Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN pot

Bước 4: Thu nhận ADN kết tủa Before After Centrifuge Wash Centrifuge PP Tách ly/Kết tủa Bước 5: bảo quản ADN Vai trò của các hóa chất được sử dung trong phương pháp ly trích... Phenol/C

Thymine, Cytosine

Tóm lược về sự sao chép ADN

Sao chép ADN trong TB (in vivo):

Kỷ thuật ly trích ADN

Ly trích ADN – Phương pháp nào ?

Việc chọn lựa phương pháp ly trích tùy thuộc vào nhiều yếu tố:

– Nguồn ADN: từ máu, niêm mạc, VK, TV, ĐV

– Mục đích sử dụng của ADN được ly trích: PCR, c t bằng

Enz c t giới hạn, Cloning

– Loại ADN: DNA trong nhân (genomic DNA), ty thể, lạp thể

– Số lượng ADN cần thu được, số mẫu cần ly trích

Các bước cơ bản của qui trình ly trích ADN

• PP ly tâm dựa trên sự khác nhau về tỉ trọng

4 Thu nhận ADN: hòa tan//kết tủa

5 Bảo quản ADN: hòa tan trong H2O hay TE

6 Kiểm tra số lượng và chất lượng ADN

Phá vở cấu trúc TB bằng cơ học

Yêu cầu: - Thao tác nhanh

- Không quá ‘thô bạo’

- Có sự hiện diện của buffer ly trích (chất ức chế Dnase)

- Thực hiện trong điều kiện lạnh (Ức chế hoạt động của Enz.)

Nước tNy (rữa bát) có tác

dụng gì ?

• Mỗi TB được bao bọc bởi

màng TB (phospholipid)

• ADN nằm trong nhân, và

cũng được bao bọc bởi

màng nhân

 Phải phá vở màng TB để phóng thích ADN

 N ước tNy có tác dụng phá vở màng TB vì tấn công vào lipid

(chất béo) và protein trong cấu tạo màng

N ước tNy (rữa bát) có tác dụng gì ?

Perform additional extractions for increased purity

Collect aqueous phase

Bước 3: Tách ly bằng dung môi hữu cơ

Organic

Aqueous

Interphase

PP Tách ly/Kết tủa

• Pellet down nucleic acids

• Wash pellet with 70% ethanol to remove residual salts and other contaminants.

• Discard ethanol and allow pellet to dry.

Bước 4: Thu nhận ADN (kết tủa)

Before After

Centrifuge Wash Centrifuge

PP Tách ly/Kết tủa

Bước 5: bảo quản ADN

Vai trò của các hóa chất được sử dung

trong phương pháp ly trích

Phenol/Chloroform = Tinh khiết DN A

Phenol: làm biến tính protein, các thành phần không hòa tan

hình thành ở phần solid giữa 2 phần ddịch

Chloroform: có tác dụng gia tăng độ nhớt của phần dung

môi hữu cơ (+ làm biến tính protein)

Isoamyl alcohol: có tác dụng ngăn cản sự trộn lẫn giữa 2

phần ddịch

Tác dụng của Enz Protease?

- Enz Protease có tác dụng phân hủy các protein liên kết với

ADN , đòng thời phân hủy các Enz trong TB chất co tác dụng

làm toornhaji ADN (VD: DN ase)

- Xử ly với Protease trong quá trình ly trích làm gia tăng hàm

hượng ADN nguyên vẹn thu được

Tác dụng của muối trong ddịch ly trích ?

- Trong ddịch đệm của protease đã có chứa sẳn thành

phần muối.

của ADN , làm trung hòa điện tích của phân tử ADN

- Sự hiện diện của N aCl giúp các phân tử ADN có thể

nhóm lại với nhau, thay vì đNy nhau ra do điện tích

của chúng  sự kết tủa ADN dễ dàng hơn khi cồn

được thêm vào.

Cồn có tác dụng tách nước khỏi ADN :

• Cho phép các cations liên két với gốc phosphat của

ADN

• Giảm lực đNy nhau giữa các phân tử ADN

• Làm cho các phân tử ADN tập trung với nhau  kết tủa

Kết tủa ADN bằng cồn

Tại sao cần sử dụng cồn lạnh ?

- DN A không hòa tan trong cồn.

- Thêm cồn lạnh sẽ làm cho các phân tử ADN kết

lại thành khối và kết tủa.

- Phân tử DN A kết tủa dưới dạng chùm sợi như ợi

bông gòn.

- Các bọt khí nhỏ trong ddịch liên kết với nhau,

khi ADN kết tủa  hình thành các bọt khí lớn,

nổi lên, sẽ kéo theo ADN từ phần ddịch nước nổi

lên phần dung môi hữu cơ ở phia trên

CTAB:

Chất tNy chứa Cation

Kỹ thuật Cắt (Digestion) và nối

T

-A-C-G-A-A-| -A-C-G-A-A-| -A-C-G-A-A-| -A-C-G-A-A-| -A-C-G-A-A-|

| -T-G-C-T-T-A

TTAG

C

A

CG

-A-C-G-A-A-T-T-C-C-A

Enz endonucleases chuyên biệt và không

chuyên biệt

Endonuclease không chuyên biệt: (loại I, III)

Endonuclease chuyên biệt: (loại II)

Điểm nhận diện (Recognition site)

của Enz cắt giới hạn loại II

Điểm nhận diện thường có trình tự ‘đối xứng’

Bcl I TGATCA Bfa I CTAG BfrB I ATGCAT BfuA I ACCTGC BfuC I GATCMột số Enz cắt giới hạn (6EBL)

Isoschizomers: các enz cắt giới hạn khác nhau, nhưng có cùng trình

tựu điểm nhận diện (VD: MboI và Sau3A là những Isochizomer, vì

có cùng trình tự ự điểm nhận diện GATC)

Complete Isoschizomers: Cùng điểm nhận diện (recognized site)

Cùng điểm cắt (cleaved sites)VD: Hpa II và Msp I (C↓CGG  tạo đầu dính (cohensive ends)

Incomplete Isoschizomers: Cùng điểm nhận diện (recognized site)

Isoschizomer

Các dạng đầu cắt tạo ra bởi Enz cắt giới hạn

5’ protruding ends 3’ protruding ends

Đầu bằng (blunting ends) Đầu dính (Cohensive ends)

Tần suất cắt của Enzyme giới hạn

(Ước lượng dựa theo qui luật tổ hợp)

4 nucleotide (A, T, C, G) + Giả định:

+ 4 N u hiện diện với số lượng bằng nhau (tần số ¼)

+ 4 N u sắp xếp ngẫu nhiên trong genome (qui luật tổ hợp)

Ví dụ: Trình tự đoạn nhận diện (recognition site)

AT  Tầ suất = 1/4 A x 1/4 T = 1/16 AT (1/4) 2

ATT  Tầ suất = 1/4 A x 1/4 T x 1/4 T = 1/64 AT (1/4)3

ATTGCG  Tầ suất = 1/4096 ATTGCG (1/4) 6

Độ dàiđoạnnhậndiện↑ Khoảngcáchgiữacácđiểmc t↑

Số lượngđiểmc t↓

Bản đồ cắt bởi Enz giới hạn

(Restriction Map)

Restriction Map = Bản đồ vị trí cắt của các enz giới hạn trên 1

đoạn ADN cho trước

Công cụ hổ trợ để xác định Restriction Map = các chương trình vi

tính chuyên dụng cho phân tích ADN (VD: BioEdit, CLC Free

Workbech)

Ứng dụng của Restriction map:

+ Xác định vị trí cắt của 1 Enz giới hạn trên đoạn ADN khảo

sát

+ Ước lượng số lượng và kích thước của các đoạn ADN sẽ

nhận được khi sử dụng 1 hay nhiều Enz giới hạn để cắt 1 đoạn

+ Tỉ lệ: số lượng ADN /số lượng Enz giới hạn

+ Tính chất của Enz giới hạn

N ối ADN (DN A ligation) = hình thành cầu nối phospodiester

giữa 2 mạch ADN , nếu đầu 5’ có gốc Phosphat

Enz Ligase:

Ligase của phage T4

Co-factor: ATP

sử dụng cho cả đầu dính và đầu bằng

Ligase của E coli

Co-factor: N AD+

chỉ sử dụng cho đầu dính

N ối ADN (DN A ligation)

Đầu của 2 đoạn ADN cần ‘tương thích’ để nối thành công

G-A-T-C-C-N-N-| G-A-T-C-C-N-N-| G-A-T-C-C-N-N-| G-N-N-

C-T-N-N-| C-T-N-N-| C-T-N-N-| C-T-N-N-| G-A-N-N- Compatible cohesive ends Non-compatible cohesive ends

Compatible blunt ends Non-compatible cohesive/blunt ends

‘tương thích’ : + dạng đầu giống nhau

+ có thể tạo l/kết bổ sung

Kỹ thuật điện di (Electrophoresis)

Điện di ADN (DN A Electrophoresis)

N guyên tắc

• Gốc phosphatecủa ADN mang điện tích âm phân tử

ADN sẽ di chuyển về cực dương trong môi trường điện

• Điện tích âm được phân bố đều dọc phân tử ADN tốc

độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào kích thước của

chúng

• Tốc độ di chuyển còn phụ thuộc vào môi trường gel sử

dụng

Kỹ thuật điện di ADN

Phân loại:

+ Điện di trên gel agarose

+ Điện di trên gel Polyacrylamide

Các bước tiến hành

Bước 1: ChuNn bị mẫu điện di

Bước 2: ChuNn bị gel và điện di

Bước 3: N huộm mẫu  đọc kết quả

N huộm gel agarose

Mục đích: N huộm màu ADN  nhân diện

Hàm lượng ADN ↑  Bắt màu càng đậm

Các hóa chất nhuộm:

Gel Agarose: Ethium Bromide

Cyber green Methylene Blue

Độ nhạy: Ethium Bromide ~ Cyber green > Bleu Methylene

Độc hại : Ethium Bromide > Cyber green > Bleu Methylene

Giá thành: Cyber green > Ethium Bromide > Bleu Methylene

Agarose Gel Electrophoresis

Ứng dụng:

– Phân tách ADN dựa theo kích thước phân tử

– Tinh lọc đoạn ADN cần quan tâm

Ưu điểm:

- PP đơn gỉan (không đòi hỏi nhiều kinh nghiệm và kỷ thuật)

- ít mất thời gian (TB: 45-60 phút/RUN )

- Phương pháp nhuộm mẫu nhanh, có thể chụp ảnh kết quả ngay

- Dễ dàng phân lập trở lại ADN từ gel

Khuyết điểm:

- Độ phân giải thấp (khác biệt k/thước có thể nhận diện > 50 N u

- Thuốc nhuộm Ethium bromide Cancergen

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

+ Gel = hổn hợp 2 ddịch: acrylamide and bis-acrylamide (tạo liên

kết mạng lưới) khi đông đặc (polymer hóa)

+ Quá trình polymer hóa khởi động bởi TEMED và được xú tác

bởi ammonium persulfate

+ Rất độc (neurotoxin) khi ở dạng lỏng (chưa polymer hóa),

không độc ở dạng đông đặc (đã polymer hóa)

+ Quá trình Polymer-hóa bị ức chế bởi không khí (đk hiếm khí)

 gel thường ở giữa 2 miếng kính

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Hàm lượng gel: cao  Phân tách ph/tử k/thước <

thấp  Phân tách ph/tử k/thước >

Lưu ý

Điện di với hiệu điện thế thấp:

- Tốc độ di chuyển của ADN chậm  tốn nhiều thời gian

- Band thẳng và rộng

Điện di với hiệu điện thế cao:

- Tốc độ di chuyển của AN D nhanh  ít tốn thời gian

- dễ bị ‘smile’, nhưng band hẹp và nét

N huộm gel Polyacrylamide

Mục đích: N huộm màu ADN  nhân diện

Hàm lượng ADN ↑  Bắt màu càng đậm

Các hóa chất nhuộm:

N itrat Bạc (AgN O3)

Fluorecent dye (IR700, IR800 – LICOR Corp.)

Đồng vị phóng xạ P32

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chaine Reaction)

Tạo con mồi (primer) : con mồi tổng hợp

Kết nối các N u tự do : Taq Polymerase

Đóng xoắn : nhiệt độ

Kỹ thuật PCR (công nghệ gien)

Các thành phần cần thiết của PCR:

1 ADN khuôn cần tổng hợp (DN A template)

2 Con mồi (Primers): đoạn ngắn oligonucleotides, liên

kết bổ sung với mạch khuôn ở 2 đầu đoạn cần tổng

50°C

1 chu kỳ (Cycle) = + Biến tính (denaturation) (94oC)

+ Gắn mồi (primer annealing) (50 o C)

+ kéo dài (primer extension)

Chu kỳ 2 (second cycle)

like firstcycle

new

reactions

Chu kỳ 3 (third cycle)

Thermocycler (Thập niên 90)

Water Bath (Thập niên 80)

Bước phát triển nhảy vọt của KT PCR

Các thành phần cần thiết của P/ứng PCR

dN TPs – đơn vị cấu trúc mạch mới

primers – mồi xuôi (forward) và mồi ngược (reverse)

MgCl2– cần thiết cho việc gắn mồi (và h/động của Polymerase)

0.5 – 4 mM

Buffer – để duy trì pH

Cách thiết kế con mồi (primers)

• Độ dài từ18-25 N u (17-30?)  đảm bảo tính chuyên biệt

Độ dài con mồi ↑  Tính chuyên biệt ↑

• N hiệt độ của gia đoạn gắn mồi (Melting temperature) được tính bằng

nhiều P/pháp khác nhau (thường nằm trong khoảng 55-65°C theo PP

của Wallace PP tính đơn giản:

[2(A+T) + 4(G+C)] – 5 = Tm oC

• Trong trình tự con mồi nên tránh:

+ những đoạn lặp đảo ngược (self-complementary)

+ trình tự bổ sung giữa 2 mồi (‘primer dimers’)

• Con mồi nên tận cùng bằng G hay C ở đầu 3’(G/C “clamp”)

• Có thể sử dụng các phần mềm để thiết kế mồi như: Biology

Workbench, Primer Primer…

N hững vướng mắc thường gặp trong PCR

• Các chất ức chế P/ứng PCR có trong ADN khuôn (trong quá

trình ly trích (protease, phenol, EDTA )  pha loảng ADN

• N hiễm các chất ức chế từ những nguồn khác

Cách khắc phục:

• Làm việc trong điều kiện vô trùng (laminar flow hood,

khử trùng bằng UV light 254 nm)

• Sử dụng các pipette, các đầu tip, các hóa chất chuyên

biệt dành riêng cho PCR

• Ly tâm tube mẫu trước khi mở nắp, để tránh văng nước

ra ngoài hay làm nhiễm vào pipette

PCR in silico

PCR in silico = Mô phỏng P/ứ PCR trên máy tính

Mục tiêu: - Kiểm tra k/thước đoạn ADN sẽ được t/hợp

- Vị trí và chất lượng liên kết của đoạn mồi (primer)

- K/tra hiện tượng tự liên kết của đoạn mồi (primer

dimer) nếu cóSoftware: Primer Primer, Fast PCR, AmplifX…

Câu hỏi ???