Xác định đồng thời độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng LC MS và MS

Số lượng cũng như mức độ nguy hiểm của các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó độc tố vi nấm là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc nhưng lại ít được đề cập đến..

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC

PHẨM BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC PHẨM

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những người đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Trần Cao Sơn, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Đặng Ngọc Lan đã định hướng cho tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng như hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (NIFC) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn khác trong Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Đoàn Thị Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về độc tố deoxynivalenol và zearalenone 2

1.1.1 Deoxynivalenol (DON) 2

1.1.2 Zearalenone (ZEA) 3

1.1.3 Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2] 5

1.2 Hàm lượng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm 6

1.3 Tổng quan phương pháp xác định DON và ZEA 9

1.3.1 Các phương pháp đã được thực hiện 9

1.3.2 Phương pháp QuEChERS 11

1.3.3 Phương pháp LC-MS/MS 12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.1.3 Dung môi, hóa chất 18

2.1.4 Chất chuẩn 18

2.1.5 Pha dung dịch chuẩn 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Khảo sát các điều kiện xác định độc tố vi nấm bằng LC-MS/MS 20

2.2.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 20

2.2.3 Thẩm định phương pháp 20

2.2.4 Ứng dụng phương pháp 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS 20

2.3.2 Phương pháp thẩm định 21

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 23

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định mycotoxin trên thiết bị LC-MS/MS 24

3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ 24

3.1.2 Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng 25

3.2 Lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu 27

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 27

3.2.2 Khảo sát bước làm sạch 29

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 31

3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 31

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 36

3.4 Kết quả xác định ZEA và DON trong một số mẫu thực phẩm ngô 39

IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Giới hạn cho phép deoxynivalenol trong thực phẩm 5

2 Bảng 1.2 Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm 6

3 Bảng 1.3 Hàm lượng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU 7

4 Bảng 1.4 Hàm lượng ZEA (µg/kg) trong thực phẩm ở châu Âu 7

5 Bảng 1.5 Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010 8

6 Bảng 1.6 Ô nhiễm DON trong ngô tại Argentina từ 1999-2010 8

7 Bảng 1.7 Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia

8 Bảng 1.8 Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia

9 Bảng 1.9 Tóm tắt một số phương pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm

ZEA và DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc 10

10 Bảng 1.10 Các phương pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực

11 Bảng 1.11 Xác định độc tố vi nấm bằng phương pháp QuEChERS 12

12 Bảng 2.1 Các độc tố vi nấm được sử dụng trong nghiên cứu 17

13 Bảng 2.2 Pha các dung dịch chuẩn xây dựng đường chuẩn 19

14 Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích độc tố vi nấm bằng ESI(-)-MS/MS 24

15 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS đối vớ 25

16 Bảng 3.3 Chương trình gradient phân tích ZEA và DON 26

17 Bảng 3.4 So sánh các loại dung môi chiết đến độ thu hồi của ZEA và

18 Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng PSA và C18 đến độ thu

20 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của ZEA và DON 34

21 Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi của DON trên nền mẫu ngô 36

22 Bảng 3.9 Độ lặp lại và độ thu hồi của ZEA trên nền mẫu ngô 37

23 Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng các độc tố vi nấm trong một số sản

phẩm từ ngô tại Hà Nội tháng 5 - 2015 40

DANH MỤC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề báo động với toàn thể xã hội Số lượng cũng như mức độ nguy hiểm của các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó độc tố vi nấm là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc nhưng lại ít được đề cập đến

Độc tố vi nấm được sinh ra do nhiều loài nấm mốc khác nhau, chúng được phát hiện trên nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau Hiện nay, có đến hơn

400 loại độc tố vi nấm đã được xác định Trong đó, các loại độc tố vi nấm chính được quan tâm nhất bao gồm các aflatoxin, ochratoxin, fumonisin, deoxynivalenol, zearalenone…

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu xác định các độc tố vi nấm aflatoxin B1, B2, G1, G2, ochratoxin A… Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về phương pháp xác định các độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone trong thực phẩm, hơn nữa các phương pháp phân tích thông thường chỉ hướng đến phân tích riêng lẻ các độc tố mà chưa xác định đồng thời được chúng

Với lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xác định đồng thời độc tố vi

nấm deoxynivalenol và zearalenone trong một số sản phẩm thực phẩm bằng LC-MS/MS” Thực hiện khóa luận này chúng tôi nhằm tới 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời deoxynivalenol

và zearalenone bằng LC-MS/MS

2 Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng deoxynivalenol và zearalenone cho một số sản phẩm trên thị trường

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone

Độc tố vi nấm là chất chuyển hóa thứ cấp độc hại được sinh ra bởi các loài

nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria [38] Độc tố vi nấm có thể

được định nghĩa là “chất chuyển hóa của nấm mốc mà khi ăn phải, hít vào hoặc hấp thu qua da gây ra bệnh tật hoặc gây tử vong cho người và động vật” [26] Độc tố vi nấm gây ra một loạt các tác dụng độc hại Chúng là những chất gây ung thư, độc với

thần kinh, gây quái thai và gây suy giảm miễn dịch [22] [25]

Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như thối rễ, thân, bắp,

củ… một số loài còn sinh ra độc tố nấm lẫn tạp trong ngũ cốc Một số chất độc gây tác hại đến sức khỏe con người có thể kể đến như độc tố T-2 toxin, fumonisin, zearalenone, deoxynivalenol… dưới đây sẽ đề cập đến 2 loại độc tố hay gặp trong ngũ cốc, cây trồng tại Việt Nam: zearalenone, deoxynivalenol

1.1.1 Deoxynivalenol (DON)

1.1.1.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý

DON là một loại độc tố vi nấm thuộc nhóm trichothecen Đây là một nhóm các hợp chất có cấu trúc liên quan đến một hệ thống vòng tetracyclic sesquiterpenoid Khoảng 170 trichothecen đã được xác định [16] [15] và được chia thành bốn loại (A-D) dựa trên sự thay đổi nhóm chức hydroxyl và nhóm bên acetoxy Loại A, đại diện là HT-2 và T-2 toxin, loại B thường gặp là deoxynivalenol (DON), loại C và D thường ít gặp hơn [21]

DON hay còn gọi là vomitoxin được sinh ra bởi các loài F graminearum, F

độ ẩm trên 20% DON dễ tan trong một số dung môi phân cực như methanol, ethanol và acetonitril DON là chất rất bền nhiệt và bền với môi trường acid, không

bị ảnh hưởng của quá trình chế biến [29]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của deoxynivalenol 1.1.1.2 Độc tính

DON hoạt động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosome 60S dẫn đến ức chế tổng hợp protein ở tế bào nhân thực Deoxynivalenol đi vào tế bào và liên kết với ribosome, truyền tín hiệu cho RNA làm hoạt hóa enzyme protein kinase và hemoitopoeitic cell kinase Sự phosphoryl hóa yếu tố phiên mã nhờ enzyme mitogen-activedprotein kinase và kích hoạt apoptosis, gây ra các ảnh hưởng lâu dài

và độc tính trên miễn dịch [24]

Rất nhiều nghiên cứu trên động vật đã được thực hiện nhằm đánh giá độc tính và cơ chế gây độc của DON Mặc dù DON không độc hại như một số trichothecen khác như T2 hoặc HT-2, nhưng nó là một trong những chất gây ô nhiễm phổ biến nhất trong các loại ngũ cốc trên toàn thế giới Liều gây chết trung bình (LD50) ở chuột là 70 mg/kg thể trọng, và DON gây ra tác dụng ức chế miễn nhiễm trên chuột ở liều thấp 0,025 mg/kg thể trọng và còn nhạy cảm hơn ở lợn Trên người, DON có thể gây nôn, buồn nôn, chóng mặt, nhức đầu [29]

Không có bằng chứng thực nghiệm về dịch tễ học đối với khả năng gây đột biến và/hoặc gây ung thư của DON IARC phân loại DON thuộc nhóm 3 là nhóm ít

có bằng chứng gây ung thư trên người và động vật [8]

1.1.2 Zearalenone (ZEA)

1.1.2.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý

Zearalenone (ZEA) là một loại độc tố được sản xuất bởi một số loài

Fusarium như F culmorum, F cerealis, F equiseti, F verticillioides và F incarnatum [21] Nói chung, các loài Fusarium phát triển và xâm nhập vào cây

ra độc tố này cũng có thể xảy ra sau khi thu hoạch trong điều kiện bảo quản kém [4] Những loài này có thể sinh ra một số lượng nhỏ các chất chuyển hóa có liên quan, trong đó α –zearalenol và β-zearalenol là những dẫn xuất quan trọng nhất của zearalenone [27]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của zearalenone

ZEA tồn tại ở dạng tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy trong khoảng

thường [11]

ZEA hòa tan trong dung dịch kiềm, chloroform, acetonitrile và một số dung môi hữu cơ khác, trong khi không hòa tan trong nước, carbon disulfide và carbon tetrachloride Nó phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím (UV) và bước sóng

cực đại hấp thụ tia cực tím trong methanol ở 236, 274 và 316 nm [39]

1.1.2.2 Độc tính

ZEA có hoạt tính estrogen, khi vào cơ thể, ZEA và một số chất chuyển hóa

có liên quan, cạnh tranh liên kết với các thụ thể của estrogen Như vậy, độc tính của

nó có liên quan đến vấn đề sinh sản ở các loài động vật và có thể ở người [14] [36]

ZEA là chất có độc tính cấp tương đối thấp khi dùng đường uống, tuy nhiên độc tính tăng lên khi tiêm phúc mạc Ở động vật, tác dụng độc hại khi tiếp xúc với ZEA bao gồm ung thư, đột biến gen, độc tính trên sinh sản, tác động nội tiết, suy giảm miễn dịch Tính nhạy cảm trên sinh sản có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất chăn nuôi Vì vậy, khi vật nuôi mang thai, ZEA giảm tồn phôi và trọng lượng của thai nhi, ngoài ra, ZEA làm âm hộ sưng và đỏ, viêm âm hộ âm đạo, tắc hoặc không có sữa và sa trực tràng Ở giống đực, ZEA có thể làm giảm nồng độ testosterone, trọng lượng tinh hoàn, và sự sinh tinh [42]

IARC đánh giá khả gây ung thư của ZEA và kết luận rằng nó không phải chất gây ung thư trên người (nhóm 3) [8]

Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên người gần đây cho thấy ZEA có khả năng kích thích tăng trưởng của các tế bào có các thụ thể estrogen ở tuyến vú của con người [40] Từ đó có giả thuyết cho rằng ZEA có thể có một vai trò trong nguyên nhân của bệnh ung thư vú ở người [41] Hơn nữa, ZEA đã được tìm thấy trong các

mô nội mạc tử cung của phụ nữ bị ung thư tuyến và trong một số trường hợp tăng sản nội mạc tử cung Giữa năm 1978 và 1981, người ta nghi ngờ rằng ZEA một trong những tác nhân gây bệnh dậy thì sớm ở Puerto Rico [30]

1.1.3 Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2]

1.1.3.1 Giới hạn cho phép deoxynivalenol trong thực phẩm

Bảng 1.1 Giới hạn ô nhiễm deoxynivalenol trong thực phẩm

(µg/kg)

1.1.3.2 Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm

Bảng 1.2 Giới hạn ô nhiễm zearalenone trong thực phẩm

(µg/kg)

1.2 Hàm lượng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm

Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hàm lượng độc tố vi nấm đặc biệt là DON và ZEA trong thực phẩm trên thế giới Theo báo cáo từ SCOOP (Scientific Co-operation on Questions relating to Food) mục 3.2.10 “Dữ liệu tổng hợp sự có

mặt của độc tố vi nấm do Fusarium trong thực phẩm và đánh giá chế độ ăn hàng

ngày tại các nước thành viên liên minh châu Âu” [31] tại 11 nước, trong tổng số

11022 mẫu có 57 % mẫu dương tính với DON

Trong các đối tượng nhiễm DON, lúa mì là đối tượng nhiễm cao nhất Trong khi đó, đối với mặt hàng ngũ cốc, ngô là mặt hàng nhiễm DON với hàm lượng cao nhất Tỉ lệ mẫu ngũ cốc và bột sống nhiễm với hàm lượng cao ( ≥ 750 µg/kg) là 7%,

tỉ lệ mẫu thực phẩm ngũ cốc nhiễm với hàm lượng ≥ 500 µg/kg là 6 % [31]

Theo báo cáo của cơ quan thực phẩm châu Âu năm 2011 [4], lúa mì và ngô là mặt hàng nhiễm DON với tỉ lệ cao nhất, hàm lượng DON trung bình từ 37 µg/kg đến

594 µg/kg, có rất ít mẫu có hàm lượng DON vượt quá giới hạn cho phép là 750 µg/kg [10]

Bảng 1.3 Hàm lượng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU [4]

dương tính

Giá trị trung bình (µg/kg)

Giá trị lớn nhất (µg/kg)

Cũng trong báo cáo này, đối với ZEA, trong các loại hạt ngũ cốc cho người, ngô cũng là đối tượng nhiễm độc tố này với tần suất lớn nhất (44 %) và với hàm lượng trung bình tương đối cao (14 µg/kg) [4]

Bảng 1.4 Hàm lượng ZEA (µg/kg) trong thực phẩm ở châu Âu [4]

dương tính

Giá trị trung bình (µg/kg)

Giá trị lớn nhất (µg/kg)

Dữ liệu về sự có mặt của các độc tố vi nấm trong ngô trong quá trình bảo quản bao gồm cả DON và ZEA tại Argentina từ năm 1999-2010 được tổng hợp ở bảng 1.5 và bảng 1.6 [13]

Bảng 1.5 Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010 [13]

tính/ tổng số mẫu

Giá trị trung bình (µg/kg)

Giá trị lớn nhất (µg/kg)

Bảng 1.6 Ô nhiễm DON trong ngô tại Argentina từ 1999-2010 [13]

tính/ tổng số mẫu

Giá trị trung bình (µg/kg)

Giá trị lớn nhất (µg/kg)

Tại châu Á dữ liệu về hàm lượng DON và ZEA trong các sản phẩm thực phẩm còn hạn chế Một báo cáo của Setyabudi và Nuryono về sự nhiễm DON (2010) trong ngô và các sản phẩm từ ngô ở Indonesia [32] cho thấy tất cả các mẫu nhiễm loại độc tố này nhưng ở mức thấp hơn giới hạn cho phép là 750 µg/kg [10]

Bảng 1.7 Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2010 [32]

100-200 µg/kg

200-400 µg/kg

Khoảng hàm lượng (µg/kg)

Giá trị trung bình (µg/kg)

Trước đó, cũng trong nghiên cứu của Nuryono năm 2005 [23] về sự nhiễm ZEA trong các mẫu ngô và thực phẩm từ ngô, trong tổng số 51 mẫu có 11 mẫu dương tính với ZEA và 2 mẫu trong số mẫu dương tính có hàm lượng ZEA cao hơn nhiều (148 và 589 µg/kg) so với giới hạn cho phép là 100 µg/kg [10]

Bảng 1.8 Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2005 [23]

Độc tố vi

nấm

Tổng số mẫu

Số mẫu dương tính

Khoảng hàm lượng (µg/kg)

Hàm lượng trung bình (µg/kg)

1.3.1 Các phương pháp đã được thực hiện

Rất nhiều phương pháp đã được xây dựng và áp dụng để xác định DON và ZEA trong đó như TLC, ELISA, GC với kĩ thuật ECD hoặc MS , LC – UV hoặc FLD, và LC-MS Các phương pháp này tập trung vào xác định từng loại độc tố vi nấm hoặc nhóm độc tố riêng biệt, do đó có nhiều ưu điểm về tính đặc hiệu

Bảng 1.9 Tóm tắt một số phương pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm ZEA và

DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc

chuẩn

Làm sạch

Định lượng

Đặc điểm chung của các phương pháp này là sử dụng kỹ thuật làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm (IAC) Đây là kỹ thuật cho độ đặc hiệu cao, nhưng chi phí khá lớn Hơn nữa, do mỗi độc tố vi nấm cần có một phương pháp riêng nên gây lãng phí lớn khi thực hiện phân tích nhiều độc tố vi nấm trên một loại nền mẫu, như các nền mẫu ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc

Do đó, các tác giả trên thế giới hướng đến phương pháp để xác định đồng thời nhiều loại độc tố vi nấm trong thực phẩm, đặc biệt là ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc

Bảng 1.10 Các phương pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực hiện

ACN –

H 2 0 –AA (79:20:1)

Không tìm được cột thích hợp

MS–MS

LC–ESI-51% - 124%

0,5-100 µg/kg

ACN –

H 2 0 (84:16)

SPE -Oasis®HLB column

LC/ESI‐

MS/MS 64-114%

0,1 – 59,2 µg/kg

2012

[33]

Ngũ cốc

aflatoxins, ochratoxin A, ZEA, DON, fumonisins, T-2 toxin HT-2

ACN –

H 2 0 –AA (79:20:1)

Không làm sạch

UPLC-MS/MS

83,5- 107,3%

0,01 - 25 ng/g

2012

[9]

Ngũ cốc

DON, ZEA, toxin và các chất chuyển hóa

T-2-ACN –

H 2 0 –AA (79:20:1), loại béo bằng n- hexan

Không làm sạch

LC-MS/MS

80 - 110%

5 -13 ng/g

1.3.2 Phương pháp QuEChERS

QuEChERS là tên viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và Safe là phương pháp do hai nhà khoa học Anasstasiades và Lehotay phát triển để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả [5]

Phương pháp QuEChERS có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp trước đây:

- Nhanh (với 10 mẫu có thể tiến hành xử lý mẫu trong 30 phút)

- Đơn giản, dễ thực hiện (ít tốn thiết bị, dụng cụ đơn giản, tối thiểu được nguồn gây sai số)

- Ít tốn kém cho quá trình phân tích

- Tăng độ nhạy của phương pháp do dung dịch chiết không bị pha loãng nhiều lần

- Ổn định

- An toàn cho người và môi trường

Các tác giả đã ứng dụng nguyên tắc của phương pháp này để áp dụng đối với độc tố vi nấm Một số nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 1.11

Bảng 1.11 Xác định độc tố vi nấm bằng phương pháp QuEChERS

mẫu

Đối tượng phân tích Làm sạch Kỹ thuật

75-2,3-146 µg/kg

UPLC-60–

120%

21,74 µg/kg

0,11-Có thể nhận thấy điểm chung của các phương pháp QuEChERS là sử dụng các kỹ thuật sắc ký hiện đại như GC-MS và đặc biệt là LC-MS/MS Sỡ dĩ như vậy

là do phương pháp QuEChERS không có sự làm giàu mẫu nên cần phối hợp với các

kỹ thuật phân tích hiện đại, có độ nhạy tốt Trong đó, LC-MS/MS cho thấy có nhiều

ưu điểm về tính đặc hiệu, độ nhạy và độ chính xác

1.3.3 Phương pháp LC-MS/MS

Sắc kí lỏng khối phổ là một kỹ thuật mới nhưng đã được ứng dụng để phân tích độc tố vi nấm trên nhiều đối tượng khác nhau do có nhiều ưu điểm:

- Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lượng độc tố vi nấm ở mức thấp

- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z, do đó cùng với khả năng tách các chất nhờ HPLC thì phương pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều độc tố vi nấm trong cùng một lần chạy

- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lượng và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất

- Có khả năng phân tích được những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí, như các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt

Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phương pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ

1.3.3.1 Sắc kí lỏng (HPLC)

Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn) Khi tiến hành chạy sắc kí, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

a Pha tĩnh trong HPLC [1][3]

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 2 – 5 µm Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc kí lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC) và sắc kí pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các nhóm chức

- Sắc kí pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được alkyl hóa, không phân

- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực như

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

Chân không

a Nguồn ion hoá

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Các kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở

áp suất khí quyển (APCI) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI

Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế khoảng 1- 5kV Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện

và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có hai chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương ESI(+) và ion âm

Tứ cực có cấu tạo gồm 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này Tứ cực thứ 1 (Q1) và thứ 3 (Q3) có vai trò như là các bộ lọc khối Còn tứ cực thứ 2 (Q2) có vai trò như là buồng va chạm, tại đó các ion sau khi qua Q1 (ion mẹ) được bắn phá bởi năng lượng và khí trơ để tạo thành các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion này được lựa chọn tại Q3

c Bộ phận phát hiện:

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo

ra một tín hiệu của các ion dương tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo ra các electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron Cứ như vậy tín hiệu sẽ được khuếch đại và được ghi lại Tín hiệu này tỷ lệ thuận với lượng ion do đó tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Độc tố vi nấm

Đối tượng nghiên cứu là 2 độc tố vi nấm deoxynivalenol (DON) và zearalenone (ZEA)

Bảng 2.1 Các độc tố vi nấm được sử dụng trong nghiên cứu

2.1.1.2 Đối tượng phân tích

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

là các mẫu ngô đại diện cho nền mẫu ngũ cốc Đây là đối tượng thực phẩm có chứa nhiều nguy cơ nhiễm nhiều loại độc tố vi nấm nhất

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

2.1.2.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ hai lần (LC-MS/MS) gồm máy sắc

5500 của hãng ABSciex, Mỹ

- Máy lắc xoáy, IKA

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips

- Máy li tâm Z383K, Hermle

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

- Ống đong, phễu, giấy lọc

2.1.3 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Dung môi loại dùng cho sắc ký: methanol, acetonitril của Merck, Đức

Agilent, Mỹ

- Nước cất 2 lần thu được từ hệ thống cất nước Hamilton

- Dung môi chiết: Dung dịch acetonitril

ặc dụng cụ chứa có thể đậy kín Lắc trộn đều Mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích

được sử dụng cho một mẫu phân tích

2.1.4 Chất chuẩn

- Chuẩn gốc deoxynivalenol 200 µg/mL trong acetonitrile của Sigma Aldrich

- Chuẩn gốc zearalenone 50 µg/mL trong acetonitrile của Sigma Aldrich

2.1.5 Pha dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn trung gian DON 20 µg/mL Hút 0,5 ml dung dịch chuẩn DON 200 µg/ml pha vào bình định mức 5 mL với acetonitril

- Dung dịch chuẩn trung gian ZEA 1 nồng độ 2 µg/mL Hút 0,2 ml dung dịch chuẩn ZEA 50 µg/ml pha vào bình định mức 5 mL với acetonitril

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp có nồng độ DON 2000 ng/ml và ZEA

200 ng/ml Hút 0,5 ml dung dịch chuẩn DON 20 µg/ml và 0,5 ml dung dịch chuẩn ZEA 2 µg/ml pha vào bình định mức 5 mL với acetonitril để thu đƣợc các nồng độ trên

Acetonitrile (µL)

Nồng độ ZEA (ng/ml)

Nồng độ DON (ng/ml)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Khảo sát các điều kiện xác định độc tố vi nấm bằng LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: tìm các điều kiện tách sắc ký bao gồm pha động, pha tĩnh

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion phân tử; lựa chọn các ion sản phẩm phù hợp

2.2.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

Ứng dụng phương pháp QuEChERS và thực hiện các khảo sát:

- Khảo sát về dung môi chiết

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS

Nguyên tắc: Mẫu phân tích (với độ ẩm khoảng 80%, thêm nước nếu cần)

phân lớp giữa nước và acetonitril Chất phân tích được chiết vào lớp acetonitril sẽ được làm sạch qua chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với việc trộn một phần dịch chiết

với các chất hấp phụ như PSA, MgSO4, GCB, C18 để loại tạp chất Dịch chiết được phân tích bằng GC-MS(/MS) và/hoặc LC-MS/MS

2.3.2 Phương pháp thẩm định

2.3.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc

Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp chúng tôi thực hiện phân tích và

so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ

lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/2002 của Châu Âu

2.3.2.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỉ lệ tín hiệu nhiễu đường nền (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4) Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N= 3

LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đường nền

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn

có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được (trục tung y) vào nồng độ (trục hoành x), quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau của ZEA là 5, 20, 100 ng/ml và của DON là 50, 200, 1000 ng/ml và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo hệ số biến thiên CV (%).:

N i i

Trong đó:

n : Số lần thử nghiệm

- Độ thu hồi : R % =