Giáo trình Công nghệ sinh học động vật

Giáo trình Công nghệ sinh học động vật có kết cấu nội dung chính được trình bày làm 4 chương: Chương 1 Nuôi cấy mô-tế bào động vật, chương 2 Công nghệ hỗ trợ sinh sản, chương 3 Công nghệ tạo dòng vô tính, chương 4 Một số thành tựu điển hình của công nghệ sinh học động vật. Mời các bạn cùng tham khảo giáo trình và nắm nội dung kiến thức cụ thể trong từng chương học.

1

MỞ ĐẦU

I KHÁI NIỆM

Công nghệ Sinh học (CNSH) (Biotechnology) đòi hỏi sự tập hợp của trí tuệ, kỹ thuật dựa

trên nền tảng cơ bản của khoa học sự sống Đó là kết quả của việc ứng dụng những nguyên lý khoa học và công nghệ để chế tạo, sản xuất nguyên vật liệu bằng những tác nhân sinh học, nhằm tạo ra hàng hóa và dịch vụ phục vụ con người

Công nghệ Sinh học trên người và động vật (CNSH N&ĐV) là những kỹ thuật CNSH tiến

hành hoặc ứng dụng trên đối tượng người và động vật Ở nước ta, CNSH trên người chưa thực sự

phát triển thành một lĩnh vực độc lập, nên thường được gọi chung là Công nghệ Sinh học Động

vật (CNSH ĐV)

CNSH ĐV có lịch sử tiềm tàng lâu dài, các kiến thức và sự ứng dụng sơ khai đã diễn ra cách đây 8.000 năm ở khu vực Tây Bắc Á, khi con người lần đầu tiên biết săn bắt các loài động vật hoang dại về nuôi để lấy thịt, lông, sữa…và sau đó thuần hóa chúng làm phương tiện vận chuyển

Cách đây nhiều thập niên, con người đã có nhiều cải tiến mạnh mẽ trong chăn nuôi động vật, biết chọn lọc những cá thể khỏe mạnh, tiêm chủng để phòng ngừa bệnh, thực hiện nhiều kỹ thuật khác để tăng cường khả năng sinh sản của chúng Tuy nhiên, CNSH ĐV hiện đại (dựa trên thành tựu tế bào học và di truyền học) chỉ thật sự bắt đầu vào những năm 60 của thế kỉ XX và bùng

nổ trong hai thập kỷ gần đây

II NỀN TẢNG KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

II.1 GENOMICS VÀ BỘ GEN NGƯỜI

II.1.1 Genomics

Genomics là lĩnh vực nghiên cứu về thành phần, tổ chức, chức năng và tiến hóa của thông

tin di truyền chứa trong bộ gen

Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức năng

(functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics) Genomics được xem là tâm điểm

c ủa sinh học, bởi mọi kết quả từ nghiên cứu genomics đã, và đang đóng góp tích cực vào các lĩnh

vực ứng dụng như chăm sóc sức khỏe con người, nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác

Sự phát triển nhanh chóng của genomics có sự trợ giúp của các ngành khoa học kỹ thuật khác, chẳng hạn các thiết bị giải trình tự… Ngoài ra, sự “đua nhau” giải mã bộ gen các sinh vật từ những năm 1990 với nhiều quy mô, nhiều mức độ khiến công việc này trở nên sôi động Đến nay, có trên dưới 100 loài được giải mã bộ gen

II.1.2 Bộ gen người

Ý tưởng giải trình tự cả bộ gen người được đưa ra từ các cuộc họp được tổ chức vào những năm 1984-1986 bởi Cơ quan Năng lượng Mỹ (U.S Department of Energy)

Chương trình được khai trương khi Cơ quan Năng lượng và Viện sức khỏe Mỹ kết hợp Vào cùng thời điểm này, việc giải trình bộ gen người cũng được bắt đầu ở Pháp, Anh và Nhật bản Với

xu hướng này, việc thành lập Tổ chức Bộ gen Người (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân năm 1988, đã kéo theo một số quốc gia khác cùng tham gia chương trình và có đóng góp vào kế hoạch này, đặc biệt là Đức và Trung Quốc

2

Tháng 6-1988, cuộc họp quan trọng về việc giải trình tự và lập bản đồ bộ gen (Genome Mapping và Sequencing Meeting) đầu tiên được tổ chức tại Cold Spring Harbor đã chứng kiến nỗ lực của kế hoạch giải trình tự bộ gen người của Celera Genomics (nhóm thứ hai giải trình tự bộ gen người do Craig Venter chủ trì) Cuộc họp được xem như là một điểm nhấn ban đầu cho HGP Nhờ

sự phát triển, hợp tác quốc tế, nhờ tiến bộ của genomics, cũng như kỹ thuật máy tính, bản phác

th ảo hành động (working draft) bộ gen người đã được hoàn thành vào 26/6/2000

Tháng 2/2001, các phân tích của bản phác thảo hành động được công bố

Dự án bộ gen người hoàn thành và tuyên bố kết thúc vào ngày 14/4/2003, sớm hơn 2 năm ở

Hội nghị khoa học của NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA Tháng 5-2006, trình tự của NST

người cuối cùng được công bố trên tạp chí Nature

Mặc dù hầu hết các bài báo đều cho rằng bộ gen người đã hoàn thành, thật ra đến năm

2006, nó vẫn còn chưa hoàn tất và sẽ mất nhiều năm nữa mới có thể hoàn thành trọn vẹn, bởi các vùng trung tâm của mỗi NST (như centromere) luôn bao gồm các trình tự DNA lặp lại cao, rất khó

có thể giải trình tự chúng với kỹ thuật hiện nay

* Ứng dụng và triển vọng của việc nghiên cứu bộ gen người

Các kỹ thuật và công nghệ mới, các tiền đề được tạo ra từ HGP, và những nghiên cứu genomics khác, đang có nhiều tác động mạnh lên khắp các ngành của khoa học sự sống

Một số ứng dụng hiện tại và tiềm năng của việc nghiên cứu bộ gen:

- Thuốc phân tử (Molecular medicine)

- Các nguồn năng lượng và các ứng dụng môi trường

- Đánh giá rủi ro

- Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa và sự di cư người

- DNA pháp y (DNA forensic)

- Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi và chế biến sinh học

II.2 PROTEOMICS

II.2.1 Khái niệm

Proteomics là khoa học nghiên cứu proteome Proteome là toàn bộ các protein được biểu hiện bởi cả genome Vì một số gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau, nên kích thước của proteome thường lớn hơn so với số lượng gen Thỉnh thoảng khái niệm này còn sử dụng nhằm để

mô tả toàn bộ protein được biểu hiện ở một tế bào, hay một mô đặc biệt nào đó

II.2.2 Các công cụ của proteomics

Công c ụ đầu tiên của proteomics là dữ liệu Các dữ liệu protein, EST và trình tự bộ gen

được thu thập tạo ra mục lục các protein được biểu hiện trong sinh vật Chẳng hạn, dựa vào các phân tích tất cả trình tự mã hóa của Drosophila, người ta thấy có đến 110 gen Drosophila mã hóa cho các domain giống EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein với các domain xúc tác tyrosine kinase Theo đó, khi tiến hành proteomics ở loài này, cần có một bản liệt kê các protein đã biết, nếu nghiên cứu gặp phải các thông tin giới hạn, hay các dữ liệu từ phương pháp khối phổ không rõ ràng, người ta có thể xác định thành phần protein từ sự trùng khớp với dữ liệu đã có sẵn này

3

Công c ụ thứ hai là khối phổ (Mass spectrometry_MS) Các thiết bị MS có nhiều thay đổi

trong thập niên qua, đặc biệt là độ nhạy MS có thể thực hiện ba kiểu phân tích rất cần thiết cho proteomics Thứ nhất là, MS cung cấp sự đo lường chính xác khối lượng phân tử của một protein nguyên vẹn như 100 kDa hay hơn Do đó, phân tích MS có thể là cách tốt nhất để xác định khối lượng phân tử (hơn cả phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide) MS cũng cung cấp sự

đo khối lượng chính xác các peptide từ quá trình protolytic Dữ liệu từ các peptide này được tìm kiếm trực tiếp, nhằm xác định chính xác protein mục tiêu Cuối cùng, phân tích MS cũng cung cấp các trình tự của peptide từ quá trình thủy giải Các dữ liệu từ MS sẽ cung cấp chiến lược rõ ràng (và mạnh nhất) trong việc xác định protein

Công c ụ thứ ba là các phần thu gom, kết hợp các dữ liệu MS với các trình tự protein đặc

biệt có sẵn trong cơ sở dữ liệu Các phần mềm này sẽ lấy các dữ liệu MS không được giải thích rõ ràng và kết hợp nó với những trình tự ở cơ sở dữ liệu protein, hay EST và trình tự bộ gen với các thuật toán đặc biệt Khía cạnh mạnh nhất của những công cụ này, là chúng cho phép tự động hóa được một lượng lớn các dữ liệu MS, cho các kết hợp trình tự protein khác nhau

Công c ụ cần thiết thứ tư là kỹ thuật phân tách protein Sự phân tách các protein có hai mục

đích trong proteomics Thứ nhất, chúng làm đơn giản các hỗn hợp protein thành các protein đơn lẻ hay các nhóm nhỏ Thứ hai, bởi chúng cho phép phát hiện các khác biệt trong các mức độ protein

so sánh giữa hai mẫu, nên kỹ thuật phân tách, nhằm phân tích protein sẽ cho phép người tiến hành xác định được các protein đặc biệt Thông thường, phương pháp điện di protein hai chiều (2D-SDS-PAGE) được sử dụng trong proteomics Một số kỹ thuật khác cũng được sử dụng là 1D-SDS-PAGE, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các kỹ thuật chạy điện di mao quản (Capillary electrophoresis_CE), sắc ký ái lực…

II.2.3 Các ứng dụng của proteomics

Kỹ thuật proteomics thật sự có tác động lớn với bốn ứng dụng chính

Khai thác (Mining): xác định các protein có trong một mẫu từ cơ sở dữ liệu gen

Ghi nh ận sự biểu hiện đặc biệt (Protein-expression profiling): xác định các protein trong

một mẫu đặc biệt, cũng như chức năng của một trạng thái đặc biệt của tế bào hay cơ thể (trạng thái biệt hóa, trạng thái phát triển, trạng thái bệnh…), hay chức năng của sự tiếp xúc với thuốc, các kích thích hóa lý

L ập các sơ đồ mạng lưới protein (Protein-network mapping): xác định phương thức các

protein tương tác với nhau trong các hệ thống sống

L ập bản đồ các biến đổi protein (Mapping of protein modification): xác định phương thức

và vị trí các protein bị biến đổi

Phân tích các quá trình chuyển hóa nội bào, metabolome, giúp hiểu được mạng lưới protein,

và sự hiện diện các gen im lặng (silent gene)

4

II.4 CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO

Công nghệ nano liên quan đến khả năng sắp xếp các phân tử và các nguyên tử thành các cấu trúc phân tử Nó có tác động chính lên máy tính, các vật liệu và sự sản xuất các công cụ, thiết bị, khả năng can thiệp vào các cấp độ điều trị bệnh

Các kỹ thuật thiết kế máy micro đang phát triển nhanh chóng và có nhiều ứng dụng trong các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, sợi quang học

Các microrobot và nanorobot hoạt động như các robot di động nhỏ trong dịch cơ thể là công

cụ tuyệt vời cho các thao tác tế bào

Sự ra đời của biochip là một tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học nano, chúng chứa đựng một phạm vi rộng các vấn đề nghiên cứu như genomics, proteomics, sinh học máy tính và dược học, cũng như một số hoạt động khác Những tiến bộ trong lĩnh vực này tạo ra những phương pháp mới, gỡ rối cho những quá trình sinh hóa xảy ra trong tế bào, với mục đích là tìm hiểu và chữa trị các căn bệnh cho người Các biochip được xem là các phòng thí nghiệm thu nhỏ, bởi lẽ trên nó

có thể tiến hành hàng trăm đến hàng ngàn phản ứng sinh hóa Biochip giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc nhanh một lượng lớn các chất sinh học với nhiều mục đích khác nhau, từ chẩn đoán bệnh đến phát hiện các tác nhân nguy hại sinh học

II.5 KỸ THUẬT TẾ BÀO ĐỘNG VẬT IN VITRO

Việc các tế bào động vật có thể nuôi cấy, duy trì và tăng sinh trong các chai, lọ ngày càng

dễ dàng hơn trong phòng thí nghiệm, đã mở ra hướng mới quan trọng trong nghiên cứu CNSH

N&ĐV- đó là công nghệ tế bào động vật Các dòng tế bào cũng được thiết lập, đây là mô hình in

vitro lý tưởng cho các nghiên cứu nói chung

Nuôi cấy các tế bào động vật lượng lớn là nền tảng của sản xuất vaccine virus và nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác Các chất sinh học được sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp trong nuôi cấy tế bào động vật như enzyme, hormone, các kháng thể đơn dòng, interleukin…hay các nhân tố kháng ung thư Mặc dù nhiều protein đơn giản hơn có thể được sản xuất ở vi khuẩn, nhưng nhiều dược chất cần sự glycosyl hóa, điều này hầu như phải được tiến hành trong tế bào động vật

Thu nhận, nuôi cấy và biệt hóa tế bào là một thành công mới trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào động vật Tuy mới phát triển, nhưng các tế bào gốc (stem cell) đã hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn trong y sinh học

5

CHƯƠNG 1 NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I GIỚI THIỆU

I.1 LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN

Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các tế bào, mô và cơ

quan của động vật nhằm duy trì và/hay tăng sinh các tế bào, mô, cơ quan đó một cách độc lập, tách

khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo ở điều kiện bình thường hoặc stress Kỹ thuật này đầu tiên

được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ tăng sinh của chúng rất chậm

Việc nuôi cấy mô và tế bào động vật đã được tiến hành hơn 100 năm nay, thông qua những nghiên cứu đầu tiên nhằm tìm hiểu một số vấn đề trong lĩnh vực sinh học phát triển Chẳng hạn Ross Harrison (1907) đã thành công trong việc nuôi tế bào thần kinh bằng dịch huyết ếch trưởng thành Alexis Carrel cũng đã nuôi phôi gà trong môi trường bổ sung các chất dinh dưỡng và giữ được tim phôi gà hoạt động đến tháng thứ ba (1912)

Năm 1955, Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô phức tạp, dịch huyết và những chất đang dùng nuôi tế bào có thể được thay bởi “một hỗn hợp các amino acid, vitamin, các co-factor,

carbohydrate và mu ối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh…”, điều này đã mở ra một thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro

Sau đó, hàng loạt các kỹ thuật nhằm khai thác, biến đổi và ứng dụng các tế bào động vật

nuôi cấy in vitro được tiến hành như tạo các tế bào biến đổi di truyền, nghiên cứu sự chuyển hóa và sinh lý tế bào, thu nhận và tạo dòng in vitro các dòng tế bào bình thường (tế bào sinh dưỡng, sinh

dục), và bất thường (tế bào ung thư) của người, cũng như của nhiều động vật khác

Từ một thực tế là những khối u của người có thể tạo nên dòng tế bào liên tục (như dòng tế bào Hela được Gey và cs thiết lập năm 1952), nuôi cấy mô của người đã được đầu tư nghiên cứu Sau đó, vào năm 1961 Hayflick và Moorhead khảo cứu về các tế bào bình thường có đời sống xác định Các dòng tế bào đầu tiên đã được thiết lập thành công, chúng duy trì ít nhất một phần đặc điểm, chức năng ban đầu như các tế bào tuyến thượng thận, tế bào tuyến yên, tế bào thần kinh, tế bào cơ

Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô ngày càng tinh vi, hiện đại do nhu cầu bức thiết của hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về ung thư

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) giữa tế bào động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn mới trong công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh

I.2 SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Các tế bào động vật có vú là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thường được phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve) Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai nhóm: các tế bào dịch huyền phù và các tế bào dính bám

6

- Các tế bào dịch huyền phù: là những tế bào không bám dính khi sinh trưởng trong môi

trường nuôi cấy in vitro, ví dụ các tế bào máu và tế bào lympho; những tế bào này không đòi hỏi bề

mặt để sinh trưởng

- Các tế bào dính bám: Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì

thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng (thủy tinh, plastic), được sử dụng phổ biến trong các ứng dụng là các tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast) Người ta thường sử dụng đĩa petri hoặc các chai trục lăn để nuôi cấy các tế bào dính bám Các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, microcapsule hoặc các thể mang có kích thước hiển vi (microcarrier) cũng được sử dụng rộng rãi để tăng tỷ lệ diện tích/thể tích trong nuôi cấy

Có một mối quan hệ quan trọng giữa hình dạng tế bào và tính chất bám dính của chúng Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ có hình dài, trải rộng trên mặt đáy hộp nuôi, ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối cầu đều

* Đặc điểm của các tế bào động vật

- Tế bào động vật không có vách, nhưng kích thước khá lớn (khoảng 10 µm), nên tính bền

cơ học yếu Do đó, tế bào động vật trong nuôi cấy in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác động khi khuấy

trộn để tách tế bào, thao tác… Vì vậy, khi thao tác với tế bào động vật, cần cố gắng thao tác nhẹ nhàng và trong thời gian ngắn nhất

- Tế bào động vật có tăng trưởng và phân chia chậm, nên hiệu suất sản sinh các chất có

hoạt tính sinh học rất thấp, chậm Do đó, để sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào động vật, cần phải có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn

- Ở tế bào động vật, có cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back), có nghĩa là sự gia tăng

nồng độ của một chất nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến ức chế tế bào tổng hợp và tiết chất đó ra môi trường Điều này có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí còn có thể làm chết hàng loạt Vì vậy, khi nuôi cấy mô – tế bào động vật, sau mỗi khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, cần thiết phải thay mới môi trường nuôi

- Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật

cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khi gắn vào

bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư, hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường, sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng mà không cần bám vào nền

- Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình, thông qua quá trình dung hợp

hai tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) hoặc quá trình biến nạp VD: chủng

tế bào bình thường có thể cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thư, thông qua quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hóa chất

- Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng (-197oC) suốt nhiều năm Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu

Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác như kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại, và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone… để

tăng trưởng và phân chia Tất cả những đặc điểm trên cần được lưu ý trong quá trình nuôi cấy in

vitro

- Các tế bào động vật có quá trình biến đổi hậu dịch mã chính xác (post translational modifications) đối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) như phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phoshorylation các gốc amino acid Những sửa đổi này rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm

Ví dụ quá trình glycosylation có thể giúp bảo vệ protein chống lại sự phân giải chúng, duy trì khả năng ổn định cấu trúc và biến đổi kháng nguyên

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh như ung thư, HIV, viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất

học và dược học

- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân sinh học hay các dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, đảo Langerhans để chữa tiểu đường…

tạo-* Hạn chế

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau:

- Tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật

- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn

- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị vỡ

- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn vào riêng biệt như vi sinh vật

- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

I.4 MỘT SỐ KHÁI NIỆM DÒNG TẾ BÀO

- Dòng tế bào (cell line): là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu

- Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line): là dòng tế bào nuôi cấy

trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ, và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian rất dài, có khi là vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào

8

buồng trứng chuột Trung quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh

Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)

- Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line): là dòng tế bào chỉ sống trong điều kiện nuôi cấy ở một thời gian giới hạn Đây thường là các dòng tế bào thường (không phải ung thư)

- Tế bào sơ cấp (primary cell): là các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện in vitro lần đầu tiên (nuôi cấy sơ cấp) sau khi được tách ra từ khối mô

- Tế bào thứ cấp (secondary cell): là các tế bào đã qua vài lần cấy truyền (nuôi cấy thứ cấp) sau khi được tách từ khối mô

I.5 CÁC CẤP ĐỘ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Nhìn chung, trong phòng thí nghiệm thường có ba cấp độ chính: nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy

mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào

I.5.1 Nuôi cấy tế bào

Tế bào trong điều kiện in vitro có những điểm khác biệt so với in vivo Thứ nhất là tế bào nuôi cấy in vitro không có đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt (tương tác đa chiều) như mô của tế bào in vivo Thứ hai là môi trường in vitro thiếu vài thành phần liên quan đến sự điều hòa in vivo,

do đó chuyển hóa của tế bào in vitro ổn định và dễ kiểm soát hơn trong in vivo, nhưng có thể không

thực sự đại diện cho mô

Tuy nhiên, dù thế nào đi nữa thì nuôi cấy mô – tế bào động vật cũng đã thể hiện nhiều khả năng đặc biệt trong nghiên cứu và ứng dụng, nó đã và đang là công cụ rất hữu ích

Có nhiều hình thức nuôi cấy khác nhau tùy đặc tính tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp: nuôi cấy sơ cấp (Primary culture), nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture), nuôi cấy huyền phù (Suspension culture) và nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture)

Nuôi cấy sơ cấp: là nuôi cấy các tế bào sau khi được tách ra từ cách mảnh mô và trước lần

cấy chuyền đầu tiên Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng để khai thác các tế bào ban đầu trong những mảnh mô, nhằm tạo ra các dòng tế bào mới

Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học, hay enzyme khi tách mô, hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận

Quy trình nuôi cấy sơ cấp: thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh mô sống
xử lý sơ bộ, loại bỏ vi khuẩn, nấm và các thành phần không mong muốn khác
tách tạo huyền phù tế bào đơn

đưa vào môi trường nuôi cấy

Nuôi cấy thứ cấp được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp

Nhiều dòng tế bào đã được thiết lập và thương mại hóa Phần lớn các dòng này được thu

nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ các tế bào bị biến đổi in vitro Tuy nhiên, các dòng

tế bào này được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm khác nhau nên có thể dẫn đến sự phát sinh các đặc tính mới khác nhau và khác với các tế bào sơ khai ban đầu Các tế bào nuôi cấy thứ cấp là đối tượng chính cho nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ tế bào động vật

Quy trình nuôi cấy thứ cấp: giải đông (đối với các tế bào được bảo quản lạnh)
đưa vào môi trường thích nuôi cấy thích hợp

9

Nuôi cấy huyền phù thường được tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…)

Có thể coi đây là phương pháp nuôi cấy trong không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận lượng lớn các tế bào mong muốn

Nuôi cấy lớp đơn được ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận từ các mô rắn (phổi,

thận, cơ, xương, mỡ…) cần nuôi phát triển thành lớp đơn Các dòng tế bào bám dính có thể được phân loại như tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mô thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast:

MRC-5 Thông thường, hình dạng in vitro của các tế bào sống nói trên luôn phản ánh nguồn gốc

của mô

Ngoài ra, một số dòng tế bào khi nuôi sẽ biểu hiện trạng thái bán bám dính (semi-adheret)

như B95-8 Khi đó, trong dụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám và các tế bào huyền phù

* Những thuận lợi của nuôi cấy tế bào

- Có thể phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ

- Có thể nuôi cấy ở quy mô lớn

* Những bất lợi của nuôi cấy tế bào

- Tế bào bị mất đi một số đặc tính đã biệt hóa trong mô

I.5.2 Nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp được tiến hành bằng cách đặt các mảnh mô lên trên bề mặt rắn bằng nhựa, hay thủy tinh bao phủ bởi các chất dinh dưỡng dạng lỏng Trong điều kiện thích hợp, các mảnh mô sẽ bám vào bề mặt rắn, các tế bào ở phần rìa của mảnh mô sẽ tăng sinh làm nới

rộng mảnh mô Kỹ thuật này cung cấp mô hình thử nghiệm thuận lợi hơn so với các thử nghiệm in

vivo, đặc biệt khi tiến hành các nghiên cứu về độc tố Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp còn dùng để thu nhận các quần thể tế bào

* Những thuận lợi của nuôi cấy mô

- Các yếu tố lý hóa của môi trường (pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, O2, CO2) được kiểm soát tốt Các yếu tố bổ sung có thành phần không xác định cũng đang dần được hiểu rõ và được thay thế bởi những thành phần xác định

- Mẫu mô không đồng nhất nhưng sau vài thế hệ nuôi cấy in vitro, những dòng tế bào này

trở nên đồng nhất hơn hay ít nhất là cùng dạng

- Những tế bào nuôi cấy có thể tiếp xúc trực tiếp với một chất ở nồng độ thấp và xác định,

và chất này có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào

- So với nuôi cấy cơ quan thì trong nuôi cấy mô, một số chức năng bình thường của mô vẫn được duy trì và có thể nuôi cấy trên quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)

* Những khó khăn của nuôi cấy mô

- Tổ chức ban đầu của mô bị mất

- Kỹ thuật nuôi cấy cần được thực hiện ở điều kiện vô trùng tuyệt đối Tế bào động vật đòi hỏi được cung cấp một môi trường phức hợp, giống huyết tương máu hay dịch lỏng ở kẽ các tế bào

Do đó, đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ năng thành thạo và hiểu biết tốt về lĩnh vực này

- Tiêu hao nhiều công sức và tiền bạc nhưng chỉ thu được một lượng nhỏ Giá thành việc nuôi cấy cao, do đó chỉ nên sử dụng khi cần thiết

10

- Sau một thời gian phân chia liên tục, có thể tạo thành các tế bào với bộ NST đa bội không hoàn chỉnh Ngay cả với nuôi cấy trong thời gian ngắn, mặc dù các tế bào có thể ổn định về mặt di truyền, nhưng sự không đồng nhất về tốc độ tăng trưởng của từng tế bào có thể tạo ra sự thay đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác

I.5.3 Nuôi cấy cơ quan

Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan được phát triển từ các phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ

nghiên cứu, đây có thể là mô hình chức năng trong nhiều thử nghiệm Đó là kỹ thuật nuôi cấy in

vitro những mảnh của một cơ quan hay cả cơ quan, duy trì cấu trúc của mô và hướng nó phát triển bình thường Môi trường nuôi cấy cơ quan có thể ở dạng môi trường rắn hay môi trường lỏng

Việc nuôi cấy cơ quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng hơn các cơ quan từ cơ thể trưởng thành, bởi nhu cầu O2 của những mô trưởng thành lớn hơn nhiều Vì vậy, để nuôi được các cơ quan

từ cơ thể trưởng thành phải sử dụng môi trường với các thiết bị đặc biệt

Những thuận lợi của nuôi cấy cơ quan:

- Chức năng sinh lý bình thường của cơ quan được duy trì

- Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn

Những bất lợi của nuôi cấy cơ quan:

- Không thể nuôi cấy quy mô lớn

- Cơ quan nuôi cấy phát triển chậm

- Thường xuyên phải cấy chuyền sang môi trường mới cho mọi thí nghiệm

II ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

II.1 Nhiệt độ

Tế bào của các loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác nhau VD: tế bào của động vật có vú và của người phát triển tốt ở 37 ± 10C, nhiệt độ tế bào của các loài chim phát triển tốt ở 38,50C, còn tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25 ± 20C Một số dòng tế bào phát triển ở nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt bình thường của cơ thể, VD: tế bào biểu mô,

tế bào tinh trùng

Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn 20C so với nhiệt

độ phát triển thích hợp của chúng, nhưng tế bào lại có khả năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng mà rất ít ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này

Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, thường phải sử dụng tủ ấm (incubator) Nhìn chung, các tủ ấm duy trì nhiệt độ bằng cách làm ấm và tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với những thay đổi nhiệt và sẽ trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau khi mở hay đóng cửa tủ Đối với các tủ ấm có bổ sung nước ở khay bên dưới sẽ duy trì độ ẩm cao

II.2 pH

pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt Sự biến đổi pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng

11

sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn đến sự chết tế bào (apoptosis) Do vậy, kiểm soát

pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào nuôi cấy khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng tế bào Hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh pH ở 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2) Một số dòng tế bào thích hợp với pH cao hơn (VD: tế bào fibroblast người thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp hơn (VD: tế bào côn trùng phát triển tốt ở pH 6,2±0,1)

Môi trường có pH ổn định ít thay đổi có thể giúp tế bào sống tốt hơn

Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red như là một chất chỉ thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) và màu hồng nếu pH tăng (kiềm)

II.3 Áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu của môi trường được xác định bởi chính công thức môi trường Muối và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm thấu, mặc dù các amino acid cũng quan trọng Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào hầu như luôn tác động lên sự tăng trưởng và chức năng tế bào Nếu tế bào nằm trong môi trường có áp suất không thích hợp, chúng sẽ biến dạng: tế bào co lại trong môi trường có áp suất thẩm thấu quá cao, còn trong môi trường có áp suất quá thấp, chúng sẽ căng phồng lên

Để kiểm tra áp suất thẩm thấu của môi trường, thường sử dụng Osmom kế (Osmometer) Các môi trường thương mại được thiết kế để áp suất thẩm thấu là 300 mOsm (tế bào phát triển trong khoảng 290 - 310 mOsm)

Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292 g/lít NaCl sẽ làm tăng

1 mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu lên 10 mM) Chú ý là trong môi trường còn có các thành phần đường, ion, các amino acid…chúng cũng đóng góp vào sự tạo áp suất thẩm thấu

II.4 Các loại khí

Ba lo ại khí cần quan tâm: CO2, O2 và N2 Tỷ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ đó các phân áp khí được tạo ra thích ứng với đặc điểm sinh lý của tế bào và mô sống

O2 có vai trò quan trọng trong sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào Tuy nhiên, nhu cầu

về O2 của tế bào nuôi cấy thấp hơn nhu cầu O2 của mô sống Áp suất O2 trong tủ nuôi cấy tế bào thường thấp hơn áp suất O2 trong không khí Trong quá trình nuôi cấy tĩnh, các phân tử oxy trong không khí luôn có xu hướng khuếch tán vào môi trường nuôi, qua lớp môi trường dày chừng vài milimet Do vậy, nếu sử dụng quá nhiều môi trường trong một thể tích hẹp sẽ kìm hãm sự khuếch tán oxy Nồng độ O2 phổ biến dùng trong tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%

Tác động của CO2 lên nuôi cấy tế bào khó được xác định một cách chính xác, bởi nó liên quan đến hàm lượng CO2 hòa tan, pH, nồng độ HCO3- Áp suất CO2 trong không khí có thể điều hòa trực tiếp nồng độ CO2 hòa tan, với sự tham gia của yếu tố nhiệt độ Chính sự biến đổi thuận nghịch CO2 thành HCO3- có thể sẽ làm thay đổi pH của môi trường nuôi, do vậy, nồng độ CO2trong tủ nuôi có tính quyết định đến pH của môi trường nuôi cấy Điều này được hiểu là, có thể dùng nồng độ CO2 để ổn định pH của môi trường nuôi Tùy vào mỗi loại tế bào để chọn nồng độ

CO2 tương ứng

12

III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi trường nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, thường chứa các thành phần không xác định Do thành phần phức tạp, khó ổn định nên người ta quan tâm dần đến nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để

có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành phần trong những lần nuôi cấy khác nhau

Môi trường nuôi cấy chứa phần lớn là nước Nếu nguồn nước không ổn định có thể tạo nên

sự khác biệt quan trọng trong chất lượng sử dụng Điều này đặc biệt quan trọng đối với các môi trường không có huyết thanh, vì các hợp chất hữu cơ và kim loại hiện diện trong nước cất vô trùng khử ion có thể gây độc nghiêm trọng đối với một số kiểu tế bào

III.1 Vai trò của môi trường

Môi trường nuôi cấy cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào in

vitro Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amiono acid, acid béo, đường, các ion, các vitamine, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho tế bào Một

số thành phần có thể giữ nhiều vai trò hơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích hợp và tạo áp suất thẩm thấu cho môi trường

III.2 Thành phần của môi trường

a Muối vô cơ

Các muối vô cơ trong môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển tế bào in vitro,

như: cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì cơ chế vận chuyển chất qua màng, giúp điều hòa điện thế màng, bám gắn tế bào, hoạt động như các cofactor

b Hệ đệm

Hệ đệm có vai trò điều hòa pH của môi trường nuôi cấy Hầu hết các môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 là thành phần chính Ngoài ra, còn có hệ thống đệm phosphat và các đệm hữu cơ phức tạp khác Cũng có thể sử dụng hệ đệm hữu cơ hay huyết thanh trong môi trường cơ bản

Khi sử dụng bicarbonate làm hệ thống đệm chính trong môi trường thì sự tương tác của CO2thu nhận từ các tế bào (hay từ không khí) với nước, sẽ dẫn đến sự điều chỉnh pH môi trường theo cân bằng của phương trình:

(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-Một số dung dịch đệm như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thường sử dụng

trong sinh hóa có thể gây độc đối với tế bào in vitro

c Carbohydrate

Đường trong môi trường là nguồn cung cấp C và năng lượng cho sự phát triển tế bào in

vitro Các đường chính được sử dụng là glucose và galactose, một số môi trường còn sử dụng

e Các protein và peptide

Các thành phần này giữ vai trò quan trọng trong nuôi cấy hầu hết các tế bào, đặc biệt khi nuôi cấy với môi trường không huyết thanh Một số protein, peptide rất cần thiết như albumin, transferring, fibronectin và fetuin thường có sẵn trong huyết thanh

f Acid béo và lipid

Giống với protein và peptide, các chất này rất cần thiết trong môi trường nuôi không huyết thanh và cho một số tế bào đặc biệt Chúng hiện diện trong huyết thanh với các dạng như cholesterol và steroid

g Yếu tố vi lượng

Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong đó selenium là chất giúp tách các gốc oxy tự do Ngoài ra, tùy vào mục đích nghiên cứu để có thể đưa vào môi trường một số vi lượng cần thiết khác

h Huyết thanh

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh bởi nó

có những vai trò quan trọng như sau:

- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin, tránh các enzym gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Chống oxy hóa: huyết thanh kháng oxy hóa mạnh, và ức chế độc tính của oxy

- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật Tuy nhiên, bên cạnh những tác động tốt nêu trên, huyết thanh cũng có những tác động không tốt:

- Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao, nhất là huyết thanh bò (FBS)
làm tăng giá thành lên đáng kể (huyết thanh chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy)

- Huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau

14

- Huyết thanh còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa (VD: TGF - có tác dụng ức chế sự phân chia của tế bào thượng bì khí quản, làm tế bào biến thành hình có góc cạnh; TGF- còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia của dòng tế bào biểu bì người và chuột), (do đó khi nuôi cấy, cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy)

- Một số tế bào nuôi cấy không (hoặc kém) phát triển trong huyết thanh, chúng thích ứng với các môi trường cục bộ chuyên biệt, có tính chất khác biệt rõ rệt với huyết thanh

- Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, các lipoprotein ) thường không ổn định khi đông lạnh hay bảo quản lâu Môi trường bổ sung huyết thanh sẽ có nồng độ hormone hay các nhân

tố tăng trưởng không thích hợp với sự phát triển của một số tế bào

- Huyết thanh không pha loãng sẽ độc với nhiều loại tế bào (cũng có một số loại tế bào có khả năng chịu đựng được nồng độ huyết thanh cao hơn các tế bào khác, VD: các tế bào nội mô thành mạch vì chúng phát triển trong môi trường tương tự huyết thanh nhưng không hoàn toàn giống huyết thanh)

- Khi mất nồng độ hormone thích hợp, huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất ức chế sự phát triển, biệt hóa hay chức năng Huyết thanh cũng kích thích sự biệt hóa của các tế bào vào trạng thái không nguyên phân, làm chúng không thể duy trì dòng tế bào bất tử

Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu hướng đến xây dựng các môi trường tổng hợp không dùng huyết thanh (như M-199) hay dùng với lượng thấp (CMRL 1066, NTCT 109) Để phát triển tế bào trong môi trường không huyết thanh, c1o nhiều cách tiếp cận, tất cả các chiến lược này đều nhằm kết hợp sự thay đổi liên tục với việc làm giàu các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi:

- Tạo sự thích nghi của các tế bào với môi trường không huyết thanh và không bổ sung hormone nào

- Sử dụng huyết thanh đã được làm giảm (hay loại bỏ hoàn toàn) các lớp hormone không cần thiết

- Bổ sung thường xuyên vào môi trường không huyết thanh các nhân tố tăng trưởng, bám dính và các nhân tố phù hợp khác

III.3 Chọn lọc môi trường thích hợp

Nếu một dòng tế bào mới được mang vào phòng thí nghiệm, cần xác định môi trường thích hợp để phát triển Các thông tin này có thể được đưa ra bởi nhà cung cấp Cũng có thể tự tìm được thông tin thông qua việc sàng lọc, thử nghiệm với nhiều loài môi trường khác nhau trong cùng điều kiện nuôi để xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy những tế bào phát triển sơ cấp đầu tiên, những dòng tế bào còn thiếu thông tin hoặc muốn tìm môi trường mới thay thế cho một dòng tế bào nào đó

Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập được thuần hóa với môi trường tổng hợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào còn lại được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổ sung 5–10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh) Được sử dụng phổ biến là huyết thanh

bê, cũng có một số loại tế bào đòi hỏi bổ sung huyết thanh bào thai bò trong môi trường nuôi cấy Ngoài huyết thanh, một số những dịch chiết sinh học phức tạp (sữa, dịch chiết phôi, huyết tương ), các nhân tố tăng trưởng, hormone cũng thường được bổ sung vào môi trường

15

III.4 Kỹ thuật pha môi trường

- Thành phần môi trường: khác nhau tùy vào loại sử dụng Khi pha môi trường cần phải đảm bảo cung cấp đầy đủ các thành phần theo đúng công thức

- Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở nhiệt độ ấm khoảng 36-39oC Đặc biệt khi nuôi cấy tế bào động vật, điều kiện về độ ẩm và nồng độ CO2 trong không khí rất quan trọng Trong các tủ nuôi cấy tế bào động vật thường đặt một khay nước để tạo

độ ẩm cao trong không khí, tránh bốc hơi nước từ môi trường nuôi, dẫn đến thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường Nồng độ CO2 trong tủ nuôi thường 5%, đặc biệt có khi đến 95%

- Sự vô trùng: đây là yếu tố cực kỳ quan trọng và được lưu ý đặc biệt trong nuôi cấy tế bào động vật Virus và các vi sinh vật ngoại nhiễm là những nguy cơ lớn, có thể làm chết tế bào nuôi cấy Tùy theo tính chất hóa học của các thành phần môi trường để chọn cách khử trùng thích hợp,

có thể là hấp ướt hoặc lọc vô trùng bằng milipore

IV KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

IV.1 NUÔI CẤY SƠ CẤP

Quy trình nuôi s ơ cấp gồm:

Hình 1.1 Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp

THU NHẬN MẪU MÔ

Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

16

+ Bước 1: thu nhận mô (tươi hay đông lạnh) có chứa tế bào sống

+ Bước 2: phẫu tích và/ hay tách rời tế bào, xác định nồng độ

+ Bước 3: nuôi cấy

IV.1.1 Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ

Mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ ở mô nào của cơ thể Tại nơi thu nhận, mẫu cần được làm sạch (rửa và sát trùng bằng cồn) rồi đưa vào bảo quản trong dung dịch DPBS rồi chuyển nhanh

về phòng thí nghiệm Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết đưa về phòng thí nghiệm, để có

kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện nhiệt độ ấm (370C), nhiệt độ lạnh hay đông lạnh tạm thời

Xử lý sơ bộ mẫu mô: rửa nhiều lần bằng dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm
cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa
cắt mảnh nhỏ ra thành từng mảnh 2-3 mm2
nuôi mẫu mô sơ cấp hoặc tách rời các tế bào

VI.1.2 Tách rời các tế bào

Mô là tập hợp các tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào Tách các tế bào ra khỏi mô cần phá bỏ những cầu nối liên bào này, nhưng không gây tổn thương đáng kể cho tế bào Có hai biện pháp chính để tách rời các tế bào:

a Tách bằng cơ học

- Cắt nhuyễn mô: Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mô, huyền phù trong dung dịch PBS (-), để

lắng và thu dịch trong (huyền phù thu nhận các tế bào đơn) Phương pháp này cho khả năng sống của tế bào cao nhưng số lượng tế bào đơn thu nhận ít nên thường được áp dụng cho những mẫu mô

có kích thước lớn và không khan hiếm

Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô với enzyme trong kỹ thuật tách bằng enzyme được tiến hành sau đó

- Ép nhuyễn mô sử dụng hai phiến lame: thường được sử dụng để tách tế bào ở những mô có

liên kết yếu (như mô lách) Ngoài ra còn có thể sử dụng các pittong của syringe để ép mô trong đĩa petri nhằm tách rời các tế bào

- Ép bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): đặt mẫu mô lên trên màng lọc (có đường kính lỗ

70 – 100µm), sử dụng pittong của syringe để chà sát mạnh mảnh mô, khi đó, những tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời Những tế bào đơn (có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc) sẽ lọt qua lỗ lọc

b Tách bằng enzyme

Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thuỷ phân protein như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay những tổ hợp khác Việc sử dụng enzyme có thể riêng lẻ, hay kết hợp tùy thuộc vào mục đích

Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl COOH) của lysin hoặc arginin và gốc amin

(-NH2) của axid amin bất kì đứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và arginin Xử lý trypsin dẫn đến sự cuộn tròn tế bào Khi các tế bào co lại, các liên kết trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học

Trypsin hoạt động trong môi trường pH 6 – 9, tối ưu ở pH 8 – 9, rất bền vững trong môi trường acid yếu

17

Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi vắng mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ Một số kim loại như coban, mangan… có khả năng hoạt hóa trypsin Hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh bò có thai hoặc DFP (di-isopropyl fluoro phosphate)

Nồng độ trypsin thường dùng để tách tế bào là 0,01–0,5% (thường là 0,25%), đôi khi là 1%

Có thể sử dụng quy trình trypsin ấm (370C) hay trypsin lạnh (40C)

Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các protein ở màng

và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động trong thời gian dài Cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu đuợc tế bào đơn

Collagenase là enzyme thủy phân các liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc trưng cho vùng xoắn của collagen Collagenase thu nhận từ động vật hữu nhũ thì cắt chuỗi collagen tại những điểm riêng biệt, còn thu nhận từ vi khuẩn thì cắt tại nhiều vị trí dọc trên chuỗi collagen

Đa số các collagenase hoạt động ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7- 8), nhiệt độ thích hợp dưới 400C, và giảm hoạt tính ở nhiệt độ trên 450C Có 4 loại collagenase:

- Collagenase loại I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin hoạt động) Chúng thường được dùng cho việc tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và những tế bào mô thượng thận

- Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn, được sử dụng để tách tế bào từ tim, xương, cơ và sụn

- Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp

- Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy

Collagenase và dispase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại tế bào Người ta còn sử dụng hyaluronidase kết hợp với collagenase để phân hủy các chất dịch nội bào, DNase được sử dụng để phân hủy các DNA thoát ra từ các tế bào bị ly giải

Chymotrypsin có tính đặc hiệu kém hơn trypsin, nó phân giải các liên kết peptide tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và leucin) với một nhóm amin của một acid amin khác Chymotrypsin có pH thích hợp từ 8 – 9, và bị

ức chế bởi DFB (di-isopropyl fluoro phosphate)

Papain thủy phân protein thành các polypeptid và các acid amin Papain chịu được nhiệt độ tương đối cao (dạng khô không bị biến tính ở 1000C trong 3 giờ), hoạt động ở pH từ 4,5 – 8,5 (tùy vào cơ chất để lựa chọn độ pH thích hợp nhất cho mỗi phản ứng) Papain bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, thủy ngân chlobenzoate, cystin và các hợp chất disulfur khác

Elastase thủy phân một số lượng lớn protein nền Elastase là enzyme duy nhất có khả năng thủy phân elastin, một chất nền không bị tác động bởi trypsin, chymotrypsin hay pepsin

Elastase thường được sử dụng có kết hợp với các enzyme khác như collagenase, trypsin và chymotrypsin Elastase là enzyme được chọn để tách tế bào từ phôi

c Tách tế bào bằng các phương pháp khác

+ Ph ương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng: được sử dụng để phân tách tinh trùng hay các

tế bào đơn nhân trong máu Môi trường ly tâm thường sử dụng là Percoll, Ficoll…

18

VD: Quy trình Ficoll dùng để phân tách tế bào máu đơn nhân:

- Pha loãng máu (có chất chống đông) 2 lần với dung dịch đệm PBS

- Đặt 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm ở tốc độ 400g trong 20 phút ở 240C

- Thu dịch nổi, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm

- Ly tâm lần nữa ở tốc độ 500g trong 20 phút ở 240C

- Thu cặn, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm

- Bảo quản dịch huyền phù tế bào ở 2 – 80C

+ Ph ương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt (là những receptor bề mặt của tế bào):

được sử dụng để đánh dấu và phân lập tế bào gốc Những tế bào gốc hiếm hoi được chọn từ hàng triệu tế bào khác Dịch tế bào được đính một phân tử huỳnh quang vào receptor, dưới tác dụng của lực đẩy, dịch (có tế bào) sẽ đi qua một đầu kim rất nhỏ, sao cho mỗi lần chỉ có một tế bào Ở đầu ra của kim là một nguồn ánh sáng, thường là tia laser và sau đó là một điện trường Những tế bào phát huỳnh quang sẽ mang điện tích âm, còn những tế bào không phát huỳnh quang mang điện tích dương Sự tích điện khác nhau như vậy cho phép thu nhận tế bào cần

Mặc dù mỗi loại mô có những yêu cầu về điều kiện tách khác nhau, nhưng cho dù là mô nào, khi tách tế bào để nuôi cấy đều cần lưu ý một số điểm sau:

- Các mô mỡ, mô chết, mô tạp phải được loại bỏ ra trong quá trình tách

- Mô nên được cắt nhuyễn bằng dụng cụ nhọn, bén để tránh hư hại tế bào

- Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào, trước đó phải được tách ra khỏi dung dịch (bằng ly tâm), hay phải bị bất hoạt (bằng huyết thanh)

- Nồng độ tế bào thu nhận cho nuôi cấy sơ cấp phải đảm bảo, đồng thời luôn cao hơn nồng

độ tế bào nuôi cấy sau đó

- Hồi phục tế bào bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng cao hay bổ sung huyết thanh với nồng độ cao

- Phân tách tế bào từ mô non hay phôi nhanh hơn, hiệu quả cao hơn, tế bào thu được nhiều hơn, sống và tăng sinh mạnh hơn so với các mô đã trưởng thành

IV.1.3 Nuôi cấy thu nhận tế bào

a Nuôi tế bào sơ cấp

Ly tâm dịch tách tế bào
loại bỏ dịch nổi, thu cặn
huyền phù tế bào
đưa dịch huyền phù tế bào vào bình nuôi cấy (bình Roux), bổ sung môi trường
ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24 giờ thay môi trường mới và tiếp tục ủ

Sau lần nuôi cấy sơ sẽ cấp thu được các tế bào sơ cấp Thành phần tế bào sơ cấp rất phức tạp, bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau cùng hiện diện trong bình nuôi Để có dòng tế bào thuần nhất, cần thực hiện bước tiếp là chọn dòng

b Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp

Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, cần nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào, tránh mất mẫu khi tách mô: đặt các mảnh mô trong đĩa nuôi, sử dụng cùng môi trường với môi trường nuôi tế bào từ mô đó

19

Các mảnh mô thường nổi, hay lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, thường bị chết nhanh nếu không bám vào bề mặt nuôi Có thể bổ sung ít môi trường để tăng sự bám dính của mảnh mô vào

bề mặt dụng cụ nuôi hoặc cố định mẫu mô bằng huyết tương/ huyết thanh

Khi các tế bào đã phát triển và lan rộng ra từ các rìa của mảnh mô, tiến hành tách bỏ mẫu

mô và thu được tế bào

c Cấy chuyền

Cấy chuyền rất cần để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục Tần số và tỷ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào trong cấy chuyền phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng Nếu dòng được cấy chuyền quá thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp, chúng có thể bị mất

C ấy chuyền bao gồm các thao tác sau:

- Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ

- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám)

- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

C ấy chuyền các tế bào bám dính:

- Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi Nếu các tế bào bám chặt, có thể đổ bỏ môi trường Nếu nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa, sau đó làm lỏng sự bám dính các tế bào bằng dung dịch trypsin

- Rửa dụng cụ nuôi với PBS

- Bổ sung dung dịch trypsin

- Ủ trong tủ ấm 370C chừng 2 – 3 phút (tùy kiểu tế bào và kiểu nuôi)
xem dưới kính hiển vi: nếu các tế bào có hình tròn có nghĩa là chúng đã tách ra khỏi bề mặt giá thể nuôi

- Huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh, và rửa tế bào bằng cách ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút
tái huyền phù bằng môi trường nuôi (bước này có thể bỏ nếu tỷ lệ pha loãng cao trong môi trường có chứa huyết thanh)

C ấy chuyền các tế bào huyền phù:

Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay các spinner có thể được duy trì bằng việc pha loãng một lượng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi:

- Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm tế bào

- Tách lấy một lượng huyền phù để đếm hoặc pha loãng vào bình nuôi mới
ly tâm
thu cặn, loại bỏ dịch nổi
tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi
lấy một thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào các bình nuôi và tiến hành nuôi

IV.2 TẠO DÒNG TẾ BÀO

Việc tạo dòng đảm bảo tất cả các tế bào con cháu đều xuất phát từ một tế bào đơn và có cùng một đặc tính di truyền Ý nghĩa của việc tạo dòng là ngăn cản những thay đổi nhanh, và không đoán trước trong kiểu hình nuôi cấy Hơn nữa việc tạo dòng cho phép sàng lọc số lượng lớn các dòng cũng như chọn lọc các dòng tế bào với đặc tính mong muốn Nói chung việc tạo dòng cho phép chọn lọc một chủng tế bào với các đặc tính tối ưu cho nghiên cứu

20

Tái tạo dòng (recloning) là công việc thiết lập lại các đặc tính vốn có của dòng, một khi chúng bị biến đổi (bởi các dòng tế bào đã thiết lập có thể tạo ra một sự biến đổi nào đó với các đặc tính phù hợp hơn, trong môi trường nuôi nào đó)

Nếu muốn thay đổi các đặc tính tế bào thông qua đột biến hay chuyển nhiễm, thì việc tạo dòng không cần thiết Do đó, có thể tạo các biến đổi quan trọng trong các kiểu hình đặc biệt, sau một vài thế hệ cấy chuyền

Trong môi trường nuôi cấy, một tế bào riêng rẽ sẽ nguyên phân tạo nhiều tế bào con Các tế bào này quần tụ tại vị trí của tế bào mẹ ban đầu, hình thành nên một tập đoàn (colony) Như vậy, các tế bào của một tập đoàn sẽ có cùng đặc tính kiểu gen và kiểu hình, hay nói cách khác, chúng cùng một dòng

IV.2.1 Kỹ thuật chọn dòng tế bào

Phương pháp tiến hành:

- Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo huyền phù tế bào

- Cấy tế bào vào đĩa nuôi có môi trường mới với mật độ thấp (để các tế bào cách xa nhau trong đĩa nuôi) Nuôi ủ tế bào cho đến khi chúng phát triển các colony riêng rẽ

- Chọn một colony tế bào cần tạo dòng, cô lập bằng một một ống kim loại nặng có kích thước phù hợp Hút bỏ môi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này bằng trypsin, cấy sang đĩa môi trường mới

Nếu cần thiết có thể thực hiện bước chọn dòng này vài lần nữa cho đến khi đảm bảo thu được dòng tế bào từ một tế bào đầu tiên

Cấy chuyền tế bào

- Đổ bỏ trypsin, vỗ nhẹ bình Roux để tế bào tách khỏi vách bình Roux

- Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng đều lên bề mặt bình Roux có tế bào

- Hút vào mỗi bình Roux mới 5ml môi trường E’MEM

- Dùng pipette hút sục môi trường và phun đều vào bề mặt bình Roux có tế bào để tạo huyền phù

- Hút dịch huyền phù cho vào bình Roux mới, lắc nhẹ, ủ ở 37,50C trong tủ nuôi

- Sau 24 giờ, đổ bỏ môi trường cũ, cho môi trường mới vào để loại bỏ trypsin và các tế bào chết

M ột bình Roux chứa đầy tế bào có thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình Roux mới

21

IV.2.2 Các phương pháp tạo dòng

a Phương pháp ống syringe: giúp thu nhận các tập đoàn tế bào quan tâm được nuôi cấy

trên môi trường thạch

- Ủ trong tủ ấm và quan sát bắt đầu vào ngày thứ 5

- Khi tập đoàn phát triển chừng 50 – 100 tế bào, có thể “nhặt ra” các tập đoàn chọn lọc, cần chắc chắn rằng các tập đoàn chọn lọc đủ xa khỏi các “hàng xóm cũ” của nó để vòng nhẫn tạo dòng

sẽ chỉ chứa một tập đoàn duy nhất

- Hút bỏ môi trường và rửa với PBS

- Trét mặt dưới một ống syringe (bằng thép không gỉ) một lớp mỡ silicone đã hấp khử trùng Dùng kẹp syringe vào đĩa, ấn xuống để chắc chắn nó được gắn tốt Mỗi syringe không nên chứa hai tập đoàn

- Tiếp tục đến khi có 5 – 10 tập đòan/đĩa được chọn và bao phủ đều

- Cho trypsin vào syringe, ủ đến khi các tế bào trở nên tròn và nổi lên khi kiểm tra dưới kính hiển vi

- Pha loãng trypsin với môi trường phát triển và cẩn thận hút đảo nhẹ khi kiểm tra dưới kính hiển vi

- Thêm môi trường tăng trưởng vào giếng

- Lấp đầy các giếng với nước cất vô trùng hay PBS

- Ủ ở 370C và kiểm tra sự phát triển hàng ngày

b Phương pháp pha loãng tới hạn

Ở các nồng độ pha loãng rất thấp, trong một thể tích dung dịch nhất định có thể chỉ chứa một tế bào duy nhất Các tế bào đơn này được nuôi cấy trong các vi giếng, hình thành một tập đoàn Dòng tế bào quan tâm được chọn trực tiếp từ những tập đoàn này

Phương pháp này có thể được sử dụng với các tế bào huyền phù hay tế bào bám

có thể sẽ không có tế bào nào

- Từ 12 – 14 giờ kiểm tra các dòng sau khi trải, đánh dấu các đĩa có tế bào đơn Nếu có giếng có từ hai tế bào trở lên phải bỏ giếng đó

- Các dòng có thể được trực tiếp sàng lọc từ các giếng nuôi của đĩa

- Khi một dòng được chọn, chúng được nhặt ra và nuôi vào đĩa 24 giếng, 35mm và cuối cùng là 100mm Có thể sử dụng cùng loại môi trường ở lần nuôi đầu tiên

c Phương pháp dùng môi trường không huyết thanh

Tạo dòng trong môi trường không huyết thanh tương tự với phương pháp tạo dòng nêu trên, ngoại trừ cần phải trung hòa trypsin với STI và rửa bằng cách ly tâm

V CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

V.1 HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRUYỀN THỐNG (NUÔI CẤY TẾ BÀO 2D)

Nuôi cấy tế bào truyền thống là phương pháp nuôi cấy trên đĩa Petri 2D, đĩa nhiều giếng 2D hay bề mặt lam kính 2D Tuy nhiên, cấu trúc môi trường bình thường của một tế bào trong cơ thể sống là 3D gồm một mạng lưới phức tạp các vi sợi khuôn ngoại bào với các vi lỗ; trong đó các tế bào được các tế bào khác bao quanh, với các ligand ngoại bào, bao gồm nhiều loại colagen, laminin

và các protein nền khác, không chỉ cho phép liên kết tế bào – tế bào, tế bào – màng cơ bản mà còn dẫn oxy, hormone, dưỡng chất vào và loại bỏ các sản phẩm thải Vì vậy, phương pháp nuôi cấy truyền thống thể hiện một số hạn chế, đó là:

- Không thể thiết lập một gradient 3D “đúng” trong nuôi cấy 2D – điều này có ảnh hưởng nhất định đến sự biệt hóa sinh học, quyết định số phận của tế bào, sự phát triển cơ quan, truyền tín hiệu, truyền thông tin thần kinh và vô số các quá trình sinh học khác

- Tế bào được phân lập trực tiếp từ cơ thể thường xuyên thay đổi sự chuyển hóa và các kiểu biểu hiện gen hi được nuôi cấy 2D vì sự thích ứng của các tế bào với đĩa petri 2D đòi hỏi sự điều chỉnh đáng kể của quần thể tế bào đang sống không chỉ để thay đổi oxy, dưỡng chất và các tương tác ECM mà còn để loại bỏ chất thải

- Các tế bào tăng trưởng trong môi trường 2D có thể thay đổi đáng kể khả năng xản xuất các protein ECM của riêng chúng và thường xuyên chịu những biến đổi về hình thái (VD: gia tăng sự trải rộng)

- Các tế bào nuôi cấy in vitro thiếu các tác nhân tín hiệu và hormone chủ yếu (như bình

thường, chúng được cung cấp đầy đủ trong cơ thể từ hệ tuần hoàn)

V.2 HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 3D

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D được ứng dụng nhằm phát triển các mô và cơ quan thay thế Trong kỹ thuật này, người ta đưa tế bào và các nhân tố tăng trưởng vào trong các scaffold tổng hợp (hoạt động như ECM tạm thời) để giúp các tế bào tổ chức thành các mô khác nhau (da, sụn, gan, thần kinh, mạch ) hay thậm chí là cả cơ quan

Scaffold là một khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào, hướng dẫn tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều Sau khi được đưa vào scaffold, các tế bào sẽ bám, sau đó

23

sao chép, biệt hóa và tổ chức thành mô khỏe mạnh bình thường, cùng với việc tiết ra các thành phần nền ngọai bào cần để tạo mô Vì vậy, việc chọn lựa scaffold là cốt yếu để tạo ra các mô và cơ quan có hình dạng và kích thước mong muốn Oxy và dưỡng chất được cung cấp từ môi trường

lỏng nuôi cấy tế bào Các tế bào bắt đầu tăng sinh và di cư vào các lỗ của scaffold

Các polymer tổng hợp (như PGA, PLA, PLGA, PCL) và các polymer tự nhiên (alginate, agarose, gel collagen, polyglycosaminoglican ) xuất hiện trong những thập kỷ gần đây được lựa chọn phổ biến để chế tạo scaffold vì sự hấp dẫn, linh hoạt để ứng dụng cho sự tăng trưởng của phần lớn các mô

Phương pháp này cũng tồn tại một số hạn chế:

- Sự phân hủy các polymer tổng hợp (cả trong điều kiện in vitro và in vivo), giải phóng các

sản phẩm phụ có tính acid, khiến vi môi trường scaffold không lí tưởng cho sự tăng trưởng mô

- Các polymer tự nhiên có thể gây đáp ứng miễn dịch, do đó cần làm giảm tính kháng nguyên của chúng bằng cách khâu mạch, hoặc xử lí pepsin để loại những vùng telopeptid

- Các phương pháp chế tạo scaffold không thể kiểm soát chính xác kích thước và hình dạng

lỗ, cũng như sự phân bố không gian của các lỗ và cấu trúc các kênh bên trong scaffold Dung môi còn dư đọng lại trong scaffold cũng là vấn đề quan trọng cần giải quyết vì nguy cơ độc tố và gây ung thư cao

- Các tế bào không thể phân bố đồng nhất trong khắp scaffold – hầu hết các tế bào không thể di cư vào bên trong sâu hơn 500µm Để khắc phục tình trạng này, nên cấy thêm tế bào vào scaffold trong suốt quá trình thiết kế để kiểm soát tốt hơn sự phân bố tế bào Tuy nhiên, điều này không thể thực hiện được với hầu hết các quy trình thiết kế scaffold vì có liên quan đến các hóa chất độc và nhiệt, làm tổn thương các tế bào sống

- Các tế bào lấp đầy các lỗ và bắt đầu tiết ECM của riêng chúng, lớp tế bào trên cùng tiêu thụ phần lớn oxy và dưỡng chất, làm hạn chế sự khuếch tán của các thành phần này, do đó làm giảm số tế bào tiên phong di cư sâu vào bên trong scaffold Cuối cùng, sự di cư của tế bào bị dừng lại do thiếu oxy và dưỡng chất cung cấp

- Ngay cả khi tế bào đã phân bố khắp scaffold quy mô lớn, vẫn cần cung cấp mạch máu để nuôi dưỡng các tế bào ở sâu bên trong scafflod Các mô mạch xung quanh có thể tăng trưởng vào trong một scaffold cấy ghép, nhưng phải mất thời gian cho quá trình phát triển mạch này, các tế bào

ở sâu bên trong có thể chết khi mạch phát triển tới nơi

V.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT TRONG BÌNH KHUẤY

Hầu hết việc nuôi cấy mô tiến hành trên quy mô nhỏ, cung cấp một lượng ít tế bào để tiến hành các thí nghiệm Việc nuôi tế bào động vật với quy mô lớn được bắt đầu thử nghiệm từ đầu những năm 1950 bằng cách dùng Jar Fermentor Khi nuôi cấy tế bào động vật ở quy mô lớn, cần chú ý một số đặc điểm không có lợi cho nuôi cấy quy mô lớn sau:

- Tế bào động vật khá lớn, khoảng 10 µm Tính bền cơ học đối với sự khuấy yếu

- Thời gian tăng sinh gấp đôi chậm, khoảng 1 ngày Nhạy cảm với ion kim loại

- Kém khả năng thích ứng với môi trường Cần huyết thanh và hormone

- Đa số tế bào động vật cần sống và phân chia trên một giá đỡ

Khi tăng lượng tế bào nuôi cấy, cần phải điều chỉnh hàng loạt các thông số và thiết bị cần thiết Chẳng hạn, một số vấn đề cần lưu ý như chất dinh dưỡng, sự trao đổi khí (đặc biệt là oxy) và

24

việc loại bỏ các độc tố do chuyển hóa tạo ra (ammonia, lactic acid ) Để tối ưu hóa quá trình, thể tích nuôi chừng 1 lít là tốt nhất

Nuôi cấy tế bào động vật trong bình khuấy là bước tăng quy mô đầu tiên trong việc nuôi cấy

tế bào huyền phù tự nhiên, hay tế bào sau khi được thuần hóa, hoặc gắn tế bào với các vi vật mang

Tế bào được nuôi cấy huyền phù trong một bình nuôi, có bộ phận cánh khuấy hoạt động nhờ từ trường của nam châm Ngoài ra bình nuôi cấy này còn có hai nhánh ở hai bên, thuận lợi cho việc thêm tế bào, thay môi trường, hay cung cấp khí O2, hoặc không khí giàu CO2

V.4 NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PILOT VÀ SẢN XUẤT

Việc lựa chọn hệ thống và hình thức nuôi cấy phụ thuộc vào tốc độ phát triển và đặc điểm tạo sản phẩm của các dòng tế bào

* Hệ thống nuôi cấy: thường sử dụng là hollor-fibre (sợi rỗng) và ceramic matrix modules

(các đơn vị chất nền ceramic), bioreacter khuấy và fermentors

Tế bào có thể được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy không đồng nhất hay đồng nhất:

- Hệ thống nuôi cấy không đồng nhất: tế bào được cố định trong phòng tăng sinh Hầu hết

các hệ thống có phòng tăng sinh với các hollow fibre, hay chất nền ceramic xốp

- H ệ thống nuôi cấy đồng nhất: tế bào được nuôi trong bioreacter với khuấy cơ học, hay sục

khí để giữ chúng ở trạng thái huyền phù

* Hình thức nuôi cấy gồm: batch (theo mẻ), fed-batch (theo mẻ có cung cấp thêm tế bào),

chemostat (nuôi cấy liên tục) và perfusion (chảy tràn) Batch và fed-batch được dùng phổ biến nhất Hình thức chemostat và perfusion thì đòi hỏi thao tác, hóa chất nhiều hơn vì nó cho phép tạo MAbs liên tục Tất cả các phương pháp nói trên đều có thể áp dụng được với hệ thống nuôi cấy đồng nhất

và không đồng nhất, trừ chemostat

VI MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN

VI.1 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG

Kỹ thuật vô trùng được thiết lập để diệt (lập hàng rào vô trùng) một phổ rộng các vi sinh vật (động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus ) Tùy theo từng đối tượng vi sinh vật, đặc biệt là khả năng để kháng của chúng, để có phương pháp khử trùng đạt hiểu quả tối đa Các phương pháp khử trùng thường được dùng là:

- Sử dụng autoclave để tạo nước ở nhiệt độ 1210C (dạng hơi nước dưới điều kiện áp suất)

- Chiếu xạ: chiếu tia UV (Ultraviolet light), tia Gamma (Gamma ray)

- Vô trùng bằng hóa chất: alcohol (loại 70%), khí formaldehyde

- Vô trùng bằng lọc: sử dụng các bộ lọc vi khuẩn và nấm, bộ lọc virus, máy lọc HEPA (High efficiency particulate air)

VI.2 QUAN SÁT TẾ BÀO

- Quan sát trực tiếp bằng mắt, trên các đĩa nuôi để nhận biết sự thay đổi của các yếu tố môi trường nuôi: độ pH (dựa vào màu sắc của môi trường nhờ bổ sung chất chỉ thị màu pH), nồng độ

CO2 (do tủ nuôi báo), độ đục của môi trường (gây nên bởi vi sinh vật nhiễm hoặc các mảnh vỡ của

tế bào chết)

- Quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá về hình dạng, số lượng tế bào

25

VI.3 KIỂM SOÁT NHIỄM

Các vi sinh vật nhiễm thường được nhận biết khá dễ dàng vì thông qua những quan sát bằng mắt hoặc quan sát dưới kính hiển vi Những đĩa nuôi có độ acid bất thường hay có vẻ đục hay có các quả cầu, các dây cần được quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện kịp thời tác nhân nhiễm Nếu sau khi kiểm tra khẳng định mẫu bị nhiễm, cần cách li các đĩa nuôi đó và khử trùng, đồng thời sát trùng kính hiển vi, vị trí đặt đĩa nuôi, tay và các dụng cụ khác

Sự nhiễm virus thường rất khó và tốn kém để phát hiện Và khó phát hiện nhất là kiểu nhiễm dòng tế bào này với một dòng tế bào khác (gọi là sự nhiễm chéo – cross contaminated cell lines)– chúng có thể xảy ra nhiều năm mà không được phát hiện

Ngăn ngừa nhiễm là điều cần thiết, đòi hỏi sự căn bằng giữa việc duy trì môi trường vô trùng trong phòng nuôi cấy và thiết bị, thời gian và chi phí liên quan

Cách tốt nhất để loại bỏ sự nhiễm trong nuôi cấy là bỏ đi các đĩa, vật dụng đã nhiễm Thậm chí, khi cần thiết sẵn sàng hủy bỏ cả các mẫu thí nghiệm

VI.4 ĐÔNG LẠNH

Kỹ thuật đông lạnh nhằm giữ tế bào trong nitơ lỏng ở nhiều năm với khả năng sống sót cao

là thuận lợi của các nghiên cứu in vitro Ngân hàng tế bào đông lạnh sẽ cung cấp thường kì các

dòng tế bào chuẩn, chúng được giải đông và sau đó nuôi cấy thứ cấp Khi thiết lập dòng tế bào, chúng có thể được bảo quản đông lạnh sau 3 – 5 lần cấy chuyền Đối với các tế bào người bình

thường, thời gian sống in vitro có giới hạn, do vậy, đông lạnh là cách duy nhất để sử dụng dòng tế

bào này trongnhiều thí nghiệm khác nhau

Vấn đề đặt ra là khi các tế bào qua đông lạnh và giải đông, nếu hầu hết bị chết, quần thể tế bào không thể được đông lạnh trở lại như quy trình đã tiến hành Quá trình đ6ong lạnh và giải đông

có thể thay đổi kiểu nhân tế bào, đặc biệt là các tế bào chuột Do đó, đông lạnh vẫn có thể tạo ra dị hợp trong tế bào đối với một số trường hợp

Nếu các tế bào được giữ trong nitơ lỏng, phải cẩn thận bởi đây là cơ hội nhiễm, nhất là nhiễm chéo, hoặc sự lan rộng các tác nhân nhiễm như mycoplasma Cuối cùng, người ta nhận thấy rằng các tế bào lưu trữ lại (-1800C) thường giảm sức sống

VII ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

- Nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh

- Sản xuất các hợp chất sinh học như interferon, vaccine virus, các protein (các nhân tố đông máu và hoạt hóa plasminogene…), enzyme (Rtase…)…

- Tạo nguồn mô – tế bào động vật làm vật liệu cấy ghép: ghép tế bào tụy tạng tạo ra insulin của heo vào người, ghép tế bào thần kinh từ thai giúp phục hồi chức năng não hay chức năng vận động, tạo mạch máu từ nuôi cấy tế bào động mạch chủ của bò… Sự phát triển xa hơn của kỹ thuật này trong y học là việc tạo nguồn tế bào – mô để thực hiện ghép tự thân: lấy tế bào/mô từ cơ thể

bệnh nhân để nuôi cấy in vitro, cho biệt hóa để thu được tế bào/mô ghép lại cho chính bệnh nhân

đó, phục hồi các mô tổn thương Triển vọng lớn nhất trong lĩnh vực này là sử dụng các tế bào gốc phôi thai

- Sản xuất các virus diệt côn trùng bằng cách nuôi cấy các tế bào côn trùng và cho nhiễm virus, sau đó thu chế phẩm

26

CHƯƠNG 2 CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN

I GIỚI THIỆU

Khái niệm: Hỗ trợ sinh sản là một quy trình nhằm tạo ra cá thể mới với nhiều kỹ thuật hỗ

tr ợ phù hợp cho từng giai đoạn trong tiến trình sinh sản Công nghệ này không chỉ là một liệu pháp

điều trị vô sinh/hiếm muộn ở người mà còn là phương tiện hữu ích, nền tảng để tiến hành các nghiên cứu khác ở người và động vật như chuyển gen, chẩn đoán sớm, bảo tồn động vật, nhân bản, thu tế bào gốc

Năm 1763, Jacobi đã thực hiện các kỹ thuật thụ tinh nhân tạo cho chó và cá Năm 1780, bác

sĩ thú ý người Italia, Spallanzani, đã nghiên cứu tinh dịch và nhận thấy rằng khi để tinh dịch ở nhiệt

độ thấp, tinh trùng sống lâu hơn

Cuối thế kỉ 19, nhiều tài liệu trình bày phương pháp thụ tinh nhân tạo cho chó, ngựa và bò một cách khá chi tiết Tuy nhiên, phạm vi các nghiên cứu nói trên còn hẹp, do sự hạn chế các kiến thức sinh học thời bấy giờ

Thụ tinh nhân tạo cho gia súc được nghiên cứu có hệ thống từ đầu thế kỷ XX

Năm 1959, con thỏ đầu tiên được ra đời từ phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm

Thụ tinh trong ống nghiệm trên người được Petrucci đề cập đến năm 1961 nhưng bị Tòa thánh Vatican phản đối kịch liệt Năm 1962, công trình này được tiếp tục bởi Edward và Steptoe

Vào năm 1971, Steptoe đã bắt đầu thực hiện hút 149 trứng (từ nhiều phụ nữ hiến tặng) qua nội soi ổ bụng và nuôi được 112 tế bào đến giai đoạn phôi nang, tuy nhiên không thể tiến hành cấy truyền Có một trường hợp báo cáo cấy thành công, phôi có hiện tượng làm tổ, nhưng rất tiếc, thai lại nằm ngoài tử cung

Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh Năm 1973, đến lượt con bê đầu tiên ra đời cũng bằng phôi đông lạnh

Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử phát triển của nhân loại, một bé gái (Louise Brown) ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh Năm

1982, bé gái thứ hai (Amadine) ra đời bằng công nghệ này ở Pháp

Trong những năm 80 của thế kỉ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh Singapore được ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên ở Châu Á vào năm 1983 bởi nhóm nghiên cứu của SC Ng và cs

Năm 1984, một phôi đông lạnh được rã đông để cấy vào tử cung, phát triển và cho ra đời bé trai đầu tiên, đặt tên là Zoe Năm 1993, trong khi nghiên cứu một ca lâm sàng ở Bỉ, Gianpiero D Palermo đã đưa ra kỹ thuật bơm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI)

Năm 2005, phác đồ mới trong kỹ thuật trữ trứng đã cải thiện đáng kể tỷ lệ thụ tinh Nhiều

em bé đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng đông lạnh ra đời thành công tại Ý

Nội dung của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, về cơ bản có thể được xếp thành các nhóm sau:

- Kỹ thuật thu nhận giao tử

- Kỹ thuật hỗ trợ thụ tinh

- Nuôi phôi

27

- Kỹ thuật chuyển phôi (cấy truyền)

Và một số kỹ thuật liên quan khác

II KỸ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ

II.1 CHUẨN BỊ TRỨNG

II.1.1 Cho trứng (oocyte donation)

Ở người, người cho trứng được kích thích buồng trứng bằng các hormone gây chín rụng nhiều trứng hoặc được chọt hút qua siêu âm đầu dò âm đạo Người cho trứng thường không quá 35 tuổi, có sức khỏe tốt, tâm sinh lý và quan hệ xã hội bình thường và nhất thiết phải trải qua các kiểm tra y học, nội tiết và sản khoa nghiêm ngặt Nếu người cho trứng đã từng có ít nhất là một con bình thường thì càng tốt

Ở động vật, thu nhận nguồn trứng (và tinh trùng) của những giống khác nhau cùng loài, nhằm thụ tinh trong ống nghiệm được xem là một phương pháp lai tạo hiệu quả Cho các giao tử ở vật nuôi không mang ý nghĩa hỗ trợ sinh sản mà đơn thuần chỉ là tính chất cải thiện giống, phục vụ chăn nuôi hay bảo tồn loài

Những năm gần đây, kỹ thuật cho noãn tương (ooplasmic donation – chỉ lấy dịch bào tương

hay dịch túi mầm thay vì thu nhận tế bào trứng) và chuyển túi mầm được tiến hành như là một phương thức nhằm cải thiện hiệu quả của hỗ trợ sinh sản Ở đây, khi tiêm một lượng nhỏ noãn tương của tế bào trứng bình thường vào trứng nhận thì có thể sẽ giúp hồi phục lại những đặc tính

mà ở trứng nhận khiếm khuyết Ty thể (tồn tại trong noãn tương, giữ chức năng hô hấp) là thành phần cơ bản có ảnh hưởng quan trọng tới hoạt động sinh lý bình thường của trứng Tuy nhiên, sự tồn tại của noãn tương ngoại lai trong tế bào chủ (dị ty thể) có thể gây ra những đối kháng với bộ gen của bố và mẹ nằm trong nhân Sự không tương thích giữa ty thể và bộ gen có thể sẽ gây ra những khiếm khuyết trong sự biểu hiện của gen và sự phát triển, thậm chí chúng có thể được di truyền và biểu hiện ở nhiều thế hệ tiếp theo

II.1.2 Gây rụng trứng nhiều (superovulation)

Gây rụng trứng nhiều (còn gọi là gây siêu bào noãn) là phương pháp kích thích sự chín và

rụng trứng hàng loạt bằng các hormone nhằm thu được nhiều trứng chín một lúc Điều này có thể nhằm hai mục đích: thu nguồn trứng và cho thụ tinh tự nhiên để thu nhận nguồn phôi (trong ống dẫn trứng) sau đó

Nhiều thí nghiệm cho thấy nhóm hormone gonadotropin (PMSG_Pregnant mare’s serum gonatropin) (huyết thanh ngựa chửa) có tác dụng gây chín trứng nhanh, giống như FSH Tương tự, hCG (human chorionic gonatropin) cũng tác động gây rụng trứng như LH (Luteinizing hormone)

Do vậy, để gây rụng trứng nhiều, có thể sử dụng PMSG và FSH (được tách chiết từ tuyến yên của cừu, hoặc heo) kết hợp chung với hormone hCG FSH kích thích phát triển một loạt các nang noãn, điều này thích hợp cho việc thụ tinh in vitro Trong một số trường hợp, chỉ cần tạo ra một vài hay một nang noãn phát triển giống tự nhiên

Liều dùng của các hormone nói trên tùy thuộc vào từng loài, tuổi và trọng lượng con vật; cũng như phụ thuộc vào loại thuốc, thời gian tiêm Ở một số loài như chuột, hiệu quả kích thích rụng trứng còn phụ thuộc vào chu kỳ sáng tối

28

Bảng 2.1 Quy trình gây siêu bài noãn ở một số vật nuôi (E Hafez, 1987)

Động vật Ngày của chu

kỳ động dục

Hormone rụng trứng hCG (IU)

1500-3000 1000-2000 1000-2000 750-1500

20-50 12-20 12-20 10-20

1500-2000 1000-1500 1000-1500 500-1000

Tác động bất lợi nhất của việc kích thích buồng trứng bằng hormone là có thể xuất hiện hội

ch ứng quá mẫn của buồng trứng (Ovarian hiperstimlation syndrome – OHSS) và trường hợp chửa

đa thai Về mặt lâm sàng, hội chứng này nếu nhẹ, hay trung bình không quan trọng, nhưng biểu

hiện nặng có thể đe dọa tính mạng Tuy nguyên nhân chưa rõ ràng, nhưng hội chứng có một số biểu hiện:

- Nhẹ: tăng hàm lượng estrogen, buồng trứng to lên chứa các nang nhỏ

- Trung bình: ngoài các biểu hiện trên còn xuất hiện tiêu chảy, nôn ói

- Nặng: kích thước nang lớn làm buồng trứng to, độ thấm quanh mao mạch tăng làm thoát dịch gây tích nước cổ trướng trong ổ bụng và tràn dịch màng phổi, gây khó thở

II.1.3 Thu nhận trứng

Có thể thu nhận trứng động vật bằng nhiều cách:

- Thu trứng từ ống dẫn trứng sau khi rụng: phẫu thuật để lộ ống dẫn trứng, sử dụng ống thông bơm dung dịch PBS gội rửa lòng ống vài lần, tìm trứng trong dung dịch rửa và phân loại Phương pháp này thường sử dụng cho động vật thí nghiệm vì thu được trứng có tỷ lệ chín cao Tuy nhiên, việc xác định thời điểm trứng chín và rụng khó khăn, do vậy, để chủ động thường phải gây rụng trứng nhiều bằng kích dục tố

- Thu trứng từ nang trứng của buồng trứng: bằng kỹ thuật nội soi – siêu âm, sử dụng một kim dài xuyên qua thành âm đạo, tìm nang trứng chín để chọc hút cho phép thu nhận tế bào trứng Phương pháp này cho phép khai thác trứng nhiều lần, hiện được sử dụng rộng rãi ở người và các gia súc lớn, nhưng động vật quý hiếm Ngoài ra, cũng có thể tiến hành nội soi qua thành bụng, cũng như giải phẫu để lộ buồng trứng giống như cách thu trứng ở ống dẫn trứng

- Thu trứng từ nang trứng của buồng trứng ở những động vật đã bị giết mổ Trong phương pháp này, buồng trứng phải được thu ngay sau khi mổ, càng sớm càng tốt, sau đó tiến hành khử trùng, bảo quản trong môi trường thích hợp và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm

Việc thu nhận trứng từ buồng trứng liên quan tới một số thủ pháp kỹ thuật khác:

- Phương pháp chọc-hút (follicle puncturing): sử dụng kim tiêm 18 G và syringe 5 ml chọc

vào nang trứng rồi hút trứng

- Phương pháp rạch-múc (follicle dissection): dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng để múc

dịch có chứa trứng

- Phương pháp cắt nghiền buồng trứng (ovary slicing): buồng trứng được cắt nhỏ bằng kéo

và lọc lấy tế bào trứng

Hormone phát triển trứng PMSG (IU) FSH (mg)

Ở các phương pháp nêu trên, hầu hết trứng thu nhận được còn non, vì vậy, chúng cần phải

được nuôi chín, mặc dù các trứng nuôi chín in vitro thường có hiệu quả thụ tinh không cao Ở

người, sau khi kích thích gây rụng có thể thu nhận trứng bằng một trong ba phương pháp (tùy trạng

thái bệnh nhân, điều kiện bệnh viện): soi ổ bụng (laparoscopic), siêu âm cục bộ buồng trứng

(ultrasound) và gội rửa nang trứng (follicular flushing)

II.1.4 Quan sát và phân loại trứng

Sử dụng kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại x6-12 để kiểm tra dịch và x25-50 để quan sát

tế bào trứng Trứng chưa trưởng thành sẽ tối và khó quan sát, nhưng với trứng trưởng thành, cũng

khó để nhận ra chúng vì lớp tế bào cumulus sẽ làm trứng trở nên mờ nhạt

Trứng thường được quan sát với chất lượng khác nhau thông qua sự hiện diện của lớp tế bào

cumulus Nếu phát hiện một phức hợp trứng/cumulus (oocyte/cumulus –OCC) thì việc đánh giá

trạng thái của trứng thường dựa vào thể tích, đ6ọ đậm đặc và sự hiện diện về số lượng, hình thái

của toàn bộ khối OCC Nếu phát hiện trứng có một thể cực có thể cho rằng trứng đang ở giai đoạn

metaphase II (MII)

Hiện có hai kỹ thuật để đánh giá sự trưởng thành của trứng từ phức hợp OCC

- Kỹ thuật đánh giá gián tiếp thông qua các trứng còn gắn khối cumulus
cách đánh giá

này đơn giản nhưng thiếu chính xác

- Kỹ thuật đánh giá trực tiếp: có hai cách:

+ Làm dẹt phức hợp OCC bằng cách gây xung động mạnh đĩa nuôi dưới kính hiển vi rồi

đánh giá trứng dựa vào sự hiện diệm của túi mầm hay thể cực thứ nhất: nếu quan sát thấy túi mầm

(vùng chứa nhân), trứng được cho là đang ở giai đoạn túi mầm (GV); nếu túi nhân không còn hiện

diện trong trứng, trứng được cho là ở trạng thái vỡ túi mầm (GVBD); khi thể cực thứ nhất hiện

diện, trứng đã hoàn thành lần giảm phân đầu tiên và đang nghỉ ở metaphase – trứng đang ở trạng

thái MII

+ Phân tách khối cumulus bằng enzym, rửa trứng và đánh giá giống như khi trứng còn lớp

cumulus Thuận lợi của kỹ thuật này là trứng được đánh giá cẩn thận hơn, và thường sử dụng trong

Màng t ế bào

Vùng nhân

30

II.1.5 Nuôi trứng trưởng thành (in vitro maturation – IVM)

Một trứng được coi là chín khi đã trưởng thành cả về nhân và tế bào chất Chỉ những trứng chín mới sẵn sàng cho việc thụ tinh

Các trứng được lấy trực tiếp từ việc chọc hút nang thường chưa trưởng thành, do đó, sau khi thu nhận, trứng phải được nuôi chín (trưởng thành) trong môi trường có đệm HEPES, huyết thanh

và heparin Đầu tiên, trứng sau khi thu nhận được rửa bằng môi trường thu nhận (đã được làm ấm ở

370C), sau đó rửa bằng môi trường nuôi chín và đưa vào các giọt môi trường nuôi để nuôi chín

Môi trường nuôi chín trứng khác nhau giữa các loài, đồng thời khác nhau về mục đích sử dụng và đôi khi tùy thuộc vào các phòng thí nghiệm, gồm hai loại: môi trường đơn giản và môi trường phức tạp

Môi trường IVM thường được bổ sung hormone (FSH, LH/hCG, estradiol, prolactin…) nhằm tác động trực tiếp lên quá trình trưởng thành của trứng, cải thiện sự phát triển của ph6oi giai đoạn trước làm tố Nhân tố tăng trưởng cũng được bổ sung gồm IGF (vai trò gống insulin–like growth factor), EGF (nhân tố tăng trưởng biểu mô–epidermal growth factor) và TGF-L Chúng tác động lên sự phân bào, kích thích tổng hợp RNA và protein…

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến IVM, chẳng hạn nước sử dụng, độ thẩm thấu, nhiệt độ và khí, độ sáng của môi trường, dụng cụ nuôi cấy… Nhiệt độ thích hợp cho IVM trứng bò và trâu là 38–390C, nồng độ khí thích hợp là 5%CO2, 5%O2 và 90% N2

II.2 CHUẨN BỊ TINH TRÙNG

II.2.1 Thu nhận tinh dịch

Ở động vật, tinh trùng sử dụng trong thụ tinh in vitro có thể được khai thác từ tinh hoàn, phó tinh hoàn thông qua con đường phóng tinh hay thu nhận từ phẫu thuật trực tiếp

Một số phương pháp thường dùng để lấy tinh từ động vật:

- Sử dụng dòng điện nhẹ để kích thích

- Dùng tay xoa tuyến sinh dục qua trực tràng

- Dùng âm đạo giả

- Dùng tay

Trong đó phổ biến nhất là dùng âm đạo giả và dùng tay

Ở người, trong trường hợp tinh trùng bình thường, việc thu nhận được tiến hành bằng cách dùng tay kích thích phóng tinh

II.2.2 Đánh giá tinh dịch và tinh trùng

Đo thể tích tinh dịch thu được bằng syringe hay các pipette chia vạch, sau đó sử dụng phòng đếm hồng cầu (haemocytometer) để đánh giá mật độ tinh trùng, độ di động của tinh trùng cũng như các kiểu di động của tinh trùng Qua đó, lựa chọn phương pháp thích hợp để chuẩn bị mẫu cho các

kỹ thuật hỗ trợ

Thao tác dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x20 Khi đếm cần lưu ý: (1) sự hiện diện của các mảnh vỡ tế bào và những tế bào khác ngoài các tế bào tinh trùng (tế bào hồng cầu, bạch cầu), (2) sự

ngưng kết của các tế bào tinh trùng và kiểu ngưng kết

Hầu hết mẫu tinh bình thường đều có khả năng thụ tinh Không sử dụng các mẫu chứa lượng tinh trùng bất thường (hình dạng) cao bởi tiềm năng thụ tinh của chúng kém