Các kỹ thuật phân tích chuẩn đoán compatibility mode

31/10/2011 8:58 SA 1 Nguyễn Hữu TríCác kỹ thuật phân tích trong Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology Nguyên tắc của phương pháp sắc ký Sự phân tách các

31/10/2011 8:58 SA 1 Nguyễn Hữu Trí

Các kỹ thuật phân tích trong Cơng

nghệ Sinh học Thực phẩm

Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký

Sự phân tách các chất tan dựa vào ái lực tương đối của: chất tan đối

với pha di động và chất tan đối với thể nền.

Một chất tan cĩ ái lực đối với pha di động lớn hơn so với ái lực với

thể nền sẽ cĩ xu hướng di chuyển cùng pha so với pha di động.

Trong một dung dịch cĩ n chất tan, chất nào cĩ ái lực với pha di động

lớn nhất sẽ cĩ thời gian lưu nhỏ nhất, sẽ ra khỏi cột sắc khí sớm

nhất.

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký

Các phương pháp sắc ký

Sắc ký hấp thục (Adsorption chromatography)

Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography)

Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)

Sắc ký ái lực (Affinity chromatography)

Sắc ký đảo pha (Reverse phase chromatography)

Sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography)

Kỹ thuật sắc ký

•Mẫu (sample): cần được lọc trước khi chạy sắc ký.

•Buffer: lọc nhằm loại bỏ tạp nhiễm trước khi sử dụng.

•Pha động (mobile phase): Dung mơi bơm từ reservoir vào cột (column) sắc ký Nhiều hơn một reserovoir, pha động được bơm vào Mixer (máy trộn) trước khi vào cột.

•Pha tĩnh (stationary phase): Được giữ lại trong cột bởi mơt miếng bơng thủy tinh ở đáy cột.

•Các phân tử sinh học được tách ra tại cột sắc ký.

•Trong HPLC, Guard column được sử dụng nhằm bảo vệ cột sắc ký.

•Detector: UV bước sĩng 280 nm detect hầu hết protein

•UV 205 – 220 detect cả những protein hay peptide ít cấu

tử cĩ mạch vịng.

31/10/2011 8:58 SA 7 Nguyễn Hữu Trí

Sắc ký lỏng (liquid chromatography)

Thành phần cơ bản

• Partition coefficient:

Cs: nồng độ mẫu trong pha tĩnh (Stationary phase) Cm: nồng độ mẫu trong pha động (Mobile phase)

Sắc ký lỏng

Thơng số trong sắc ký lỏng

• Retention time (tR): thời gian phân tử sinh học ra

khỏi cột sắc ký tính từ lúc nạp mẫu.

• retention volume(VR):

• Rf

Thơng số trong sắc ký lỏng

• Resolution (R): Thơng số dùng đánh giá mức độ tách các phân tử sinh học trong mẫu.

• W: độ rộng của đáy beat.

31/10/2011 8:58 SA 13 Nguyễn Hữu Trí

Pha tĩnh (stationary phase)

Tách rửa khỏi cột (elution)

•Mobile phase: đường chấm, cĩ pH, lực liên kết ion, tính phân cực thay đổi theo dãy Giảm hệ số K.

•Mỗi phân tử sinh học trong mẫu cĩ khả năng ái lực riêng đối với pha tĩnh.

Open column chromatography

(low performance liquid chromatography)

• Sử dụng áp suất khí quyển, độ phân tách thấp

• Đường kính của các hạt trong pha tĩnh tương đối lớn.

• Cột sử dụng các vật liệu rẻ tiền Vd: plastic.

-Độ phân tách thấp.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography

– HPLC)

• Phase động được bơm vào hệ thông với tốc độ dòng

chảy cao (high flow rate) bởi áp suất cao (55 Mpa).

• Đường kính các hạt trong pha tĩnh nhỏ, chứa lỗ nhỏ li

ti giúp các phân tử sinh học đi vào, và đặc biệt chịu được áp suất cao (các hạt phải rắn hơn các hạt được dùng trong open column chromatography)

• Việc tách rửa tốt khi tốc độ pha động ổn định.

• Trong HPLC, pha động thường là hỗn hỡp của hai

thanh phần hoặc nhiều hơn -> mixer.

• Đường ống và cột sắc ký được làm bằng thép không

rĩ.

• Dung môi phải được khử khí và lọc trước khi sử dụng.

• Size exclusion chromatography hay gel filtration

• Phân tử sinh học được giữ trong pha dung mơi suốt quá trình sắc ký.

• Tách lọc các phân tử sinh học dựa trên kích thước và hình dáng.

31/10/2011 8:58 SA 19 Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA 20 Nguyễn Hữu Trí

Sắc ký lọc gel (gel filtration)

• Protein nhỏ vào các hạt bead

và được giữ lại.

• Cột thủy tinh

• Các hạt gel polysaccharide.

• Các protein lớn bị lọai ra khỏi hạt và ra khỏi cột sắc ký trước protein nhỏ hơn.

Sắc ký lọc gel (gel filtration)

• Pha tĩnh gồm các hạt gel

khơng nhỏ (xốp).

• Protein càng nhỏ, càng

dễ vào hạt gel và được

giữ lâu hơn.

• Protein tách rửa khỏi cột

theo thứ tự khối lượng

phân tử giảm dần.

Sắc ký lọc gel (gel filtration)

• Ứng dụng:

• Xác định khối lượng phân tử

• Loại bỏ các phân tử cĩ kích thước nhỏ khơng cần thiết Vd: Loại bỏ muối khỏi dung dịch protein trước khi thực hiện sắc ký trao đổi ion.

• Tinh sạch protein

Sắc ký hấp phụ

•Trong sắc ký hấp phụ, chất tan

và pha động cùng tranh nhau vị

trí gắn trên pha tĩnh.

•Pha tĩnh cĩ cấu trúc mở giúp

protein dễ dàng thâm nhập vào

các hạt tiến về vị trí gắn kết

(binding site)

•Tùy vào kiểu liên kết giữa

protein và pha tĩnh:

– Sắc ký trao đổi ion

– Sắc ký ái lực

– Sắc ký kỵ nước

– Sắc ký ngược pha

Sắc ký trao đổi ion

31/10/2011 8:58 SA 25 Nguyễn Hữu Trí

• Protein thay thế counterion

Na+, Cl− gắn vào pha tĩnh

bằng lực hút tĩnh điện.

• Khi đĩ Na+, Cl- được gọi là

Ion exchange group hay

ion Exchanger.

• Sự gắn kết hồn tồn->

trung hịa điện

Sắc ký trao đổi ion

Điện tích trên protein thay đổi theo

pH mơi trường

• Điện tích protein do điện tích các mạch nhánh (R side chain)

cấu tử ở mơi trường pH nhất định quyết định.

• Tại pH acid, hầu hết Protein tích điện dương và ngược lại.

• Cĩ 2 loại ion exchanger:

• Cation exchanger: cĩ khả năng gắn kết ion dương

• Anion exchanger: cĩ khả năng gắn kết ion âm

• Mạch nhánh tích điện gắn vào: cellulose, Agarose, dextran, hay silica (HPLC)

31/10/2011 8:58 SA 31 Nguyễn Hữu Trí

Một số ion exchanger thông dụng

Tách rửa

• Gradient nồng độ NaCl và KCl được dùng để tách rửa protein ra khỏi cột sắc ký (Cũng cĩ thể dùng gradient pH của buffer)

Sắc ký kỵ nước (hydrophobic chro.)

• Non – polar side chain: Ala,

• Val, leu, Ile, Trp, Met, Phe,

Pro Thường tâp trung tại lõi

protein.

• Cĩ thể tìm thấy trên bề mặt

protein các protein khác

nhau cĩ tính kỵ nước bề

mặt khác nhau.

•  cơ sở của sắc ký kỵ

nước.

Các loại ligand

31/10/2011 8:58 SA 37 Nguyễn Hữu Trí

Tách rửa

• Protein được nạp vào cột sắc ký chứa nhóm octyl

và phenyl với sự hiện diện 2M (NH 4 ) 2 SO 4

• Tách rửa: dùng gradient nồng độ giảm dần (2M – 0)

(NH 4 ) 2 SO 4

Normal phase chromatography

• Pha tĩnh: phân cực.

• Pha động: gradient nông

độ dung moi phân cực tăng dần.

• Protein phân cực hơn sẽ

ra khỏi cột sau và ngược lại.

Sắc ký ngược pha

Sắc ký ngược phase (reversse

phase chro.)

• Pha tĩnh: các nhánh hydrocarbon (4,

C-8, C-18) được gắn lên pha tĩnh.

• Mẫu được cho vào dung môi phân cực như: nước, methanol, acetronitrile…hoặc hỗn hợp.

• Proteins sẽ gắn vào pha tĩnh theo tương tác kỵ nước theo các mức độ khạc nhau.

• Tách rửa: sử dung gradient nồng độ tăng dần acetonitrile và gradient nồng độ nước giảm dần -> sự tăng dần của tính kỵ nước trong pha động

Sắc ký ái lực (affinity chro.)

• Enzyme nhận biết và

gắn với cơ chất là một

dạng ái lực.

• -> lý thuyết xây dựng

sắc ký ái lực.

• Pha tĩnh: Affinity

ligand được cố trên

pha tĩnh.

Sắc ký ái lực (affinity chro.)

31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí

Một số ví dụ sắc ký ái lực

• Antigen ligand -antibody

• Protein A được cố định trên pha tĩnh.

• IgG (immunoglobulin)sẽ gắn với protein A tại vùng Fc: nồng độ muối cao, Ph cao.

• Tách rửa: pH 2-4; IgG 1; IgG 2a; IgG 2b… được phân tách ra khỏi cột dựa vào sự khác nhau của vùng Fc.

Qui trình ELISA

Modified from Specter, S C., R L Hodinka and S A Young Clinical Virology Manual, Third Edition ASM Press, 2000. 31/10/2011 8:58 SA 48 © Hank Morgan/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.Nguyễn Hữu Trí

Figure 5.20: HIV ELISA test.

31/10/2011 8:58 SA 49 Nguyễn Hữu Trí

Mẫu xét nghiệm

E E

30 phút, T thường

Cơ chất

Cộng hợp

Ủ ở 37 °C

R Ử A

R

Ử

A

Ủ ở 37 °C

Kỹ thuật ELISA gián tiếp

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

30phút/ 37 °C

Mẫu XN

KN gắn trên giếng

+

R Ử A 3 X

R Ử A

30phút/ 37 °C 30phút/ T o phịng

Ngưng phản ứng.

Đọc kết quả 450nm

E Cộng hợp

+

Kỹ thuật ELISA SANDWICH

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

M ẫu xét nghiệm

E E

30 phút, T th ường

C ơ chất

Cộng hợp

Ủ ở 37 °C

R Ử A

Kỹ thuật ELISA cạnh tranh

Phản ứng màu tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng thể

KN & KT Mẫu XN

Bước 1: Ủ 60 phút/ 37 °C

+

R Ử A 3 X

R Ử A 5

Bước 2 : 30 phút/ T o phịng 30phút/ T o phịng

+

Y E E

?

Kỹ thuật ELISA phát hiện đồng thời Kháng nguyên và Kháng thể

Tách chiết nucleic acid

- định tính và định lượng cơ bản

1 Các phương pháp tách chiết nucleic acid

 Phương pháp tách chiết DNA

 Phương pháp tách chiết RNA tồn phần và

mRNA

 Ly tâm

 Phương pháp sắc ký

2 Các phương pháp định tính và định lượng thơ

nucleic acid

 Phương pháp đo bằng quang phổ kế

 Phương pháp điện di

Tách chiết DNA

 Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein.

 Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hịa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước).

 Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, khơng bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hĩa học.

 Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase).

 Sau cơng đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần cĩ thể hịa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.

31/10/2011 8:58 SA 55 Nguyễn Hữu Trí

Tách chiết DNA

• Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân

• Bước 2: loại protein

• Bước 3: thu hồi nucleic acid

 Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

– Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.

– Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.

 Loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến tính không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi phenol:chloroform Thu hồi nucleic acid trong pha nước.

 Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa trong acid Cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.

Tách chiết DNA

Ly tâm phân đoạn (a)

(b) phân tách các

hợp dựa trên khối

lượng của chúng.

Thời gian và lực ly

cho từng nhóm phần

có tỷ trọng thấp hơn

tách.

Tách chiết DNA

Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách trọng của chúng Thời gian và lực ly tâm là

ly tâm có tỷ trọng với giá trị đi từ thấp đến phân tách.

Ly tâm trên gradient liên tục CsCl: trong động hình thành một gradient đẳng tỉ xuống đáy ống Dưới tác động của lực ly

và đến vị trí có tỉ trọng bằng với tỉ trọng một lớp cố định trong ống Lớp này được thu nhận lại sau ly tâm.

Tách chiết DNA

Phương pháp sắc ký

• Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay

oligodT-cellulose, dùng để tinh sạch mRNA.

• Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các nucleic

acid và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò

(probe) đánh dấu.

• Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những

lượng rất nhỏ DNA.

• Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải rất

oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách các

đoạn DNA.

2 Các phương pháp định tính và định lượng thô nucleic acid

• Điện di:

- Gel agarose

- Gel polyacrylamide

• Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density)

31/10/2011 8:58 SA 61 Nguyễn Hữu Trí

Phương pháp điện di

• Mục tiêu:

 Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước

 Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm

lượng

 Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …)

• Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic

acid: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một

điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện

trường.

Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong điện

trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ

các chất cấu thành gel.

• Kiểu điện di: Agarose, polyacrylamide, điện di trong

trường xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis)

Điện di - Electrophoresis

• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di…

• Nạp mẫu

• Chạy điện di

• Nhuộm gel.

Điện di trên gel

• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…),

bồn điện di, buffer, dung dịch điện di…

• Nạp mẫu

• Chạy điện di

• Nhuộm gel.

Chất nhộm gel - Stain

Điện di trên gel agarose

• Gel agarose là loại gel thông dụng nhất,

thường dùng để phân tách những đoạn

có kích thước 0,5-20 kb.

• Điện di theo phương nằm ngang

• Độ phân giải thay đổi khi nồng độ

agarose hay loại agarose thay đổi.

• Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm

ethidium bromide Chất này có khả năng

gắn xen vào giữa các base của nucleic

acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử

ngoại.

• Ứng dụng: phát hiện 1 trình tự DNA,

phân tích hỗn hợp các trình tự DNA

(Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu

Điện di biến tính (Denaturing electrophoresis)

• SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE):

• Gel: polyacrylamide

• SDS: Mạch 12 cacbon kỵ nước và một đầu hiếu nước.

• -> che phủ phần kỵ nước trên protein -> protein tích điện âm (-).

31/10/2011 8:58 SA 67 Nguyễn Hữu Trí

Điện di trên gel polyacrylamide

• Được dùng để tách các đoạn có kích

thước nhỏ, dưới 1000 cặp base.

• Điện di theo phương thẳng đứng

• Độ phân giải cao, phân biệt được những

trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide.

• Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ

tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide,

protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate

bạc.

• Ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotic

tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách các

trình tự DNA có kích thước gần bằng

nhau, SDS-PAGE (phân tích protein)

Phương pháp định lượng bằng

quang phổ kế

• Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid

có trong mẫu.

• Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base.

• Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu

đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan:

Một đơn vị OD 260nm tương ứng với nồng độ:

 50μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi

 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD 260 /OD 280 , tính chất của nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóng

ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất.

Các phương pháp lai phân tử

Cơ sở của sự lai phân tử

 Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt

độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H giữa hai mạch.

 Sau khi hai mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử.

 Đặc điểm của sự lai phân tử:

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau.

Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến

sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA

Các kiểu lai phân tử

• Lai trên pha lỏng

• Lai trên pha rắn

• Lai tại chỗ

Lai trong pha lỏng:

Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các trình tự tương đồng (giữa các loài hay trong một cá thể).

31/10/2011 8:58 SA 73 Nguyễn Hữu Trí

Lai trong pha rắn: Một trong hai trình tự cần lai được cố định trên giá thể rắn (màng lai) Phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ.

Ba kĩ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Northern blot, Dot blot.

Lai tại chỗ:

Trình tự nucleic acid cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.

Southern blot

nitrocellulose có khả năng tiếp nhận DNA đã được

biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên

cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên

1950 và 1960.

• Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp

điện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA được

cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa

trên cơ sở kích thước của chúng.

• Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp

là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng

lai nitrocellulose.

• Phương pháp này được E M Southern mô tả tại

Ðại học Edingburgh vào năm 1975.

Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

– Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.

– Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.

– Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.

– Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị được giữ nguyên không thay đổi.

– Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có trên màng lai với mẫu dò Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học.

– Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.

Southern blot

Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot

Northern blot

• Sau khi E M Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot.

• Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

– RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng điện di trên gel agarose.

– RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel).

– RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.

– Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu

dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát