công nghệ sinh học động vật

 Cung cấp những kiến thức nền tảng, các thao tác kỹ thuật được ứng dụng trong CNSH tế bào ở người và động vật  Cung cấp những thành tựu của ngành CNSHĐV đã được ứng dụng trong thực tiễ

BÀI 1: GIỚI THIỆU CHUNG

 Cung cấp những kiến thức nền tảng, các thao tác kỹ thuật được ứng dụng trong CNSH tế bào ở người và động vật

 Cung cấp những thành tựu của ngành CNSHĐV đã được ứng dụng trong thực tiễn cuộc sống và sự phát triển của CNSHĐV trong tương lai

MỤC TIÊU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Công nghệ sinh học động vật (CNSHĐV): Là những kỹ thuật CNSH

tiến hành hoặc ứng dụng trên đối tượng người và động vật

KHÁI NIỆM

1 Giới thiệu chung

2 Nuôi cấy tế bào động vật

1 Quan niệm duy tâm siêu hình về sự sống:

 Thuyết tự sinh

 Thuyết sinh lực luận

 Thuyết tiền thành luận

 nguồn gốc sự sống là bí hiểm

và không thể nhận thức được

LỊCH SỬ SINH HỌC

2 Sinh học thời kỳ cổ đại Hy Lạp (kỷ nguyên Olympic)

 Phổ biến triết học duy lý (rationalism): Thế giới khách quan là có thể

tìm hiểu được

 Alkmeon (600TCN): đã giải phẫu động vật và mô tả các cơ quan đúng

với thực tiễn quan sát được

 Hyppocrat (460-337 TCN): nghiên cứu nhiều về hệ thần kinh

LỊCH SỬ SINH HỌC

3 Sinh học thời kỳ cổ đại Aristote (384-322 TCN)

Aristote đặt cơ sở cho thuyết tiến hóa,

cho khoa động vật học

LỊCH SỬ SINH HỌC

4 Sinh học thời cổ đại La Mã (kỷ nguyên xây dựng thành phố 21-4-773 TCN)

 Dioscoride (thế kỷ I): sưu tầm và mô tả trên 600 loài thực vật – đặt nền

móng cho nghành dược liệu học

 Gaius Plinius: Biên soạn bách khoa toàn thư sưu tầm tất cả các thành

tựu của lịch sử tự nhiên từ thời cổ đại

 Claudius Galenus: Mô tả cấu tạo nhiều động vật khác nhau – đóng vai

trò lớn cho sự phát triển của y học

LỊCH SỬ SINH HỌC

5 Sinh học thời Trung Cổ (500-1500 SCN)

LỊCH SỬ SINH HỌC

God is a person who created (brought into existence all material and spiritual

substance), and that, out of the created material, He personally formed the worlds and each creature therein (Genesis 1:1; 2:7, 19)

God created man, animals, fish, fowls, and plants to reproducethemselves after their own kind (Genesis 1:20-31; 2:5-7, 19-25)

6 Sinh học thời đại Phục Hưng (XIV-XV)

Ngành khoa học Giải phẫu, Sinh lý học phát triễn vượt bậc

 Mondino de Louici (1275- 1326): xuất bản cuốn sách về giải phẫu

người Các công trình nghiên cứu đều gắn với thực tiễn đời sống

 Leonard de Vinci (1452-1519): vận dụng cái đẹp của cơ thể sống vào

điêu khắc và hội họa

LỊCH SỬ SINH HỌC

7 Sinh học thế kỷ XIX

Sinh học mới trở thành ngành khoa học thực sự thể hiện bằng ba phát minh sinh học quan trọng của thế kỷ:

 Học thuyết tế bào (Matthias Schleiden và Theodor Schwann - 1838- 1839)

 Học thuyết tiến hóa (Charles Darwin – 1859)

 Khái niệm về gen và di truyền (Mendel – 1865)

LỊCH SỬ SINH HỌC

8 Khoa học sinh hoc thế kỷ XX

Sinh học phát triển theo hướng tổng hợp liên kết các chuyên ngành để cho ra đời ngành sinh học phân tử và công nghệ sinh học

 Mô hình cấu trúc của phân tử DNA (Watson and Crick)

 Phát hiện ra các enzyme giới hạn (Restriction Enyme)

LỊCH SỬ SINH HỌC

9 Khoa học sinh học thế kỷ XXI:

Một số giải Nobel thuộc lĩnh vực Y – Sinh học thế kỷ XXI

LỊCH SỬ SINH HỌC

THÀNH TỰU ĐIỂN HÌNH

DOLLY, FIRST MAMMAL CLONED

FROM AN ADULT CELL

TRANSGENIC CLONES

Britain grants embryo cloning patent

and became the first country in the

world to grant a patent covering

cloned early-stage human embryos

The decision ignited new

controversy among biotechnology

critics even though the Geron

Corporation, the company licensed

to use the patent, has no intention

of creating cloned humans

TRANSGENIC CLONES

The first two cats cloned by chromatin transfer

TRANSGENIC CLONES

Cloned transgenic animal containing red fluorescent protein

TRANSGENIC CLONES

GloFish, originally developed in Singapore as a way to monitor water pollution The normally black-and-silver zebrafish was turned green or red by inserting various versions of the GFP gene

MOUSE “KNOCK-OUT” TECHNOLOGY

GENE TARGETING

p27 knockout mouse

p27 knockout mouse is bigger than the control

This is not due to obesity, but the skeletal structure is increased in size (everything about the mouse is larger)

MOUSE “KNOCK-OUT”

TECHNOLOGY

GDF8 (Myostatin) knockout mouse

Over twice the muscle mass of a wildtype mouse

normal knockout

ASSISTED REPRODUCTIVE

TECHNOLOGIES

Monoclonal Antibodies

TẾ BÀO GỐC

GENE THERAPY

VẬT LIỆU Y SINH

ÔN KIẾN THỨC

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

III Kỹ thuật nuôi cấy mô và TBĐV

1 Nuôi cấy mô là gì?

trên các bình/đĩa bằng plastic/thủy tinh

• In the body = in vivo

• On plastic or glass = in vitro

• Nuôi trong tủ ấm với cùng nhiệt độ với cơ thể

trưởng và phát triển

III Kỹ thuật nuôi cấy mô và TBĐV

2 Các cấp độ nuôi cấy mô và TBĐV:

trường nuôi cấy

phù tế bào được nuôi cấy in vitro

3 Các kiểu nuôi cấy TBĐV

a Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)

• Là quá trình tách tế bào từ mô và nuôi trong điều kiện in vitro

• Tế bào bắt nguồn trực tiếp từ mô đã biệt hóa gọi là tế bào sơ cấp

(primary cell) Việc nuôi cấy các tế bào giai đoạn này gọi là

nuôi cấy sơ cấp (primary culture)

• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy

• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

Tách tế bào bằng phương pháp cơ học

Tách tế bào bằng gradient nồng độ

Tách tế bào bằng gradient nồng độ

3 Các kiểu nuôi cấy TBĐV

b Nuôi cấy thứ cấp (subculture / secondary culture) là giai

đoạn tiếp theo của nuôi sơ cấp

• Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp

• Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

• Dòng tế bào (Cell line): một quần thể giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu

• Dòng tế bào liên tục (continued cell line/ establish cell line): là dòng tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian rất dài, có khi là vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính

Vd: CHO, Hela, Vero

Common cell lines

• Human cell lines

• -MCF-7 Breast cancer

• HL 60 Leukemia

• HEK-293 Human embryonic kidney

• HeLa Henrietta Lacks

• Primate cell lines

• Vero African green monkey kidney epithelial cells

• Cos-7 African green monkey kidney cells

• And others such as CHO from hamster, sf9 & sf21 from insect cells

3 Các kiểu nuôi cấy TBĐV

c Nuôi cấy đơn lớp (monolayer culture):

thể để sinh trưởng và phát triển

• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts

3 Các kiểu nuôi cấy TBĐV

d Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture)

cụ hay thiết bị nuôi cấy

microcarrier

The stages of cell adhesion and induction of the intermediate adhesive state by matricellular proteins During the process of adhesion, a cell undergoes attachment, spreading, and the formation of stress fibers and focal adhesions With each stage the adhesive strength of the cell increases We define de-adhesion as the transition from strong adherence to intermediate adherence, as characterized by the disassembly of stress fibers

3 Các kiểu nuôi cấy TBĐV

e Các kỹ thuật khác liên quan đến nuôi cấy TBĐV:

limiting dilution)

4 Các pha phát triển tế bào nuôi cấy

Cell viability

• Cell viability is determined by staining the cells with trypan blue

• % of viable cells= Nu of unstained cells x 100/total nu of cells

IV Nuôi cấy TBĐV

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào

IV Nuôi cấy TBĐV

2 Điều kiện thích hợp

• Pha rắn:

IV Nuôi cấy TBĐV

IV Nuôi cấy TBĐV

VI Thiết bị và dụng cụ NC TBĐV

VI Thiết bị và dụng cụ NC TBĐV

VI Thiết bị và dụng cụ NC TBĐV

VI Thiết bị và dụng cụ NC TBĐV

VI Thiết bị và dụng cụ NC TBĐV

VII Kiểm soát nhiễm

IX Điều kiện làm việc vô trùng

BÀI 3: CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ

SINH SẢN

Định nghĩa

TẾ BÀO SINH DỤC ĐỰC: TINH TRÙNG

TẾ BÀO SINH DỤC ĐỰC: TINH TRÙNG

II Kỹ thuật chuẩn bị giao tử

gradient tỷ trọng

II Kỹ thuật chuẩn bị giao tử

II 1 Chuẩn bị trứng

a Thu nhận trứng

• Từ ống dẫn trứng sau khi rụng

• Từ nang trứng:

 Phương pháp chọc hút: dùng kim tiêm chọc vào nang trứng rồi hút trứng (18G, 5ml)

 Phương pháp rạch múc: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng để múc dich có chứa trứng

 Phương pháp cắt nghiền buồng trứng: buồng trứng được cắt nhỏ bằng kéo và lọc lấy

tế bào trứng

b Quan sát và phân loại trứng

• Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất

c Nuôi trứng trưởng thành

II Kỹ thuật chuẩn bị giao tử

II 2 Thu nhận tinh trùng

a Thu nhận tinh dịch

b Đánh giá tinh dịch và tinh trùng

c Thu nhận tinh trùng

 Cho kỹ thuật vi thụ tinh

• MESA (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration): thu tinh trùng từ mào tinh bằng vi phẫu thuật

• PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration): thu tinh trùng từ mào

tinh bằng cách xuyên kim qua da

• TESA (Testicular Sperm Aspiration): thu tinh trùng từ tinh hoàn bằng

MESA

III Kỹ thuật hỗ trợ sự thụ tinh

1. Dẫn tinh trùng nhân tạo (Artificial insemination – AI)

2. Thụ tinh in vitro (In Vitro Fertilization – IVF)

3. GIFT (Gamete intrafallopian transfer)

4. Vi thụ tinh (Microinsemination)

1 Dẫn tinh trùng nhân tạo

(Artificial insemination – AI)

vào cơ quan sinh dục của con cái (đã được chuẩn bị trước cho việc nhận tinh)

- ITI (IntraTubal Insemination):

bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng

- IFI (IntraFollicular Insemination):

bơm tinh trùng vào vòi trứng

- ICI (IntraCervical Insemination):

bơm tinh trùng vào cổ tử cung

- IUI (IntraUterine Insemination):

bơm tinh trùng vào tử cung

2 Thụ tinh in vitro

(In Vitro Fertilization – IVF)

• Là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí nghiệm

(trong đĩa petri, ống nghiệm, ống mao quản và cọng rạ…)

- thiểu năng tinh trùng nặng

- thiểu năng tinh trùng nhẹ đã thất bại với nhiều chu kỳ IUI

- Không có tinh trùng, phải lấy tinh trùng ở mào tinh, tinh hoàn

- Tắt vòi trứng

2 Thụ tinh in vitro

(In Vitro Fertilization – IVF)

Môi trường thụ tinh in vitro

• Cơ chất năng lượng: glucose, pyruvate, lactate

• Muối

Đánh giá kết quả thụ tinh

3 GIFT (Gamete intrafallopian transfer)

và lọc sạch vào vòi dẫn trứng với sự hỗ trợ của nội soi bụng

3 GIFT (Gamete intrafallopian transfer)

xảy ra sự thụ tinh tự nhiên

Tỷ lệ thành công ở GIFT (25-30%), IVF (15-30%)

• Bất lợi:

• Tốn kém

• Không trực tiếp theo dõi quá trình thụ tinh

4 Vi thụ tinh (Microinsemination)

4 Vi thụ tinh (Microinsemination)

IV Cấy truyền phôi

1 Nguồn phôi

• Người: phần lớn tạo ra từ in vitro

• Động vật: từ con giống tốt sau khi thụ tinh in vitro hay in vivo

• Chọn con cái tốt, tiến hành siêu rụng trứng

• Tuyển chọn nguồn tinh trùng

• Thụ tinh:

- Giao phối tự nhiên

- Dẫn tinh nhân tạo

• Thu nhận phôi:

- Gội rửa lấy phôi thông qua phẫu thuật

- Gội rửa lấy phôi không thông qua phẫu thuật

2 Nuôi phôi

• Điều kiện nuôi cấy:

• Nồng độ Oxy, CO2

• pH, nhiệt độ, ánh sáng

• Thể tích giọt ủ

3 Cấy phôi

• Là kĩ thuật thu nhận phôi từ bộ phận sinh dục của cá thể cái để cấy vào tử cung của con cái nhận, nhằm tiếp tục hoàn thành quá trình mang thai và sinh con

- Chuẩn bị phôi

- Chuẩn bị con nhận phôi

- Cấy truyền phôi vào con cái nhận

Chọn lọc phôi

• Loại rất tốt: phát triển đúng với lịch trình sinh lý, hình thái quan sát chuẩn Khối phôi bào phân chia đều, rõ, đậm màu, liên kết chặt chẽ Màng zona pellucida tròn đẹp

• Loại tốt: cơ bản phôi có sự phát triển đúng với lịch trình sinh lý,

đủ kích thước và số lượng Các phôi tương bào không đều,

không đẹp nhưng có sự liên kết chặc chẽ

• Loại trung bình: các phôi liên kết thiếu chặc chẽ Kích thước

phôi bào không đều, nhỏ hơn bình thường Màng trong suốt

không đều

Chuyển phôi

• Đặt một phôi vào ống dẫn trứng

Chuyển hợp tử (zygote intrafallopian transfer – ZIFT):

trợ của siêu âm

V Một số kỹ thuật liên quan

• Đông lạnh phôi: chọn phôi, môi trường đệm, chất bảo quản lạnh

VI Một số thiết bị và dụng cụ đặc thù

KÍNH HIỂN VI ĐẢO NGƯỢC

Kính hiển vi đảo ngược, soi nổi

Tủ nuôi

Tủ thao tác vô trùng

Máy ly tâm

Tủ lạnh

Tủ sấy khô và vô trùng

Bình bảo quản/đông lạnh mẫu

BÀI 4:

CÔNG NGHỆ TẠO DÒNG

VÔ TÍNH

1 GIỚI THIỆU

kết hợp giữa giống tính nam và nữ Đây là phương thức tạo ra một sinh vật mới bằng cách sao y nguyên tín hiệu di truyền từ một cá thể cha hoặc mẹ

• Sinh sản vô tính còn được gọi là sinh sản nhân bản

• Phân loại:

• Tạo dòng phân tử (molecular cloning)

• Tạo dòng tế bào (cell cloning)

• Tạo dòng sinh sản (reproductive cloning)

• Tạo dòng liệu pháp (therapeutic cloning)

1 GIỚI THIỆU

Tạo dòng vô tính ở động vật trong tự nhiên:

• Tái sinh (regeneration): Sao biển

• Trinh sản (parthenogenesis): ở một số loài cá, lưỡng thê, thằn lằn

2 CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ TẠO DÒNG

• Sự in dấu di truyền (Imprinting)

• Sự biệt hóa tế bào gốc phôi

3 CÁC KỸ THUẬT TRONG TẠO DÒNG

CƠ BẢN IN VITRO

a Tách phôi (Embryo splitting)

a Tách phôi (Embryo splitting)

a Tách phôi (Embryo splitting)

Là kĩ thuật sử dụng hệ thống vi thao tác để tách rời các tế bào của phôi giai đoạn sớm (2/4/8 tế bào) và mỗi tế bào sẽ phát triển

thành cơ thể hoàn chỉnh với đk thích hợp

b Chuyển nhân (Nuclear transfer)

b Chuyển nhân (Nuclear transfer)

Các phương pháp chuyển nhân:

vỡ cấu trúc phospholipide trên màng, tạo ra lỗ hổng

 Kĩ thuật tạo dòng vô tính Roslin

c Kĩ thuật trinh sản

• Phương pháp hoạt hóa

• Chất hoạt hóa

• Thời gian

• Loài

c Kĩ thuật trinh sản

Thỏ

• Làm lạnh ống dt chứa trứng xuống 0,60C ở 100C/24h ức chế GPII

• Tới 46–47oC/1,5–5 phút -> nuôi in vitro -> nhân lưỡng bội hoặc cả hai

nhân đều đơn bội

• Trứng với IP3 và 6-dimethylaminopurine ->trứng bắt đầu phân chia -> phát triển đến giai đoạn blastocyst

• Dòng điện (30–50V) -> trứng phát triển -> phôi lưỡng bội

• Kích thích bằng ethanol, DMAP hay stontium

Cibelli và cs (2002) đã hoạt hóa trinh sản thành công những trứng chưa thụ tinh -> thu được các phôi blastocyst

4 Khiếm khuyết ở ĐV tạo dòng vô tính

• Phát triển bất thường

• Gây chết:

- Trước khi làm tổ (Preimplantation) > 65% blastocyst

- Ngày 30 đến ngày 60: Phôi chết >50%

- Ba tháng giữa thai kỳ: Sảy thai ngẫu nhiên

• Bất thường trước sinh: Gia tăng kích thước, nhau thai bất thường, tim mạch yếu

• Bất thường sau sinh:

- có vấn đề về phổi, thận và hệ tim mạch

- rối loạn chức năng gan, khớp, não

- Suy thoái chức năng hệ miễn dịch

- Tăng trọng lượng bất thường

Nguyên nhân

• Thất bại trong quá trình thiết lập chương trình

• Thất bại của quá trình in dấu bộ gen

• Sự đột biến

BÀI 5: TẾ BÀO GỐC

I Giới thiệu

• Tế bào gốc là dạng tế bào có nguồn gốc phôi thai hay mô cơ thể trưởng thành Trong điều kiện thích hợp, hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc sẽ phát triển thành nhiều loại tế bào của các tổ chức cơ thể

• Tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa, có thể tự tái tạo (self- renew), có khả năng phân chia vô hạn định, và có khả năng sinh sản và tạo nên các tế bào khác có những chức năng chuyên biệt khi nó được cấy vào môi trường thích hợp

II Phân loại tế bào gốc:

III Nguồn lấy tế bào gốc.

1 Nguồn lấy tế bào gốc phôi

2 Nguồn lấy tế bào mầm phôi và tế bào gốc thai

3 Nguồn lấy tế bào gốc trưởng thành

• Tế bào gốc phôi được lấy từ khối tế bào bên trong của phôi túi phát triển từ:

- Các phôi tạo nên bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

- Các phôi nhân bản tạo nên bằng tách blastomere trong giai đoạn phôi 2- 4 tế bào, hoặc bằng phân chia blastocyst

- Các phôi nhân bản vô tính tạo nên bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào

1 Nguồn lấy tế bào gốc phôi: