Công nghệ sinh học động vật:

các bước cơ bản trong công nghệ chuyển gen động vật: Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản

Công nghệ sinh học động vật:

1. các bước cơ bản trong công nghệ chuyển gen động vật:

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau:

- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen;

- Biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao);

- Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen

2. Ứng dụng động vật chuyển gen trong đời sống thực tiễn và y học :

- Tạo ra những động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao

Đưa tổ hợp bao gồm gen cấu trúc của hormone sinh trưởng và promoter methallothionein vào động vật Cho đến nay người ta đã đưa thành công gen này vào thỏ, lợn và cừu

Lợn chuyển gen hormone sinh trưởng lượng mỡ giảm đi đáng kể (giảm

từ 28,55mm xuống 0,7mm) và hiệu quả sử dụng thức ăn cao hơn

Tuy nhiên động vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng có biểu hiện bệnh lý lớn quá cỡ và chưa có ý nghĩa lớn trong thực tiễn

- Tạo ra động vật chống chịu được bệnh tật và sự thay đổi của điều kiện môi trường

Biết được một số gen có khả năng kháng bệnh và chống chịu được sự thay đổi điều kiện môi trường của vật nuôi

Tiêm gen Mx vào lợn để tạo ra được giống lợn miễn dịch với bệnh cúm

Chuyển gen chống lạnh AFP (antifreeze protein) và đã tạo ra được các giống cá có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại sự lạnh giá (cá hồi, cá vàng )

- Nâng cao năng suất, chất lượng động vật bằng cách thay đổi các con đường chuyển hóa trong cơ thể động vật

nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu bằng cách chuyển gen lactose vào các đối tượng quan tâm Sự biểu hiện của gen này được

điều khiển bởi promoter của tuyến sữa Trong sữa của những động vật chuyển gen này, đường lactose bị thủy phân thành đường galactose và đường glucose

- Tạo ra động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu bệnh ở người Nhiều dòng chuột chuyển gen đã được tạo ra như các mô hình nghiên cứu bệnh tâm thần, tim mạch, phổi, ung thư, viêm nhiễm và miễn dịch cũng như để nghiên cứu cơ chế và sự rối loạn của chuyển hoá, sự sinh sản và sự phát triển sớm ở người

- Thử nghiệm các chất gây ung thư

Ba dòng chuột chuyển gen khác nhau đã được tạo ra cho việc thử

nghiệm các chất gây ung thư:

Chuột chuyển gen Eμ-pim-1 mang gen ung thư đã hoạt hoá pim-1 (gen này có tốc độ gây ra khối u tự phát thấp và xuất hiện rất nhạy với chất gây ung thư)

Chuột chuyển gen mang một gen ung thư đã hoạt hoá (v-H-ras, c-H-ras) hoặc một gen ức chế khối u bất hoạt (p53)

Chuột chuyển gen với gen sửa đổi DNA đã bất hoạt (XPA)

- Tạo ra động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu trong chất độc học

- Thử nghiệm các chất gây đột biến, các chất gây ung thư

- Tạo ra vật nuôi chuyển gen cung cấp nội quan cấy ghép cho người

3. Các điều kiện lý hóa ảnh hưởng đến kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật :

1. Nhiệt độ

Tế bào của các loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác nhau VD: tế bào của động vật có vú và của người phát triển tốt ở 37 ± 1°C, nhiệt độ tế bào của các loài chim phát triển tốt ở 38,5°C, còn tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25 ± 2°C

Một số dòng tế bào phát triển ở nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt bình thường của

cơ thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng

Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn 2°C so với nhiệt độ phát triển thích hợp của chúng, nhưng tế bào lại có khả năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơnnhiệt độ phát triển tối ưu của chúng

mà rất ít ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này

2 pH

pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởnglên các receptor bề mặt

Sự biến đổi pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn đến sự chết tế bào

(apoptosis) Do vậy, kiểm soát pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào nuôi cấy khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng tế bào

Hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh pH ở 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2) Một số dòng tế bào thích hợp với pH caohơn (VD: tế bào fibroblast người thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp hơn (VD: tế bào côn trùng phát triển tốt

