Xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sâu sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu, đặc biệt đậu tương và lạc

Chất Aflatoxin đã được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của 2 loại nấm Aspergillus flavus va Aspergillus parasiticus trong quá trình phát triển trên lạc và các san phẩm chế biến từ l

ALY

BO THUONG MAI

CUC QUAN LY CHAT LUGNG HANG HOA VA DO LUONG

76- Nguyén Truong Té - Ha Noi

XÁC ĐỊNH MOT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẾ pitt BAO QUAN NHẰM LOẠI TRÙ SỰ PHÁT TRIEN CUA CAC NAM MOC GAY BOC (CO DOC TO AFLATOXIN) TRONG CAC LO

> HANG NONG SAN DU TRU VA XUAT KHẨU,

ĐẶC BIẾT ĐẦU TƯƠNG VÀ LẠC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Chủ nhiệm : KS Ngô Đình Cơ

Các thành viên tham gia:

- K§S Trịnh Hồng Thuý

- KS Ly thi Dung

- KS Huynh lé Tam

và các cán bộ phòng NSTP

Co quan hop tac hé tro:

- Viện Kỹ thuật Nhiệt đới thuộc Viện Khoa học Việt nam

- Trường Đại học Dược Hà nội

- Tram bão vệ thực vật Hà nội

- Trung tâm chiếu xạ Quốc gia

Pt

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lạc và Đậu tương là hai loại hạt có đầu chiếm vị trí quan trọng trong

nhóm hạt có đầu trên thế giới, nó thuộc loại cây trồng thích hợp khí hậu nhiệt đới

như nước ta Hàng năm ở nước ta đã sản xuất khoảng 2 chục vạn tấn lạc phần lớn

số lạc này được dùng để xuất khẩu, năm 1991 xuất khẩu đứng thứ 3 thế giới (sau

Mỹ và Trung quốc)

Lạc và Đậu tương là những loại nông sản quí, có giá trị sử dụng và dinh

dưỡng cao Đó là một loại thực phẩm giầu chất đạm và chất béo, được dùng để chế

biến làm thức ăn, các loại bánh kẹo Dầu lạc, đậu tương được đùng để chế biến thực

phẩm và trong một số ngành công nghiệp, khô lạc, đậu tương là nguyên liệu để làm nước chấm và chăn nuôi gia súc

Tuy vậy, trong quá trình bảo quản và chế biến lạc, đậu tương rất đễ bị hư hỏng, chủ yếu là do nấm mốc và mọt xâm nhập Khi lạc và đậu tương bị mốc sẽ giảm giá trị dinh đưỡng, ' mất mùi vị, biến mầu, làm tăng tỷ lệ axít béo tự do, làm tăng hoạt động sống của hạt, là một điều bất lợi khí bảo quần hạt Trong quá trình trao đổi chất của mốc trên lạc đã sinh ra độc tố aflatoxm Đặc biệt là sau những năm

1960 các nhà khoa học phát hiện ra nguyên nhân làm ngộ độc chết hơn [0 vạn gà con ở Anh là do ăn phải thức ăn có khô đầu lạc bị mốc ' có chứa một lượng lớn Aflatoxin, một chất gây ra các nhiễm độc ở gan và thận

Chất Aflatoxin đã được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của 2 loại nấm Aspergillus flavus va Aspergillus parasiticus trong quá trình phát triển trên lạc và các san phẩm chế biến từ lạc

Ở nước ta với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mùa thu hoạch chủ yếu lại vào mùa mưa (một vụ thu hoạch đậu tương ở Miền nam phải thu hoạch ngay trong mùa mưa) nên rất đễ bị mốc xâm nhập, phá hoại Đây là một khó khăn lớn trong công việc bảo quản đối với những người sản xuất cũng như trong quá trình sử dụng, chế biến Hàng năm đã gây những tổn hại, lãng phí không nhỏ về kinh tế và công sức trong việc xuất khẩu và tiêu đùng nội địa Việc sử dụng lạc mốc làm thực phẩm cho nhân dân chưa được các cơ quan có trách nhiệm quan tâm chú ý đúng mức Đây là vấn đề có ý nghĩa về bảo vệ sức khoẻ của con người, cần được quan tâm, nghiên cứu giải quyết một cách có hệ thống hơn nữa

Xuất phát từ những nhu cầu của thực tế trong việc bảo quản lạc và đồ tương, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sự phân bố của hai loai Aspegillus flavus

và A parasiticus trên lạc nhân (vùng Hà nội), chọn lựa phương pháp thích hợp để xác định sự có mặt của Aflatoxin trên lạc và đỗ tương, nghiên cứu một số biện pháp

thích hợp để bảo quần chống mốc cho lạc nhân và đỗ tương phù hợp với điều kiện sản xuất và trang thiết bị thực tế hiện nay ở nước ta

2 XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CỦA HAI LOÀI A FLAVUS VÀ A

PARASITICUS

2.1 Phương pháp tiến hành:

: Chúng tôi sử dụng phương pháp pha loang.Day là phương pháp kinh điển

và có độ tin cậy cao đang được áp dụng trong các tiêu chuẩn xét nghiệm TCVN và tiêu chuẩn quốc tế IS0 Môi trường nuôicấy là môi trường Czapek-Dox

Cân IOg mẫu, xay nhỏ đưa vào bình tam giác ,có chứa 90 mÌ nước đã khử trùng, lắc kỹ Tiếp tục pha loãng mẫu với các đậm độ khác nhau 10,102 Dùng pipet v6 tring hut Iml từng đậm độ đã pha, cho vào các hộp Petri đã khử trùng, mỗi đâm độ cấy hai đĩa Môi trường thạch Czapek-Dox đã đưn chảy và khử trùng để nguội tới 45-500.R6t vo trùng I5ml môi trường và mỗi đĩa Petri, lắc nhẹ cho môi trường thạch phân bố đều, để thạch đông cứng rồi xếp lại để ở nhiệt độ 3# I°C để trong 5 ngày.Nấm A.flavus và A.parasiticus duoc phan lap từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 Đếm số khuẩn lạc nấm mốc đã mọc trong các hộp Petri Cứ mỗi khuẩn lạc điển hình, nghỉ vấn A.flavus đều được cấy truyền vào ống thạch nghiêng, đồng thời được cấy chạc ba vào đĩa Petri có chứa môi trường Czapek-box để nghiên cứu hình thái và làm tiêu bản vi học Từ đậm độ pha loãng và số khuẩn lạc đếm được, tính ra tổng số bào tử nằm trong Í øg mẫu

2.2 Kết quả phân lập:

2.2.1 Doi voi lac nhan

Chúng tôi đã tiến hành phân lập với 25 mẫu lạc nhân được lưu thông ở các chợ tại một số địa điểm khác nhau ở Hà Nội, kho Vĩnh Tuy và một số mẫu lấy từ

Nghệ An mang ra Chúng tôi đã xác định được loại A flavus và A.parasiRcus theo

khoá phân loại của giáo sư Bùi Xuân Đồng(1) và đã gửi các mẫu đề giáo sư khẳng định Các bước tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã thực trong phòng cấy vô trùng

để hạn chế thấp nhất kha nang lây nhiễm vào mẫu

Kết quả phân lập được phi ở bảng 1

Bảng 1 - Phân bố năm mốc đối với lạc nhân

I_ | Chợ Nghĩa Đô | Màu nâu không mốc | 5/5102 | 1,5.102 26

2 Chợ Bưởi Màu nâu, có mốc ở 2,5.102 1,5 102 64

vo lac va phoi mam

3 Cho Budi Màu nâu, có mốc nhe L8" or Bu to" AA

.9_ | Nghĩa Đô Màu nâu,mốc ở một | 7,5 102 1,2.102 16

không mốc

19 | Kho Vĩnh Tuy | Màu hồng nâu, 50102 |0 0

Bang 1- Phân bố nấm mốc đới với lạc nhân (tiếp)

‡ Số | Địa điểm Đánh giá cảm quan | Số lượng | Số lượng | A.flavus

TTỊ lấy mẫu nấm mốc | A.flavus SO với

Kết quả phân lập từ 25 mẫu lạc, trong đó có 17 mau mua tai các chợ ở Hà nội ( không rõ nguồn gốc và thời gian bảo quản ) và 8 mẫu lạc từ Nghệ An (trong

đó có những mẫu mới thu hoạch) cho thấy :

- Trong số 25 mẫu có lÍ mẫu lạc nhiễm nấm mốc A.flavus tương đương với 44%, trong do A.flavus có nhiều nhất là 64% và ít nhất là 3% so với toàn bộ nấm mốc có trong một mẫu Loài A.Parasiticus không phát hiện thấy trong các mẫu phân lập Ngoài các loài nấm mốc còn có cả vị khuẩn và nấm men phát triển

- Số lượng ít nhất của Aspergillus flavus ( tính theo số khuẩn lạc phân lập được) trong | g lac mau là 50 và nhiều nhất là 150

- Ở những mẫu lạc mưa ở các chợ tỷ lệ nhiễm A.flavus cao hơn so với các mẫu lấy từ Nghệ An ra ( các mẫu này vừa thu hoạch, được phơi khô, bóc vỏ, bảo quản cẩn thận tại gia đình trong chum)

Qua một số tài liệu tham khảo {2, 3, 4, 5 } và qua thực tế chúng tôi thấy rằng

sự phân bố của loài A.flavus trên lạc phụ thuộc vào điều kiện sinh thái đất đai ở trong địa phương, điều kiện canh tác, thời gian thu hoạch, điều kiện chế biến, bảo quản Loài nấm Aspergillus flavus thường rất hay gặp trong đất trồng lạc Cho nên lạc rất

đễ bị nhiễm loài nấm này trước khi thu hoạch Khi bị xâm nhập, khả năng sinh độc tố Aflatoxin trong hạt có thể phát triển cả trong khí phơi khô, vận chuyển và lưu kho nếu không có các biện pháp bảo quản thích hợp để ngăn ngừa sự phát triển của A.flavus 2.2.2 Doi voi dau tong

Cách tiến hành giống như lạc nhân với số mẫu nhỏ hơn đại điện cho các giống đậu tương Sơn La, Ha Bắc, Miền nam, Tuyên Quang, Cao bằng, Miên, Sông

Ma - Thanh hoa

Kết qua phan lập được ghi o bang 2

Đánh giá kết quá đốt với đậu trong

Sau khi phân lập theo quy trình trên cả đốt vớt A Ílavus và

Parasiticus, két qua đạt được cho thấy:

- Trong số I0 mẫu có 7 mẫu: nhiễm A flavus (tương đương với mức độ 70 % nhiễm) phát triển bào tử từ 16⁄jđến 90 % so với toàn bộ số lượng bào tử nấm mốc - đặc biệt có cả 30 % số mẫu phát triển bào tử nấm mốc từ 85 - Of

%

- C6 4 mẫu nhiễm A parasiticus từ 6 % đến 33,3 % so với toàn bộ bào tử

- A flavus phat triển với số lượng cao hơn về bào tử và về mức độ phân bố trên mẫu so với Á parasiticus

- 100 % lô đậu tương bán ngoài thị trường bị nhiễm nấm mốc từ 30 khuẩn

Mẫu Bào tử th mốc | “A flavus A parasiticus

chung (kV) |; (kl⁄g) (l/g) I.Lạc | 25 50 -'43001- i} 0-50-150 * =

nhân trung Bi! 779 binh quan 93

2.3 Nhận xét chung kết quả phân bố nấm mốc trên lạc và đậu tương

2.3.1 Trong 25 mẫu lạc nhân tại thị trường Hà nội và Nghệ An số lượng nấm mốc phát triển là 779 khuẩn lạc trong l gam và đỗ tương là 1004 khuẩn lạc trong Í gam (bang 3)

Mức độ phân bố bình quân của A.flavus ở lạc nhân là 93 khuẩn lạc trong † gam và đỗ tương là 387 khuẩn lạc trong 1 gam

2.3.2 Loại mốc có khả năng gây độc luôn luôn có mặt ở Nông sản ở mức từ 44 % đến 70 % số lượng mẫu - trong những mẫu tiêu thụ bình thường trên thị trường, tỷ lệ khuẩn lạc trong † gam thấp nhất là 1O và cao nhất là 100

2.3.3 Những mẫu hạt lạc và đậu tương bị mốc theo sự phát hiện bằng mất thường

thì đều phát hiện có nấm mốc ở mức từ 30 đến 100 khuẩn lạc trong | gam, loại hạt bị mốc có khả năng chọn lua bang mat thường thì có mức bào tử nấm mốc phát triển từ 3000 đến 4500 khuẩn lac trong | gam

2.3.4 Mức phát triển nấm mốc của lạc nhân và đỗ tương tiêu thụ trên thị trường tiêu thụ Hà nội và một số lô xuất khẩu Nghệ An đều dưới mức quy định của Quốc tế Gạo theo ICMSE - 1980 có chỉ tiêu nấm mốc được phép dưới 100.000 khuẩn lạc trong I gam và ngô hạt dưới 10.000, lạc dưới 10.000

(ICMSF - /nternational Commission for Microbiological Specifications for Foods-

Ủy ban quốc tế về chỉ tiêu vì sinh vat trong thực phẩm)

ww

3 CHỌN LỰA PHƯƠNG PHÁP KIỀM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA ĐỘC TỐ

AFLATOXIN TRÊN LẠC NHÂN

Việc kiểm tra, phát hiện sự có mặt của độc tố Aflatoxin trên lạc nhân cũng

như trong thực phẩm nói chung là một việc rất cần thiết để bảo đảm an toàn cho sức khỏe của con người cũng như của gia súc Bởi vì trong thực tế nhiều mẫu lạc có nấm moc A flavus nhưng không phát hiện thấy sự có mặt của Aflatoxin, có thể những loài nấm này không phải là những loài sinh độc tố, ngược lại cũng có mẫu không hề thấy nấm mốc phát triển nhưng qua kiểm tra lại phát hiện chứa một lượng lớn

- Aflatoxin ở đây có thể trong qua strình thu hoạch, bảo quân nấm mốc A flavus phát triển sinh độc tố, do những lý do nào đó đã không phát triển tiếp

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để kiểm tra sự có mặt cũng như định lượng Aflatoxin trên lạc nhân và các sản phẩm chế biến từ lạc Nói chung tất cả các chuyên gia đều cho răng việc tiến hành các phương pháp thử nghiệm đều phải đo các chuyên gia có kinh nghiệm , được đào tạo một cách có hệ thống thực hiện thì các kết quả mới

chính xác được, tránh được những sai sót có thể xảy ra trong thao tác Hơn nữa Aflatoxinlà chất độc, đễ gây ung thư gan trong thời gian ngắn nên về mặt an toàn cũng cần chú ý Phải có những hiểu biết và điều kiện trang thiết bị phù hợp cho thử nghiệm

Hiện nay người ta sử dụng một số phương pháp chính như sau để xác định sự có mặt của một số loại độc tố nói chung và Aflatoxin nói riêng trong thực phẩm và lạc

- Phương pháp sinh học : thử nghiệm trên vịt con một ngày tuổi, trên phôi trứng

ga da thu tinh, vi sinh vat Bién phap này chủ yếu dùng trong nghiên cứu vì độ

tin cậy thấp và khả năng ứng dụng hạn chế

- Phương pháp lý hóa : đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay Dựa trên tính chất tan của các Aflatoxin trong một số dung môi hữu cơ như

clorofom, methanol, etanol, aceton, benzen va khong tan trong mot so dung

môi béo như hexan, ete dau héa ngudi ta da chiét xuat Aflatoxin ttr mau thu, sau đó tách bằng sắc ký : sắc ký giấy, sắc ký cột, sắc ký bản móng Dưới tác dụng của ánh sáng tử ngoại với bước sóng đài nếu xuất hiện một vệt huỳnh quang xanh lơ hoặc xanh lá cây : đó là Aflatoxin

Trong đó phương pháp sắc ký cột mini là biện pháp kha quan để phát hiện nhanh các độc tố có trong các loại nông sản Chủ yếu dùng để xac định các Aflatoxin Phương pháp sắc ký bản mỏng, mặc dù là phương pháp cổ điển song với độ tin cậy cao có thể phát hiện độc tố ở nồng độ thấp, trang thiết bị đơn giản, hóa chất thông thường dễ kiếm, phù hợp với điều kiện kinh tế của các nước đang phát triển[6, 7] Phương pháp sắc ký lỏng cao áp và phương pháp sắc ký khí là

các phương pháp hiện đại, có độ tín cậy cao hơn phương pháp sac ky ban mong,

có thể tự động hóa một số khâu khi thao tác Song hạn chế của nó là thiết bị quá đắt, do đó không thé ding rong rai 6 moi noi duoc Thao tac stt dung va bao dưỡng phức tạp

- Phương pháp sử dụng miễn dịch học[8, 9] ELISA (Enzyme Linked

Immunsorbent Assay) là phương pháp đầy hứa hẹn có thể áp dụng ở mọi nơi để xác định Aflatoxin trong các mẫu thử nghiệm Đây là phương pháp hiện đại có thể phát hiện nhanh và một lúc có thể đánh giá được nhiều mẫu Ở các nước tiên tiến như Anh và Mỹ, họ đã sản xuất thành thương phẩm = "Afla-test kit" Nhưng hiện giờ cũng chưa thể khẳng định ngay được ELISA sẽ dong vai trò chủ yếu trogn việ phát hiện các loại độc tố trong thực phẩm và nông sản

Ngoài ra còn sử dụng phương pháp phóng xạ miễn dịch RIA (Radio Immunosorbent Assay) Phương pháp này có thể phát hiện các độc tố ở nồng độ thấp,

song hiện nay it được ấp dụng vì phát sử dụng các chất phóng xạ độc hại và nguy

hiểm

Theo tài liệu [TO] các tác gia đã so sánh các tính năng của một số phương pháp

để xác định các độc tố trong đó có Aflatoxin (xem bang 4)

Bảng 4

Phương pháp Khả năng [| Độ Tin | Giới hạn Giá Kha nang

ứng dụng | cậy của sự phát thành tự động

hién thiét bi | hóa

Sắc ký cột mini | Han chế Vừa Vừa phát | Thấp Không

phải Sắc ký bản Rộng rãi Cao Thấp Thấp Không

mỏng

Sac ký lỏng cao | Rộng rãi Cao Thấp Cao Từng phần

áp

Sắc ký khí Han chế Cao Thấp Cao Từng phần

365 nm) và các Aflatoxin chuẩn

Quy trình tiến hành phân tích, phát hiện Aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trong các mẫu lạc bao gồm những bước sau: (xem hình | Ề E : g &

Lấy mẫu

Aflatoxin có trong mẫu so với Aflatoxin chuẩn

L

Kiểm tra lại với một số hóa chất thử

Hình 1 Trong lạc và các sản phẩm được chế biến từ lạc chủ yếu phát hiện thấy Aflatoxin By, Bg, doi khi Gy, Go

Sau đây là công thức hóa học của các loại Aflatoxin BỊ, Ba, GỊ, G2

3 Aflatoxin Gy

4 Aflatoxin G2 (R=H) Aflatoxin G2a (R=OH)

Ao

Để kiểm tra sự có mặt của Aflatoxin trên một số mẫu lạc đã thí nghiệm để

phân lập A.flavus, chúng tôi đã tiến hành xác định trên bảy mẫu lạc Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy trong bảy mẫu lạc có một mẫu phát hién thay Aflatoxin (Bug/Kg) Trong céc mau nay cé mot s6 mau qua phân lập đã phát hiện thấy sự có mặt của A flavus

Chúng tôi có tham khảo một số tài liệu đề cập đến việc phát hiện Aflatoxin trên lạc nhân ở trong nước và một số nước khác ( xem bằng 5)

Qua kết quả trên và qua thực tế, khả năng sinh Aflatoxin trén lac nhân của

nấm A flavus phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như nhiệt độ, độ ẫm, điều kiện

thu hoạch và bảo quản, chúng A flavus có sinh độc tố hay không và thủy phần của

lạc

4 NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN CHỐNG MỐC CHO LẠC PHÙ HỢP VỚI

DIEU_KIEN THỰC TẾ NƯỚC TA HIỆN NAY

4.1 Giới thiệu tình hình chống mốc cho lạc ở trong và ngoài nước

Qua tham khảo một số tài liệu nghiên cứu ở trong và ngoài nước về vấn đề bao quản chống mốc cho lạc Chúng tôi xin tóm tắt giới thiệu một số biện pháp chính sau:

AA

tế Đăng Hồng Miên và công sự [18] da nghiên cứu chống mốc cho lạc bằng phương pháp bao gói trong màng PE bên ngoài là bao tải gai, vớt lạc có thủy phần 7% , bao quản được 4_6 tháng không bị mốc Đây là một phương pháp bảo quan don gian , có liệu quả Song có những lý do khách quan nên chưa được áp dụng rộng rãi

7

Ở ngoài nước:

Vấn đề nghiên cứu bảo quản và phòng chống sâu mọt, nấm mốc cho các loại nông sản trong nông sản trong đó có lạc và các sẵn phẩm chế biến từ lạc rất quan tâm nghiên cứu không những ở các nước sản xuất lạc mà còn ở các nước nhập lạc , nhất là

chống hoặc ít bị A flavus xâm nhiễm [22] Tùy theo điều kiện cụ thể của từng nước

mà có những biện pháp bảo quản phù hợp, như:

_ Bao quan trong môi trường có nhiệt độ và độ ẩm thấp (ở nhiệt độ dưới 15°C

, độ ẩm không khí 55-65%) tuyệt đại đa số các loài nấm không phát triển rất kém Theo Alfschul [23] giữ lạc ở nhiệt độ 15°C trong hai năm, lạc không bị mốc và không có biến chuyển gì đáng kể trong thành phần

— Bảo quản trong môi trường kín thiếu ôxy nhầm ức chế sự phát triển của nấm mốc Đây là một biện pháp được nhiều nước tiên tiến áp đụng trong qua trình bảo quản nông sẵn chống sự xâm nhập của sâu mọt và nấm mốc Để tợa môi trường thiếu ôxy trong các confeiner kín, người ta có thể đùng một số hợp chất có khả năng hấp thụ ôxy [24,25] hay dùng một số hợp chất có kha năng hấp thụ ôxy [24,25] hay trong môi trường khí quyển có chứa nhiều CO2 Mội số tác gỉa trong tài liệu [3] đã chúng mình rang tồn trữ lạc trong

Az