tra vi khuẩn Salmonella 27

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 29

3.5.1 Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 29

3.5.2 Chỉ tiêu vi khuẩn E coli 29

3.5.3 Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus 29

3.5.4 Chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella 29

3.5.5 Tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn cả 4 chỉ tiêu vi sinh 29

3.6 Xử lý số liệu 29

Chương 4 : KẾT QUẢ THẢO LUẬN 31

4.1 Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 31

4.1.1 Kết quả đếm số lượng TSVKHK trên thịt heo tươi 31

4.1.2 Tỷ lệ mẫu thịt heo tươi đạt yêu cầu về chỉ tiêu TSVKHK 32

4.2 Chỉ tiêu E coli trên thịt heo tươi 36

4.2.1 Số lượng vi khuẩn E coli trên 1g thịt heo tươi 36

4.2.2 Tỷ lệ mẫu thịt heo tươi đạt yêu cầu về chỉ tiêu E coli 37

4.3 Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus 40

4.3.1 Số lượng vi khuẩn S aureus nhiễm trên 1gam thịt heo tươi 40

4.3.2 Tỷ lệ mẫu thịt heo đạt yêu cầu về chỉ tiêu S aureus 41

4.4 Chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella 44

4.5 Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về tất cả 4 chỉ tiêu vi sinh 47

Chương 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 1: TCVN 7045-2002 56

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM 57

PHỤ LỤC 3: XỬ LÝ THỐNG KÊ 60

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần các amino acid thiết yếu có trong thịt 3

Bảng 2.2 Thành phần dưỡng chất trong 100g thịt 4

Bảng 3.1 Bố trí số mẫu thịt heo tươi từ chợ và nhà hàng quán ăn cho thí nghiệm 21

Bảng 4.1 Kết quả đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí/1g thịt heo khảo sát 31

Bảng 4.2: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 33

Bảng 4.3 Số lượng trung bình E coli/ 1g thịt heo tươi khảo sát 36

Bảng 4.4 Tỷ lệ các mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu E coli 38

Bảng 4.5 Số lượng trung bình Staphylococcus aureus /1g thịt heo khảo sát 41

Bảng 4.6 Tỷ lệ các mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu Staphylococcus aureus 42

Bảng 4.7: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu Salmonella 45

Bảng 4.8 Tỷ lệ mẫu thịt tươi đạt yêu cầu cả 4 chỉ tiêu vi sinh 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli 9

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella 11

Hình 2.3 Vi khuẩn S aureus 13

Hình 2.4 Vi khuẩn Clostridium perfringens 15

Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus cereus 16

Hình 2.6 Vi khuẩn Clostridium botulinum 17

Hình 4.1 Khuẩn lạc VKHK trên môi trường PCA 34

Hình 4.2 Khuẩn lạc E coli trên môi trường Rapid’s E coli 39

Hình 4.3 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus mọc trên môi trường BP 43

Hình 4.4 Phản ứng đông huyết tương của vi khuẩn S aureus 44

Hình 4.5 Vi khuẩn Salmonella mọc trên môi trường XLD 46

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Nguồn gốc nhiễm vi sinh vật trên thịt 8

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình xét nghiệm vi sinh vật trong thịt heo tươi 22

Sơ đồ 3.2 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn hiếu khí 23

Sơ đồ 3.3 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn E coli 24

Sơ đồ 3.4 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn S aureus 26

Sơ đồ 3.5 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Salmonella 28

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu TSVKHK ở chợ và NHQA 34 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu TSVKHK của chợ và NHQA thuộc 3 quận 35

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu vi khuẩn E coli ở chợ và NHQA 38 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu vi khuẩn E coli ở chợ và NHQA

XLD: Xylose Lysine Desoxycholate

BGA: Brillant Green Agar

MKTTn: Novobioxin Tetrathionat Muller Kauffmann

NA: Nutrient Agar

Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 205 – 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 đến 10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong Nguyên nhân gây ngộ độc

thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (33% - 49%) chủ yếu do các chủng Salmonella, E

coli, do thức ăn bị ô nhiễm hóa chất, do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên, nấm mốc,

độc tố nấm mốc… Trong đó nguyên nhân chính gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm là do sự vấy nhiễm vi sinh vật và độc tố của chúng

Do đó để đảm bảo sức khỏe cho con người, tất cả nơi cung cấp sản phẩm động vật từ cơ sở giết mổ tới các chợ sỉ và lẻ, các nhà hàng quán ăn phải thực hiện các quy định của ngành thú y và phải được kiểm tra sự vấy nhiễm vi sinh vật nhằm đem lại sản phẩm sạch, an toàn góp phần bảo vệ sức khỏe cho người dân thành phố nói riêng và cho cả nước nói chung

Xuất phát từ tình hình trên, được sự đồng ý của trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, khoa Chăn Nuôi Thú Y, được sự hướng dẫn của TS LÊ ANH PHỤNG và

cử nhân NGUYỄN THANH LONG chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình vấy nhiễm vi sinh vật trên thịt tươi tại một số chợ lẻ và nhà hàng quán ăn thuộc địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh”

1.2 MỤC ĐÍCH

Khảo sát đánh giá tình hình vấy nhiễm vi sinh vật trên thịt tươi tại một số chợ lẻ

và nhà hàng quán ăn thuộc địa bàn TP.HCM, nhằm đánh giá chất lượng thịt heo tươi được cung cấp cho chợ và nhà hàng quán ăn

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CỦA THỊT

Thịt là một trong những nguồn thức ăn cung cấp protein quan trọng nhất cho con người Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1998) thịt là loại thực phẩm được hình thành bằng cách gia công thích ứng các súc thịt nguyên vẹn hoặc bộ phận các súc thịt Theo khái niệm hiện nay, giá trị thịt phụ thuộc chủ yếu vào protein và các thành phần cân bằng thích hợp của các acid amin và đầy đủ acid amin thiết yếu (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004)

Lipid động vật là thành phần quyết định mức năng lượng, màu sắc, mùi vị, sự thơm ngon và sự mềm mại của sản phẩm Lipid động vật còn là dung môi hòa tan các vitamin trong dầu như retinol, vitamin K, … giúp cho cơ thể hấp thu (Phan Hoàng Thi và Đoàn Thị Ngọt, 1984)

Bảng 2.1 Thành phần các acid amin thiết yếu có trong thịt Acid amin

Bảng 2.2 Thành phần dưỡng chất trong 100g thịt

Khoáng Vitamin Loại thịt Nước

(g)

Protein (g)

Lipid (g) Ca

(mg)

P (mg)

Fe (mg)

cơ thể được xếp vào nhóm các yếu tố đa lượng (macroelements), số khác có hàm lượng nhỏ được xếp vào nhóm các yếu tố vi lượng (microelements) Các yếu tố đa lượng là Ca (1,5%), Mg (0,05%), K (0,35%), Na (0,15%); Các yếu tố vi lượng là I, F,

Cu, Co, Mn, Zn còn gọi là yếu tố vết (http://www.thuvienkhoahoc.com)

Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho các hoạt động chức năng của con người Vitamin B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzym (tham gia vào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoá đường và quá trình phát triển của cơ thể Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic sẽ tích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh Vì thế nhu cầu vitamin B1 đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng

− Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất là đối với sự nhìn màu Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị

giác hoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người (http://vi.wikipedia.org/wiki/vitamin)

2.2 NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA THỊT SAU KHI GIẾT MỔ

Sau khi giết mổ các tính chất quan trọng của thịt đều thay đổi cơ bản Nguyên nhân phân hủy này là sự trao đổi chất trong các mô chết ngừng lại, quá trình sinh hoá thuận nghịch bởi enzym chuyển thành quá trình không thuận nghịch Do đó sự phân hủy của mô chính là sự tự phân hủy (Nguyễn Ngọc Tuân và Lê Thanh Hiền, 2004), gồm các giai đoạn: đình chỉ trao đổi chất, phân hủy các mối liên kết của những chất cấu tạo mô và phân hủy chất phức tạp thành chất đơn giản

Những biến đổi này nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tình trạng sức khỏe con vật trước khi giết mổ, thành phần hóa học của thịt, điều kiện vệ sinh khi giết mổ, nhiệt độ môi trường (Phạm Thanh Hoàng, 2002)

Tuy nhiên dựa vào những biểu hiện bên ngoài, người ta chia thành 4 giai đoạn: giai đoạn tê cứng, giai đoạn chín tới, giai đoạn tự phân sâu và giai đoạn thối rửa (Nguyễn Ngọc Tuân, 1997)

2.2.1 Giai đoạn tê cứng

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1997), sự tê cứng xảy ra trên quầy thịt sau khi thú bị

hạ thịt là quá trình sinh hóa phức tạp dưới sự xúc tác của enzyme phân giải các thành phần dưỡng chất, đó là quá trình phân giải gồm phân giải glycogen, phân giải ATP, tạo thành phức hợp actinomyosin, giải phóng amoniac

2.2.1.1 Phân giải glycogen

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1997), sau khi hạ thịt, oxy ngừng cung cấp, giai đoạn này trao đổi năng lượng trong điều kiện hiếu khí suy giảm dần Tuy nhiên, trong khoảng một giờ sau khi hạ thịt lượng oxy vẫn tồn tại một lượng ít trong Hb (hemoglobin) ở hệ thống mao quản và trong Mb (myoglobin) của tế bào cơ, trao đổi năng lượng hiếu khí còn xảy ra nên cơ co rút mạnh và thoát ra lượng nhiệt đáng kể, hậu quả là nhiệt độ thân thịt tăng lên khoảng 2 – 3oC Ngay sau khi hạ thịt độ pH của thịt khoảng 6,8 – 7,0 Trị số này giảm dần và đạt giá trị cuối cùng khoảng 5,3 – 5,7 sau khi bảo quản từ 18 – 24h ở 0oC – 4oC

2.2.1.2 Phân giải ATP và sự hình thành phức hợp actomyosin (AM)

Theo Nguyễn Phước Nhuận, Đỗ Hiếu Liêm và Huỳnh Thị Bạch Yến (2001), sau khi hạ thịt hàm lượng Ca2+ trong cơ tương luôn đủ cao để hoạt hóa M – ATP, nên chúng tiếp tục xúc tác thủy phân ATP tạo sự co rút các tế bào cơ, tiến trình co rút xảy

ra liên tục, đến lúc nào đó sẽ sử dụng hết nguồn ATP dự trữ, khi ATP không cung cấp đủ nhu cầu co rút thì bắp cơ đạt đến giai đoạn cứng đơ dần dần cho đến tê cứng hoàn toàn

2.2.2 Giai đoạn chín tới

Là tập hợp những biến đổi về tính chất của thịt, kết quả là thịt có những biến đổi tốt về hương thơm và vị Thịt trở nên mềm mại và ngon hơn so với thịt cứng, có độ

ẩm lớn và dễ bị tác dụng của enzym tiêu hóa

Sau khi sự tê cứng phát triển cực đại, phức chất actomyosin bắt đầu phân ly thành actin và myosin nghĩa là bắp cơ chuyển từ trạng thái co rút sang trạng thái suy yếu Như vậy, vấn đề mềm mô trong kỳ đầu của giai đoạn chín tới xảy ra hoàn toàn ngược lại với quá trình tê cứng Chính sự phân ly actomyosin làm gia tăng số trung tâm ưa nước của protein cơ Trong giai đoạn này các base purine chuyển hóa thành hypoxanthin và xanthin làm thịt có mùi thơm (Đỗ Hiếu Liêm, 1998)

2.2.3 Giai đoạn tự phân sâu

Nếu tiếp tục bảo quản thịt chín tới ở nhiệt độ thấp (0 - 4oC) trong điều kiện vô trùng thì sự tự phân sâu trong thịt sẽ kéo dài

Tự phân sâu có đặc trưng là sự phân giải protein và lipid trong mô cơ sẽ xảy ra nhanh dưới tác dụng của hệ thống enzyme phân giải có sẵn trong bắp cơ Chính sự phân giải protein, lipid sẽ phá hủy hình thái, cấu trúc của mô cơ, hậu quả là độ rắn của thịt giảm đi, độ tích dịch gia tăng, thịt có màu hung nâu, vị chua khó chịu hơn Quá trình khử amin của các phân tử acid amin sẽ tích lũy NH3 làm cho pH tăng dần theo hướng phù hợp với điều kiện phát triển của vi sinh vật gây thối rửa thì quá trình thối rửa sẽ xảy ra nhanh hơn

2.2.4 Giai đoạn thối rữa

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1997), sự thối rữa có thể xảy ra trên bề mặt thịt (thối rữa hiếu khí) hoặc xảy ra trong sâu của khối thịt (thối rữa kỵ khí)

2.2.4.1 Sự thối rữa hiếu khí

Theo Lê Xuân Phương (1998), quá trình thối rữa hiếu khí bắt đầu từ bề ngoài của thịt dần dần sẽ ăn sâu vào trong theo các lớp tiếp giáp giữa cơ thể thịt với xương, hoặc các mạch màu lớn Quá trình này xảy ra theo 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Trên bề mặt thịt mọc các khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí và thay đổi cảm quan của thịt chưa rõ ràng

Giai đoạn 2: Bắt đầu khi thấy rõ các khuẩn lạc và bề mặt thịt bị mềm, thịt bị thay đổi màu sắc và mùi, phản ứng của thịt ngã sang kiềm, nhưng bên trong thịt vẫn tốt Giai đoạn 3: Vi khuẩn phát triển mạnh trong thịt làm cho các mô liên kết bị đứt

và protein bị phân hủy

2.2.4.2 Sự thối rữa kỵ khí

Thường bắt đầu trong lớp cơ dày gần xương và khớp xương đồng thời giải phóng khí vào tầng liên kết làm cho thịt trở nên xốp, khi ấn tay nghe tiếng lạo xạo Thịt có màu đỏ xanh hay xanh nhạt, màu thịt trên vết cắt ngang bị biến đổi rất nhanh, mùi thịt trở nên khó ngửi, pH trở nên kiềm (pH = 8 - 9) Các vi sinh vật kỵ khí hoặc kỵ khí tùy nghi lấy oxy của hemoglobin (HbO2) thực hiện sự oxy hóa các acid amin giải phóng NH3 và H2S NH3 và H2S bên trong thịt kết hợp với Hb và sắc tố thịt trong điều kiện kỵ khí sẽ tạo ra dihydrosulfua có mùi thối và màu đỏ tía (Nguyễn Ngọc Tuân và Lê Thanh Hiền, 2004)

2.3 NGUỒN GỐC VẤY NHIỄM VI SINH VẬT

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (2002), một trong những nguồn vấy nhiễm cho quầy thịt trong dây chuyền giết mổ chính là thú sống, đặc biệt trong tháng mùa mưa Điều cần thiết là thú phải được tắm sạch sẽ và khô ráo trước khi lên xe vận chuyển đến lò sát sinh

2.3.1 Vấy nhiễm giai đoạn trước khi giết mổ

Tình trạng sinh lý của gia súc ngay trước khi hạ thịt có ảnh hưởng sâu xa đến phẩm chất thịt và sự phát triển vi sinh vật gây hư hỏng Vi khuẩn sớm lan tràn từ ruột vào máu, phân tán khắp trong thịt và phủ tạng (Đỗ Hiếu Liêm, 1998)

2.3.2 Vấy nhiễm trong giai đoạn giết mổ

Trong lúc lấy huyết, vi khuẩn có thể vào tĩnh mạch cổ hay tĩnh mạch chủ trước theo máu đến bắp cơ, phổi và tủy xương Vấy nhiễm bằng con đường này rất nguy hiểm nhưng hiếm xảy ra

Dưới điều kiện bình thường, nặng nhất và nguy hiểm nhất là vi khuẩn trong ống tiêu hóa vấy nhiễm sang quầy thịt

Vấy nhiễm vi khuẩn trên bề mặt quày thịt bởi vi khuẩn khu trú ở da lông cũng chiếm phần quan trọng

Nghiên cứu của Empey và Scott (1939) đã chỉ rằng các nguồn vấy nhiễm quan trọng là lông dính đất và những chỗ kín khác, chứa vật trong dạ dày ruột, nước, chất thải và dụng cụ (Trích dẫn của Nguyyễn Ngọc Tuân, 2002) Và nguồn gây vấy nhiễm chính trên bề mặt quày thịt là lông và chỗ kín trên thú hạ thịt

2.3.3 Vấy nhiễm giai đoạn vận chuyển và bày bán

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (2002) quá trình vận chuyển thịt từ nơi giết mổ đến chợ sạp bán hàng cũng là nguồn gây nhiễm vi sinh vật rất quan trọng Ngoài ra, sự vấy nhiễm còn do côn trùng, động vật gặm nhắm, bụi bặm và ý thức vệ sinh của người mua bán

Vấy nhiễm vi sinh vật trên thịt

Khâu giết mổ Khâu vận chuyển Khâu bày bán

Sơ đồ 2.1 Nguồn gốc nhiễm vi sinh vật trên thịt (Phạm Ngọc Kim Thanh, 1999)

Vận chuyển không hợp vệ sinh

Cấu trúc bề măt sạp Môi trường buôn bán Hình thức buôn bán

Vệ sinh người bán

2.4 VẤY NHIỄM THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT

2.4.1 Vi sinh vật hiếu khí

Vi sinh vật hiếu khí sống trong điều kiện có oxy tự do Chỉ tiêu này cho chúng ta ước lượng về tổng số vi khuẩn hiếu khí trong một mẫu thực phẩm nhất định, dựa trên giả định rằng cứ mỗi khuẩn lạc nhìn thấy được là kết quả từ sự nhân lên của một tế bào đơn lẻ trên bề mặt thạch dinh dưỡng Tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ tiêu dùng

để đánh giá tổng quát vệ sinh thực phẩm và chỉ điểm khả năng hư thối của sản phẩm (Andrew, 1992; dẫn liệu Nguyễn Thị Hồng Yến, 1999)

2.4.2 Escherichia coli

E coli là một phần của hệ vi sinh đường ruột của người và động vật E coli gây

bệnh nhiễm thường gặp trên thú non, trẻ em, nhiễm trùng huyết ở trẻ sơ sinh Còn gây ngộ độc thực phẩm do các type gây bệnh phát triển mạnh mẽ trong thức ăn, đó là

do các type O3, O4, O44, O26, O86, O111, O119, O125, O126, O127, O157… (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

Lịch sử (Tô Minh Châu, 2005)

– 1885, Theodor Escherich phát hiện vi khuẩn trong phân trẻ em bị tiêu chảy,

ông gọi là Bacterium coli commune

– 1889: vi khuẩn được đổi tên là Escherichia

Dạng trực khuẩn, Gram (+), di động bằng tiên mao (flagella) quanh tế bào, không tạo bào tử (spore), có hay không có giáp mô (capsul) Một số chủng có lông bám (pili)

Kích thước trung bình 0,5 x 1 - 3μm, hai đầu tròn

Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

– E coli là vi khuẩn hiếu khí Nhiệt độ thích hợp là 37oC nhưng có thể phát triển ở 40 – 44oC, pH thích hợp là 7,4 (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

– Trên môi trường Rapid’s E coli khuẩn lạc màu hồng và tím (Lê Đình Hùng,

Sức đề kháng (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

– Dễ bị diệt ở nhiệt độ trên 60oC trong vòng 30 phút

– Nhiệt độ lạnh 0 - 2oC bị diệt trong 2giờ

– Đề kháng với các hóa chất: acid formic, HgCl2/5 phút

– Nhạy cảm với kháng sinh Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamide, Trimethoprim

Kháng nguyên và độc tố

Dựa vào hội chứng bệnh và tính chất gây bệnh của E coli người ta chia chúng

thành 5 nhóm:

– Nhóm EaggEC có liên quan đến EPEC, chúng có các fimbriae Đó là yếu tố

gây kết tập E coli lại với nhau nhờ protein đặc hiệu ở màng ngoài tế bào (specific

outer membrane protein = OMP) Vài dòng EaggEC sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable enterotoxin = ST) EaggEC chủ yếu gây tiêu chảy cho trẻ em Đáng chú

công ở đoạn kết tràng, xâm nhập vào máu hoặc không Người già và trẻ em rất nhạy cảm

– Nhóm EPEC gây tiêu chảy nhưng chúng không sản sinh độc tố ruột Chúng có yếu tố kết dính nên bám vào màng nhày ruột và phá hủy các vi nhung mao ruột – Nhóm ETEC gồm những dòng mang yếu tố bám và xâm nhiễm niêm mạc ruột non (CFAs: fimbriae colonization factor antigens) Có 4 type CFA ký hiệu lần lượt

mà I, II, III và IV Chúng gây tiêu chảy trên người lớn lẫn trẻ em Chúng tiết các loại độc tố kém chịu nhiệt (LT: heat labile) và chịu nhiệt (ST: heat stable) (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

2.4.3 Salmonella

Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là S typhimurium, S choleraesuis và S

enteritidis

Lịch sử (dẫn liệu của Tô Minh Châu, 2005)

– 1885 Daniel E Salmon (Mỹ) phát hiện vi khuẩn từ heo bệnh gọi là Bacterium

choleraesuis

– Những năm sau được đổi tên là Salmonella choleraesuis

– Trước 1983 Salmonella được chia thành 34 nhóm nhỏ A, B, C, … Các nhóm

khác nhau chủ yếu dựa vào kháng nguyên O, H

– Sau 1983, dựa vào phương pháp mã di truyền ADN, La Monin và cộng sự

(1987) chia Salmonella làm 2 loài trong đó có 6 phụ loài, 2 loài là Salmonella

enterica (bao gồm các Salmonella gây bệnh) và Salmonella bongori (gồm các Salmonella không gây bệnh)

Đặc điểm

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella

(Nguồn http://vietsciences.free.fr)

Salmonella là loại trực khuẩn, Gram (-), không có bào tử, lên men đường glucose

sinh hơi, thường không len đường lactose hay sucrose

Khoảng pH dành cho sự phát triển của vi khuẩn là 4,1 – 9,0 trong thực phẩm acid thấp, nhưng trong rau cải vi khuẩn không phát triển được ở pH từ 5,5 – 5,7

Khả năng chịu nhiệt và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh (serotype) Vi khuẩn bị tiêu diệt ở 66oC ít nhất là 12 phút hoặc 60oC trong 78 – 83 phút (Trần Thi Bích Liên, 2001)

Nguồn gây nhiễm Salmonella

Con người và thú nhai lại là hai nguồn lây nhiễm Salmonella trực triếp và gián

tiếp cho thực phẩm Vi khuẩn đến từ những trường hợp bệnh hay vật mang trùng Vi khuẩn này cũng đến từ các loại động vật khác như mèo, chó, heo và bò nhưng quan trọng nhất là nguồn thực phẩm lấy từ gia cầm và trứng lẫn loài gặm nhấm (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

Điều kiện và cơ chế gây ngộ độc

Điều kiện cần thiết để gây ngộ độc do Salmonella bộc phát là:

– Thực phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi khuẩn

– Số lượng vi khuẩn phải đủ cao trong lúc vấy nhiễm hoặc chúng phát triển mạnh mẽ, nghĩa là thực phẩm đó phải là môt trường tốt cho vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở

– Vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa

2.4.4 Staphylococcus aureus

Lịch sử

S aureus còn được gọi là S pyogenes, được Rosenbach phân lập năm 1884

Phân bố (Tô Minh Châu – Trần Thị Bích Liên, 2001)

Phân bố rộng, thường thấy trên da, niêm mạc của người và gia súc, trong các sản phẩm động vật như thịt, trứng, sữa,…

Đặc điểm

S aureus là cầu khuẩn dạng chùm nho, kích thước 0,8 - 1μ Vi khuẩn không di

động, một số ít có giáp mô (đa số không có), không tạo bào tử, bắt màu Gram (+)

Khi phết kính, vi khuẩn này thường kết tụ lại thành chùm hoặc từng cặp hay tạo thành chuỗi ngắn Trên môi trường đặc, khuẩn lạc thường có màu vàng nhưng có vài dòng không sinh sắc tố (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

Hình 2.3 Vi khuẩn S aureus

(Nguồn http://www.physorg.com/news120158546.html) Yêu cầu và đặc điểm tăng trưởng (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

S aurues là loại yếm khí tùy nghi, vài chủng đòi hỏi bổ sung CO2

Mọc ở nhiệt độ 6,5oC – 46oC nhưng thích hợp 30oC – 37oC, pH thích hợp 7,0 – 7,5

Dễ mọc trên môi trường dinh dưỡng thông thường, kích thước khóm trên các môi trường này khoảng 1,0 mm, tạo khóm màu vàng

S aureus sản sinh sáu loại độc tố ruột : A, B, C1, C2, D và E, chúng khác nhau về độc tính, phần lớn ngộ độc thực phẩm là do type A

Nguồn gốc gây nhiễm tụ cầu cho thực phẩm

Hầu hết là do người và thú vật Vi khuẩn thường khu trú ở niêm mạc mũi, hầu họng Công nhân mắc bệnh đường hô hấp trên, đau răng hoặc viêm da do vi trùng sinh mủ mà làm việc trong ngành sản xuất thực phẩm là nguồn gây nhiễm chủ yếu cho thực phẩm

Triệu chứng gây bệnh (trích dẫn của Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

Theo Casman (1963), enterotoxin type A gây ngộ độc thực phẩm, type B gây ngộ độc nguyên phát từ bên trong cơ thể

Triệu chứng ngộ độc xuất hiện nhanh 1 – 6 giờ và kéo dài từ 2 – 12 giờ Triệu chứng ban đầu là bủn rủn tay chân, đau bụng quặn, chảy nước dãi, buồn nôn và ói mửa có máu và màng niêm Đau đầu, co cơ, toát mồ hôi

Điều kiện cần thiết để bệnh bộc phát

Theo Nguyễn Ngọc Tuân (2001), các loại thực phẩm đun nấu không thích đáng đều dễ gây tình trạng ngộ độc

Các điều kiện cần thiết để ngộ độc bộc phát là:

– Thực phẩm phải nhiễm độc tố của tụ cầu vàng

– Thực phẩm phải là môi trường tốt cho vi khuẩn phát triển và sinh độc tố – Nhiệt độ phải thích hợp cho sự phát triển của tụ cầu và có thời gian cần thiết

để sản sinh đủ lượng độc tố để gây bệnh

– Thực phẩm đó được con người sử dụng

2.4.5 Clostridium perfringens

Lịch sử (theo Tô Minh Châu – Trần T hị Bích Liên, 2001)

Vi khuẩn lần đầu tiên được phân lập vào năm 1982 bởi Welch và Nuttall từ xác chết động vật

Năm sau đó E Fraenkel đã phân lập được từ 4 trường hợp của bệnh hoại thư sinh

hơi và ông gọi là Bacillus phlegmonis emphysematosae

Năm 1998 Veillon và Zuber gọi tên Bacillus perfringens và tên này dược dùng đến 1948, sau đó gọi là Clostridium wellchi Ngày nay gọi là Clostridium

perfringens

Phân bố (theo Tô Minh Châu – Trần Thị Bích Liên, 2001)

Là loại trực khuẩn kỵ khí có ở mọi nơi, được phân lập từ đất, phân, đường tiêu hóa của người và động vật

Hình dạng (theo Tô Minh Châu 2005)

Trực khuẩn có kích thước 0,8-1,5 x 4-8 µ thường hơi vuông 2 đầu

Là dạng trực khuẩn kỵ khí Gram dương, sinh bào tử với chu kỳ sinh trưởng ở nhiệt độ 45oC trong điều kiện tối ưu 7 phút

Hình 2.4 Vi khuẩn Clostridium perfringens

(Nguồn :http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5e/Clostridium_perfr

ingens.jpg) Bào tử của chúng có mặt ở mọi nơi trong thiên nhiên và dễ dàng nhiễm vào thực phẩm Chúng thường tạo bào tử trong những điều kiện kỵ khí thuận lợi ở ruột non

Là loại vi khuẩn ổn nhiệt với nhiệt độ sống tối ưu nằm trong khoảng 37 - 45oC, chúng phát triển ở nhiệt độ thấp nhất là 20oC, cao nhất 50oC (Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, 2004)

Đặc điểm nuôi cấy (Tô Minh Châu 2005)

Nhiệt độ thích hợp 37oC, pH kiềm nhưng bào tử hình thành ở pH = 6

Trên thạch glucose yếm khí tạo khóm tròn, xám

Trên thạch máu biển hiện 2 type dung huyết và không dung huyết

Trên môi trường gelatin khóm tròn, xám, hơi mờ và phân giải chậm

Trong canh yếm khí tạo đục đều, sinh nhiều hơi chuyển dần sang đen

Khả năng gây bệnh

Gây hoại tử sinh hơi ở người, gây bệnh kiết lỵ cho động vật non, bệnh tràn độc huyết, hoại thư sinh hơi,… Type A gây trúng độc thức ăn cho người (Trần Thị Bích Liên, 2001)

B cereus là vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi

Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-45oC

pH : 4,5 – 9,3, thích hợp 7-7,2

Trên NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì

Trên BA tạo dung huyết rộng

Tính chất sinh hóa (Tô Minh Châu, 2005)

Trên môi trường đường : lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, không lên men manitol

Khử nitrat thành nitrit

VP (+), catalase (+), citrat (+)

2.4.7 Clostridium botulinum

Phân bố (Trần Thị Bích Liên, 2001)

Bào tử của C botulinum có ở mọi nơi Bào tử type A chiếm ưu thế trong đất

rừng và núi chưa khai phá Bào tử type B chiếm ưu thế ở dất có nhiều phân bón Type C tìm thấy ở đất châu Mỹ, type D và E có nhiều ở đất Nam Phi

Đặc điểm hình dạng (Tô Minh Châu, 2005)

Hình 2.6 Vi khuẩn Clostridium botulinum

(Nguồn http://biology.clc.uc.edu) Trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn

Kích thước 0,9 – 1,2 x 4-6

Có bào tử dạng ovan nằm gần đầu tế bào

Vi khuẩn có khả năng di động nhờ có 4-8 tiên mao quanh tế bào

Nuôi cấy (Tô Minh Châu, 2005)

Là loại kỵ khí triệt để Nhiệt độ thích hợp 25 - 30oC, pH 8,2 - 8,5

Trong môi trường canh thịt glucose tạo đục đều, sau lắng cặn môi trường trở nên trong có mùi thối của acid butyric

Trong canh gan glucose tạo môi trường có màu đen, thối

Sinh hóa (Tô Minh Châu, 2005)

Trên môi trường đường : lên men sinh hơi glucose, maltose,

Các phản ứng : indol (-), H2S (+/-), VP (-), không chuyển nitrat thành nitrit, NH3

(+), catalase (-)

2.5 Các phương pháp thử nhanh trong kiểm tra vi sinh vật

2.5.1 Kỹ thuật mới phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm

Các chuyên gia ở đại học Iowa Mỹ vừa nghiên cứu thành công kỹ thuật mới phát

hiện nhanh khuẩn Salmonella trong thực phẩm thông qua một một dải băng gắn vào vật dụng cần kiểm tra khuẩn Salmonella Mẫu này sau đó được nhúng vào hỗn hợp

nước xà phòng ấm có chứa các vật liệu di truyền có khả năng liên kết với vi khuẩn

Salmonella và phát quang trong điều kiện ánh sáng tia cực tím

Kỹ thuật nói trên có tên là Fluorescent In-Situ Hybridization, viết tắt là FISH

Kết quả có thể nhận biết vật chủ nhiễm hoặc không có vi khuẩn Salmonella với thời

gian không quá hai giờ đồng hồ, nhanh hơn 5 ngày so với phương pháp truyền thống Ngoài ra nó còn có nhiều ưu điểm như rẻ tiền, dễ thao tác và cơ động, có thể dùng ở bất cứ chỗ nào