ở pH 6,2±0,1)

Môi trường có pH ổn định ít thay đổi có thể giúp tế bào sống tốt hơn Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red như là một chất chỉ thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) và màu hồng nếu pH tăng (kiềm)

3 Áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu của môi trường được xác định bởi chính công thức môi trường Muối và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm thấu, mặc dù các amino acid cũng quan trọng

Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào hầu như luôn tác động lên sự tăng trưởng và chức năng tế bào Nếu tế bào nằm trong môi trường có áp suất không thích hợp, chúng sẽ biến dạng: tế bào co lại trong môi trường có áp suất thẩm thấu quá cao, còn trong môi trường có áp suất quá thấp,chúng sẽ căng phồng lên

Để kiểm tra áp suất thẩm thấu của môi trường, thường sử dụng Osmom kế (Osmometer)

Các môi trường thương mại được thiết kế để áp suất thẩm thấu là 300 mOsm (tế bào phát triểntrong khoảng 290 - 310 mOsm)

Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292 g/lít NaCl sẽ làm tăng1 mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu lên 10 mM)

Chú ý là trong môi trường còn có các thành phần đường, ion, các amino acid…chúng cũng đóng góp vào sự tạo áp suất thẩm thấu

4 Các loại khí

Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2 và N2 Tỷ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ đó các phân áp khí được tạo ra thích ứng với đặc điểm sinh lý của tế bào và mô sống

O2 có vai trò quan trọng trong sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào Nồng

độ O2 phổ biến dùng trong tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%

Tác động của CO2 lên nuôi cấy tế bào khó được xác định một cách chính xác, bởi nó liên quan đến hàm lượng CO2 hòa tan, pH, nồng độ HCO3

4. Thành phần cơ bản trong môi trường nuôi cấy mô – tế bào động vật:

Thành phần môi trường

a Muối vô cơ

Các muối vô cơ trong môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển

tế bào in vitro, như: cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì cơ chế vận chuyển chất qua màng, giúp điều hòa điện thế màng, bám gắn tế bào, hoạt động như các cofactor

b Hệ đệm

Hệ đệm có vai trò điều hòa pH của môi trường nuôi cấy Hầu hết các môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 là thành phần chính Ngoài ra, còn có hệ thống đệm phosphat và các đệm hữu cơ phức tạp khác Cũng có thể

sử dụng hệ đệm hữu cơ hay huyết thanh trong môi trường cơ bản

Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần duy trì không khí với 5–10% CO2 trong tủ Bicarbonate, CO2 rẻ, không độc đối với tế bào nên được dùng phổ biến

Hệ đệm hữu cơ được sử dụng nhiều nhất là HEPES

(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2ethane sulfonic acid)

Các hệ đệm hữu cơ không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống tốt để các tế bào chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) có thể ổn định pH Một số dung dịch đệm như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane]

thường sử dụng trong sinh hóa có thể gây độc đối với tế bào in vitro

c Carbohydrate

Đường trong môi trường là nguồn cung cấp C và năng lượng cho sự phát triển tế bào invitro Các đường chính được sử dụng là glucose và galactose, một số môi trường còn sử dụng maltose hay fructose Nồng độ đường khác nhau giữa các môi trường cơ bản từ 1g/l– 4,5g/l Môi trường chứa nồng độ đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào

d Vitamine

Vitamine là cơ chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều trong thành phần huyết thanh Tuynhiên, nhiều loại môi trường cần được bổ sung vitamine thích hợp như vitamine nhóm B cần thiết cho sự phát triển tế bào Thông thường vitamine được sử dụng trong môi trường là riboflavin, thiamine và biotin

e Các protein và peptide

Các thành phần này giữ vai trò quan trọng trong nuôi cấy hầu hết các tế bào, đặc biệt khi nuôi cấy với môi trường không huyết thanh Một số protein, peptide rất cần thiết như albumin, transferring, fibronectin và fetuin thường

có sẵn trong huyết thanh

f Acid béo và lipid

Giống với protein và peptide, các chất này rất cần thiết trong môi trường nuôi không huyết thanh và cho một số tế bào đặc biệt Chúng hiện diện trong huyết thanh với các dạng như cholesterol và steroid

g Yếu tố vi lượng

Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong

đó selenium là chất giúp tách các gốc oxy tự do

h Huyết thanh

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh bởi nó có những vai trò quan trọng như sau:

- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chấtcủa nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin, tránh các enzym gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Chống oxy hóa: huyết thanh kháng oxy hóa mạnh, và ức chế độc tính của oxy

- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng

độ dính của tếbào lên giá đỡ

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật Tuy nhiên, bên cạnh những tác động tốt nêu trên, huyết thanh cũng có những tác động không tốt:

- Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao

- Huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau.- Huyết thanh còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa

- Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, các lipoprotein ) thường không

ổn định khi đông lạnh hay bảo quản lâu

- Huyết thanh không pha loãng sẽ độc với nhiều loại tế bào

- Khi mất nồng độ hormone thích hợp, huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất

ức chế sự phát triển, biệt hóa hay chức năng

5 Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật:

Ưu điểm

- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán: như các enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon và interleukin, các tế bào nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học…

- Các tế bào động vật có quá trình biến đổi hậu dịch mã chính xác (post

translational modifications) đối với các sản phẩm protein sinh-dược

(biopharmaceutical protein) như phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị

(subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc

phoshorylation các gốc amino acid

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh như ung thư,HIV, viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in vitro trong nghiên cứu chất độc học và dược học

- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạo sinh học hay các dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, …

Hạn chế

- Tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật

- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật

- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều

so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật,

và kết quả là chúng rất dễ bị vỡ

- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy

đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một

cơ thể đơn vào riêng biệt như vi sinh vật

- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

6 Tế bào gốc là gì? Nguồn gốc, phân loại tế bào gốc

Tế bào gốc là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương

vì nhiều nguyên nhân khác nhau

Nguồn gốc:

– Tế bào gốc phôi lấy trực tiếp từ phôi thai trong giai đoạn phôi bào tức là hợp tử sau 6-7 ngày thụ tinh

– Tế bào gốc thai lấy từ tế bào gốc đa năng của mô bào thai bị hủy do phá thai

– Tế bào gốc dây rốn lấy từ màng dây rốn và máu dây rốn của thai nhi sau khi sinh ra

– Tế bào gốc từ người trưởng thành lấy từ các mô của người trưởng thành (tủy xương, máu ngoại vi…)

Phân loại tế bào gốc

Theo đặc tính hay mức độ biệt hóa

- Toàn năng (hay thuỷ tổ) Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ (totipotent stem cells)

Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào cơ thể từ một tế bào ban đầu

Trứng đã thụ tinh và các tế bào được sinh ra từ những lần phân chia đầu tiên của tế bào trứng đã thụ tinh (giai đoạn 2 - 4 tế bào – các blastosomer)

- Vạn năng Tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells)

Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào của cơ thể có nguồn gốc từ ba lá mầm phôi – lá trong, lá giữa và lá ngoài

Các tế bào gốc vạn năng không thể phát triển thành thai, không tạo nên được một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh mà chỉ có thể tạo nên được các tế bào,

mô nhất định

- Đa năng Tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells)

Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể từ một tế bào ban đầu

Các tế bào gốc trưởng thành như tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc thần kinh chỉ có tính đa năng; nhưng trong những điều kiện nhất định, chúng vẫn có thể chuyển biệt hóa và trở nên có tính vạn năng

- Đơn năng Tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells)

Tế bào gốc đơn năng là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một dòng

Khả năng biệt hóa theo dòng cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo

mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào mô mới

7 Vẽ sơ đồ tạo động vật chuyển gen và giải thích

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau:

- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

+ Tách chiết, phân lập gen mong muốn

Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm:

 Các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase),

 Các mẫu dò (probe), vector

 Tế bào vật chủ

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector thường được sử dụng là plasmid

 Gen chuyển có nguồn gốc từ genome

 Từ mRNA

 Từ sản phẩm protein có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn