Công nghệ sinh học đông lạnh

Trong quá trình đông lạnh, những tinhthể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độchất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động r

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

Đà nẵng, tháng 11 năm 2017.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

hầu hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra, tất cả các hoạt động bên trong tếbào đều ngừng lại Các phân tử nước lúc này tồn tại ở dạng kết hợp, tinh thể hoặcdạng kính Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bàođược trữ Theo cách này, tế bào và mô có thể hồi phục tới lúc nào con người cần sửdụng.

2 MỤC ĐÍCH

- Giảm thiểu biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền

- Ngăn ngừa sự lão hóa của tế bào

- Ngăn cản quá trình biệt hóa của tế bào

- Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào

- Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong invitro

- Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái

- Giảm chi phí nuôi cấy

- Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng

- Thuận lợi cho việc bảo tồn gen

- Thuận lợi cho việc vận chuyển

- Thuận lợi cho việc thương mại hóa

- Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng mộtlúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian, công sức

3 CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH

- Quá trình thu nhận và thao tác tế bào

- Quá trình làm lạnh

- Quá trình trữ lạnh

- Quá trình giải đông

- Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi nuôi cấy

4 CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH

4.1 Sự hình thành tinh thể nước đá

Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắtđầu của sự biến đổi giai đoạn Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tếbào bằng với độ hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lạiphụ thuộc vào nồng độ của chất hòa tan Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậmđặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra

ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào Trong quá trình đông lạnh, những tinhthể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độchất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ra ngoài tếbào và dung tích tế bào giảm Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào tốc độđông lạnh Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đánội bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bàocũng nhiều hơn Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm donồng độ của chất hòa tan nội bào tăng lên Người ta nhận thấy trong môi trườnghuyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự mất nước nội bào được duy trì sao cho

có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do đó sẽ gây tổn hại tế bào íthơn Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là hai yếu tố chủyếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào

Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đáđược tạo thành trong quá trình đông lạnh:

• Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn

• Tốc độ làm lạnh

• Thành phần các chất hòa tan trong dung dịch

• Nồng độ dung dịch

Hình 1: Sự hình thành tinh thể đá.

Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đáthường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150C Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ởnhiệt độ -100C Ở nhiệt độ -5 đến -100 C cần có điều kiện kết hợp Đó là sự thamgia của một phần nhỏ chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo) Sự tạo

đá càng tăng khi nhiệt độ càng giảm Ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả chất liệukhông còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh.Đây là hiệntượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa Hiện tượng này xảy ra domôi trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản đông lạnh có nhiệt độ đông

đá thấp hơn bình thường Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sátbên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bàoquan

Hình 2: Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh.

Sự tăng thêm nồng độ của các chất hòa tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởngđến việc hình thành những tinh thể đá Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượngnước ở thể lỏng giảm đi Do đó, nồng độ các chất hòa tan tăng lên gây mất cânbằng về áp suất thẩm thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thươngmàng tế bào

Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá.Phân tử nước khi chuyển từ thẻ lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra 1 nhiệt lượng Nếunhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thayđổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0 C Thay đổi này ảnh hưởng⁰đến chức năng của tế bào sau khi giải đông.

4.2 Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh

Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp

có trong nước Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinhhóa xảy ra ở nhiệt độ -20 C đến -30 C Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti Vì vậy,⁰ ⁰trước khi đạt đến điểm này NaCl vẫn ở dạng dung dịch Số lượng phân tử nước có

ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩmthấu của môi trường, môi trường trở nên ưu trương

Hình 3: Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm

đông hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên

Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 00C làm giảm sự khuếch tán một chiều của proteinmàng Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất

là trong quá trình đông lạnh chậm Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự cothể tích trong quá trình mất nước Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các iontăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình đônglạnh khi nhiệt độ giảm hoặc khi pha loãng môi trường trong quá trình giải đông.4.3 Tốc độ khử nước

Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố Các yếu tố này thay đổikhác nhau tùy theo từng loài tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việcxác định quá trình bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất Các yếu tố liên quan làtính thẩm thấu nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấmnước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/ thể tích của tế bào (SA/V)

Bằng cách đo tỷ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độthẩm thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp) Diệntích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) cànglớn Đối với hầu hết các tế bào của động vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp)

có giá trị khoảng 0.43 m3/m2.phút.atmosphere Tuy nhiên đối với hồng cầu và tinhtrùng thì tính thấm của màng tế bào (Lp) lớn hơn nhiều Điều này có nghĩa là hồng

cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độbảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này là rất quan trọng.

Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa chotính thấm nước (dH*) Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấmnước Trước đây, bằng cách đo tính thấu của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khácnhau để xác định được dH* đối với trứng Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độtrên điểm đông lạnh Kết quả đo được là 14.5 Kcal/mol Giá trị này tương đối cao

và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10% thì tốc độ khử nước sẽ giảm một nửa

Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối vớitốc độ khử nước của tế bào Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn

Hình 4: Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào

nhiệt độ

4.4 Thể tích của tế bào

Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước Quátrình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạthóa tính thấm nước (dH*) của tế bào Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làmlạnh Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở cáctốc độ làm lạnh khác nhau Ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều,

và thể tích tế bào không bị giảm nhiều như ở tốc độ làm lạnh thấp Tốc độ làm lạnhthấp sẽ làm cho tế bào mất nước Tuy nhiên, thể tích giảm thực sự ít hơn so với

tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối với năng lượnghoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ ở trên điểm đông lạnh).4.5 Hoạt động của Enzyme

Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 370C xuống còn 70C, hoạt động củaEnzyme giảm 8 lần Tốc độ phản ứng Enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóacủa các phân tử phẩn ứng Từ 200C, tốc độ phản ứng Enzyme giảm theo nhiệt độmột cách ổn định theo trình tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 100C (Q10) Tuy nhiên,trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng Enzyme(ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt độngcủa các protein Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề phòng sự biến đổi này.4.6 Sự tủa muối và pH của dung dịch

Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cânbằng acid-base của môi trường biển đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa củacác hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (saltingout) Các chất bảo quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid-base của dungdịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, esterhoạt động như base mạnh (DMSO chẳng hạn) Sự biến đổi độ pH của dung dịchtheo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản được sử dụng: với nồng độDMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS tăng nhanh, nhưnglại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%) độ pHcủa dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sựthay đổi nổi bật Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bàophụ thuộc vào nhiệt độ Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ởnhiệt độ xấp xỉ 0 C với pH trên 9.⁰

4.7 Sự hình thành bọt khí

Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá Hơn nữa, tinhthể nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng

của đá thấp hơn tỉ trọng của nước) Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giảiđông tế bào Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác độngcủa sự hình thành đá Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ lệnghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh.

Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dung

CO2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường Khi làm lạnh, các khí nàykhông còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại

tế bào Trong quá trình giải đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành khôngbào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to Trong thực tế, bọt khí hình thành rấtnhanh, dẫn đến vỡ tế bào

Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứabicarbonate Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn

5 Thuyết hai yếu tố

Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tếbào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về nhữngtổn thương khi đông lạnh tế bào Hai yếu tố này đã đặt nên tảng cơ sở cho hai cơchế khác nhau, và có thể chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hạicho tế bào, trong suốt quá trình tiến hành đông lạnh và lưu giữ

BẢNG 1: Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong

tiến trình đông lạnh

- Giải trùng hợp bộ xương tế bào

Tăng nồng độ chất hòa tan - Co thẩm thấu

Tăng nồng độ ion - Tác động trực tiếp lên màng tế bào,

làm hòa tan protein màng

Kết tủa muối - Làm thay đổi pH dung dịch, ảnh

hưởng đến hoạt động của các protein

Sự hình thành bọt khí - Tổn thương cơ học đối với màng và bộ

xương tế bào.

Dung dịch trở nên quá nhớt - Làm hạn chế quá trình khuếch tán và

thẩm thấu

(1) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra donhững tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự mấtnước của tế bào nhanh đột ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá trongkhoảng không ngoại bào)

(2) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do hìnhthành đá nội bào gây chết Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của tếbào phải đủ thấp để tránh sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ cao

để giảm đến mức tối thiểu những tác động của dung dịch

Hình 5: Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào

Hình 5 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ mộtcách cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại Những giátrị tốt nhất cho tất cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích tronggiới hạn của sự cân bằng giữa tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào

Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nóitrên như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trongsuốt quá trình làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽkhác nhau tuỳ vào từng loại tế bào Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này,còn có những cơ chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gâynên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào chết theo chương trình(apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra sự tổnthương tế bào Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúnghơn là chúng tập hợp vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chínhtại các vị trí này, tế bào được cô lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nêncác stress cho tế bào Đó là sự phản ứng tự nhiên của tế bào đối với các tác nhânnày để chúng có thể sống sót và tồn tại Tế bào phải chịu tác động của những tácnhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt quá trình đông lạnh Tuy nhiên, cácphản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính quyết định đầu tiên cho

sự tồn tại của tế bào Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ gặp phải sự mấttính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh Sứcchịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộcvào khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress Sứcchống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làmlạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cảnhững phần nước đóng băng bị loại thải Dưới những điều kiện này, tế bào co lại

và sự tổn thương màng sẽ giảm đến mức tối thiểu Những hiện tượng này xảy rakhi tốc độ làm lạnh được cho là tốt nhất

- Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút trong giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C).

- Hạ nhiệt tự động

- Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh

- Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước chuyển sang dạng đá

- Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào do tác động của nồng độ chấttan

 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

- Nhược điểm:

Tỷ lệ phôi sống không cao, mất nhiều thời gian, cần sử dụng máy khi trữ lạnh,

sử dụng nhiều nitơ, chương trình không ổn định Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trìnhmất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá Do đó,thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt

độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh Để có thể đảm bảođược tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệthống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao,chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm Khó khăn cơ bản là phải cóđược phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giaiđoạn phôi nang (blastocyst)

- Ưu điểm: Do sử dụng chất bảo quản ở nồng độ thấp nên ít gây tổn thương vềcấu trúc tế bào

6.2 Đông lạnh nhanh ba bước (Stepwise freezing method)