(http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/DesktopModules/BNN/Print/Print.aspx?newsid=288 15)

2.5.2 Sử dụng công nghệ nano để phát hiện vi sinh vật vấy nhiễm thực phẩm

Một trong số những ứng dụng mới nhất của công nghệ nano để tăng cường vệ sinh an toàn thực phẩm là việc ra đời thiết bị cảm biến sinh học hiển vi (biosensor),

phát hiện nhanh khuẩn Salmonella trong thực phẩm do các chuyên gia ở Trung tâm

nghiên cứu nông nghiệp (ARS) của Mỹ thực hiện và công bố mới đây

Thiết bị cảm biến sinh học cấp nano được mô phỏng cơ chế làm việc giống như các biosensor của các loài côn trùng khi chúng tìm kiếm bạn tình hoặc phát hiện những nguy cơ nguy hiểm diễn ra môi trường xung quanh Đối với các biosensor nhân tạo còn có cả các hạt màu hữu cơ huỳnh quang gắn vào các kháng thể của vi

khuẩn Salmonella Các chất kháng thể này có nhiệm vụ phát quang làm cho người ta

dễ phát hiện ra vi khuẩn Salmonella Ngoài việc dùng phát hiện ô nhiễm thực phẩm,

các thiết bị cảm biến sinh học nói trên còn có thể dùng cho ngành an ninh hoặc các ứng dụng tương tự khác

(http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/DesktopModules/BNN/Print/Print.aspx?newsid=288 15)

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

3.1.1 Thời gian thực hiện: 10/02/2009 - 10/06/2009

3.2.1 Đối tượng khảo sát

– Mẫu thịt heo tươi được lấy từ một số chợ lẻ và nhà hàng quán ăn tại quận A, quận B và quận C thuộc địa bàn TP.HCM

– Số lượng mẫu : 154 mẫu

– Ống nghiệm

– Đĩa petri

– Bao tay, bao nylon đựng mẫu

– Thùng đá bảo quản mẫu

3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

– Môi trường tiền tăng sinh: peptone đệm

– Môi trường tăng sinh: RVS, Tetrathionat dùng tăng sinh Salmonella

– Môi trường phân lập

ƒ XLD, BGA phân lập Salmonella

ƒ BP môi trường chuyên biệt nuôi cấy Staphylococcus aureus

ƒ Rapid’ E.coli môi trường nuôi cấy dùng đếm số khuẩn lạc E coli

– Môi trường thử phản ứng sinh hóa

ƒ TSI kiểm tra đặc tính lên men glucose, lactose, saccharose và sinh H2S

của vi khuẩn Salmonella

ƒ LDC kiểm tra đặc tính sử dụng lysine của vi khuẩn Salmonella

– Môi trường nuôi cấy dùng đếm số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí: PCA

– Pepton Glucose: kiểm tra phản ứng sinh hóa MR và VP của vi khuẩn

3.2.4 Hóa chất

– Thuốc thử Kowacc

– Thuốc thử VP : α – naphtol và KOH 40%

3.2.5 Chế phẩm sinh học

– Bộ thuốc thử Staph plus

– Đĩa giấy thử các phản ứng sinh hóa: Indol, Urease, ONPG

3.3 NỘI DUNG ĐỀ TÀI

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7046 – 2002) – Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

– Chỉ tiêu vi khuẩn E coli

– Chỉ tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus

– Chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella

– Tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn cả 4 chỉ tiêu vi sinh trên

3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.4.1 Cách bố trí lấy mẫu

Bảng 3.1 Bố trí số mẫu thịt heo tươi từ chợ và nhà hàng quán ăn cho thí nghiệm

Phương pháp lấy mẫu

− Mẫu kiểm tra vi sinh : mẫu thịt tươi lấy tại các chợ lẻ và các nhà hàng quán

ăn, mẫu thịt phải đại diện cho quày thịt (các thao tác phải vô trùng)

− Khối lượng mẫu : khoảng 600g

− Cách lấy mẫu :

• Dùng dao vô trùng cắt nhiều vị trí bất kỳ, cho vào túi nylon vô trùng có ghi

mã số để vào giữa 2 lớp nylon

• Cột chặt, để vào thùng đá bảo quản ở nhiệt độ khoảng 0oC – 4oC

• Chuyển ngay về phòng Vi Sinh – Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị - Chi Cục Thú Y TP.HCM

3.4.2 Phương pháp kiểm tra vi sinh mẫu thịt tươi

Phương pháp xét nghiệm mẫu được thực hiện theo quy trình của Phòng Xét Nghiệm Vi Sinh - Trạm Chẩn Đoán - Xét Nghiệm và Điều Trị – Chi Cục Thú Y Thành phố Hồ Chí Minh

Đếm tổng số KL Đếm tổng số KL Rappaport

Chọn KL nghi ngờ

3.4.2.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (theo TCVN 4884 :2005)

Nguyên tắc : đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một

lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật duy nhất

Quy trình xét nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khí

Mẫu 25g mẫu + 225 ml dung dịch peptone đệm (10-1)

Đồng nhất mẫu

Pha loãng (10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6)

Cấy 1 ml dung dịch mẫu vào đĩa petri

Cho 10-15 ml môi trường PCA vào đĩa petri

− Trộn đều bằng cách dùng tay xoay tròn đĩa xuôi và ngược lại nhiều lần một cách nhẹ nhàng sao cho mẫu lan đều khắp đĩa rồi để đông tự nhiên

Ủ 30oC/24 – 72h

− Sau đó lật úp đĩa, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC/24h - 72h

Đọc kết quả: đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa nuôi cấy, chọn các đĩa có số

khuẩn lạc từ 15 - 300 để tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng và quy ra

số lượng vi khuẩn có trong 1g mẫu

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu được tính theo công thức (xem ở phần 3.6)

3.4.2.2 Kiểm tra vi khuẩn E coli (theo ISO 16649-2:2001)

Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc (màu tím và màu hồng) mọc trên môi trường

chuyên biệt Rapid’ E coli

Quy trình kiểm tra vi khuẩn E coli:

Mẫu 25g mẫu + 225 ml dung dịch peptone đệm (10-1)

Đồng nhất mẫu

Pha loãng (10-2, 10-3)

Cấy 1 ml dung dịch mẫu vào đĩa petri

Cho 10 - 15 ml môi trường Rapid’s E coli vào đĩa petri

Sơ đồ 3.3 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn E coli

Ủ 44oC/24 h

Đếm khuẩn lạc (chọn khuẩn lạc màu tím, hồng)

Đọc kết quả

Cách tiến hành:

Cân 25g mẫu và đong 225 ml peptone cho vào bao nylon vô trùng, tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách dập mẫu với máy dập mẫu trong 1 phút/lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

Dùng pipet vô trùng tiếp tục pha loãng tới hạn các nồng độ tiếp theo bằng cách lấy 1 ml mẫu pha ở nồng độ 10-1 cho vào 9 ml peptone đệm đã tiệt trùng của ống sau Pha loãng mẫu tùy theo mức độ vệ sinh của mẫu cần kiểm nghiệm Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1 ml cấy 3 nồng độ liên tiếp rồi thêm vào khoảng

10 - 15 ml môi trường Rapid’s E coli vô trùng đã để nguội 45 - 50oC

Trộn đều bằng cách dùng tay xoay tròn đĩa xuôi và ngược lại nhiều lần một cách nhẹ nhàng sao cho mẫu lan đều khắp đĩa rồi để đông tự nhiên

Sau đó lật úp đĩa, để trong tủ ấm ở nhiệt độ 44oC/24h

Đọc kết quả: Đếm khuẩn lạc có màu tím và hồng rồi quy ra số lượng khuẩn lạc

có trong 1g mẫu

Số lượng E coli trong 1g mẫu thịt được tính theo công thức (xem ở phần 3.6)

3.4.2.3 Kiểm tra vi khuẩn Staphylococcus aureus (TCVN 4830 – 1 :2005)

Nguyên tắc : Xác định trên cơ sở thử phản ứng ngưng kết từ khuẩn lạc đặc trưng

của Staphylococcus aureus trên môi trường phân lập BP

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Staphylococcus aureus

Mẫu 25g mẫu + 225 ml dung dịch peptone đệm (10-1)

Đồng nhất mẫu

Pha loãng (10-2, 10-3) Cấy 0,1ml dung dịch mẫu vào đĩa có chứa môi trường BP

Chọn khuẩn lạc lồi, đen bóng hay xám có vòng sáng rõ rệt bao quanh

Sơ đồ 3.4 Quy trình xét nghiệm vi khuẩn S aureus

Cách tiến hành:

Cân 25g mẫu và đong 225 ml peptone cho vào bao nylon vô trùng, tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách dập mẫu với máy dập mẫu trong 1 phút/lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

Dùng pipet vô trùng tiếp tục pha loãng tới hạn các nồng độ tiếp theo bằng cách lấy 1 ml mẫu pha ở nồng độ 10-1 cho vào 9 ml peptone đệm đã tiệt trùng của ống sau Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 2 đĩa có chứa môi trường thạch BP, mỗi đĩa cấy 0,1

ml và cấy 2 nồng độ liên tiếp Dùng que trang thủy tinh dàn đều dung dịch mẫu trên môi trường BP Để nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút Sau đó lật úp đĩa ở 37oC/24

- 48h, chọn khuẩn lạc điển hình rồi sau đó thử Pastorex Staph plus Test

Đọc kết quả:

* Tính số lượng a của Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase

đã nhận dạng trên mỗi đĩa đã chọn

Trên mỗi đĩa, tính số lượng a có Staphylococci có phản ứng dương tính với

coagulase đã được nhận dạng theo công thức:

nc nc

nc c c

A

b x xC A

b

a=

Trong đó:

Ac: là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase

Anc: là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase

bc: là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

bnc: là số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

Cc: tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa

Cnc: là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa

* Tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã

được nhận dạng có mặt trong phần mẫu thử

Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình ở độ pha loãng liên tiếp, thì tính số lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đối với đĩa theo quy định và tính số N Staphylococci

có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết có mặt trong mẫu thử, là trung bình thu được từ 2 độ pha loãng liên tiếp bằng công thức (xem phần 3.6)

3.4.2.4 Kiểm tra vi khuẩn Salmonella (TCVN 4829:2005)

Nguyên tắc: Salmonella sau khi được tăng sinh sẽ được xác định bằng môi

trường chuyên biệt XLD và các phản ứng sinh hóa

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Salmonella: