ĐỘC tố AFLATOXIN TRONG nấm

- Là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tb không có diệp lục tố - Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh, cộng sinh, vách tb cấu tạo chủ yếu là chitin - Là loại vi sinh vật thường thấy xuất hiệ

ĐH NÔNG LÂM TPHCM

BM CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Môn: ĐỘC TỐ TRONG SẢN PHẨM

NÔNG NGHIỆP

Tên Chuyên đề:

ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG NẤM

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngộ độc thực phẩm là do thực phẩm bị biến chất, ôi thiu, thực phẩm bị nhiễm hay có chứa độc tố của vi khuẩn, virus, nấm…

Ngộ độc thực phẩm do nấm mốc gây ra cũng

đã và đang là vấn đề lo ngại cho con người và toàn xã hội Chúng gây nên những bệnh lý mãn tính dẫn đến ung thư gan, còi cọc, suy nhược

cơ thể, dẫn đến tử vong trong những trường hợp ngộ độc cấp tính

- Là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tb không có diệp lục tố

- Sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tb cấu tạo chủ yếu là chitin

- Là loại vi sinh vật thường thấy xuất hiện trên các nông sản, thực phẩm

- Có loại có lợi cho quá trình chế biến tạo ra các sản phẩm làm tăng mùi thơm như nấm mốc làm tương nhưng cũng có loại làm hư hỏng thực phẩm, gây độc cho con người.

- Là loại độc tố được biết nhiều nhất, được sản sinh từ

chủng Aspergillus flavus , Aspergillus parasiticus, thường

sống trên các thực phẩm có dầu như ngô và các loại hạt

đỗ, lạc

- Aflatoxin bao gồm 4 nhóm chính là :B1, B2, G1, G2.

- Aflatoxin B1 là loại cực độc Một lượng 0,03 ppm aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra  u gan.

- Aflatoxin có thể sinh ra trong ngũ cốc ngay

cả trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu ngũ cốc không được bảo quản đúng cách hay được sinh ra trong thức ăn chăn nuôi trước khi được sử dụng

- Khi aflatoxin sinh ra, khó có thể làm gì để

loại bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay thức ăn chăn nuôi

- Các loại độc tố này có cấu tạo hoá học rất

ổn định và không bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng, axít, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ

Dùng thử nghiệm sinh hóa phát hiện

độc tố Aflatoxin

–Thử nghiệm trên vịt con 1 ngày tuổi –Thử nghiệm trên cá vàng

–Thử nghiệm trên ấu trùng giáp xác –Thử nghiệm trên phôi gà

–Thử nghiệm trên nòng nọc

Phương pháp hiện đại

Đo mật độ

huỳnh quang

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các

nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom

• Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel.

• Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được

xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

• Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen.

• Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril

• Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf

CHUẨN BỊ MẪU

• Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ 1mm

• Điều kiện tiến hành : trong phòng mát, tránh ánh sáng

• Chú ý : với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ete dầu hỏa sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền.

TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM

• Cân 50g mẫu đã nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml

• Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt

• Lắc trong 30 phút rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh

• Bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo

TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM

• Trộn 50ml dịch lọc trên với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị

• Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra

• Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt

độ thấp hơn 500 C cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml.

• Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 500C

• Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị cột sắc ký:

TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM

• Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 500 C cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc

và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 500C

• Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng

TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM

• Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B

• Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B

• Lấy 10, 20 m l dịch chiết

• Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc –

axeton (9: 1)

• Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng

30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ

phòng, tránh ánh sáng

• Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2

có huỳnh quang màu xanh lá cây.

KẾT QUẢ

***Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - axêtôn (9:1) có trị số trung

bình như sau:

•Aflatoxin B 1 : 0,72

•Aflatoxin B 2 : 0,67

•Aflatoxin G 1 : 0,59

•Aflatoxin G 2 : 0,54

ĐÁNH GIÁ

• Độ nhạy của phương pháp : 5 m g / kg (5 ppm)

• Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 ± 5%

• Sai số trung bình của phương pháp : ±

10%

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê

Thị Lan Chi (2009), Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương

thực- thực phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, trang 66- 81.

2 Trường DH Y Hà Nội(2004), Dinh dưỡng và vệ sinh an

toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Giao dục,trang 367- 369.

3 Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm( 2011),

Giao trình vệ sinh an toàn thực phẩm, Đại học Thái

Nguyên,trang 45 – 52.

4 Bhatnagar, D., S P McCormick, L S Lee, and R A

Hill 1987, Identification of Omethylsterigmatocystin as an

aflatoxin B1/Gl precursor in Aspergillus parasiticus, Appi Environ Microbiol