nghiên cứu khả năng giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm trichoderma

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---oOo--- LƯU THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢM HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN TỪ NẤM MỐC CỦA VI KHUẨN LACTIC VÀ NẤM TRICHODERMA Chuyên ngành : Công n

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LƯU THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢM HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN TỪ NẤM MỐC CỦA VI KHUẨN LACTIC

VÀ NẤM TRICHODERMA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-oOo -

LƯU THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢM HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN TỪ NẤM MỐC CỦA VI KHUẨN LACTIC

VÀ NẤM TRICHODERMA

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Thị Thanh Thủy

TS Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Lưu Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thị Thanh Thủy và TS Nguyễn Văn Giang, cô và thầy là người đã tận tình chỉ bảo, hướng

dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Công nghệ thực

phẩm, Công nghệ sinh học của Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã giảng dạy, dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại Học viện

Tôi xin trân trọng cảm ơn các anh, chị làm việc tại phòng QC & Lab của Công

ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và cộng tác với tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, người thân và bạn bè đã khích lệ, động

viên tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015

Học viên

Lưu Thị Phương Thảo

1.5 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

2.1 Giới thiệu chung về nấm mốc và độc tố nấm mốc 4 2.2 Độc tố aflatoxin: đặc điểm, cơ chế gây bệnh và tiêu chuẩn quy định 5

2.4.2 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin tại Việt Nam 15

2.5 Giới thiệu vi khuẩn lactic và khả năng kháng nấm mốc, độc tố nấm mốc 16

2.5.2 Các chất chuyển hóa kháng nấm được sản xuất bởi vi khuẩn lactic 17

2.6.4 Tình hình nghiên cứu tính đối kháng của nấm Trichoderma với nấm mốc

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị, môi trường sử dụng trong nghiên cứu 22

3.3.1 Xác định nấm mốc sinh độc tố aflatoxin bằng quan sát hình thái và bào tử 24 3.3.2 Xác định khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn lactic bằng phương

pháp che phủ sửa đổi của Magnusson và Schnurer 26 3.3.3 Xác định khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ dịch chiết vi

khuẩn lactic bằng phương pháp đục lỗ thạch 26 3.3.4 Phương pháp thu dich chiết của vi khuẩn lactic và nấm Trichoderma 27 3.3.5 Xác định khả năng ức chế nấm mốc sinh độc của dịch chiết vi khuẩn

lactic và dịch chiết nấm Trichoderma ở các nồng độ khác nhau 27 3.3.6 Đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố

aflatoxin bằng phương pháp đồng nuôi cấy 27 3.3.7 Đánh giá hoạt tính đối kháng của dịch chiết nấm Trichoderma bằng phương

pháp bổ sung vào môi trường nuôi cấy lỏng ở các nồng độ khác nhau 29 3.3.8 Đánh giá khả năng giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm của dịch

chiết vi khuẩn lactic, dịch chiết nấm Trichoderma bằng phương pháp ELISA 30

PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết quả sàng lọc mẫu chứa độc tố aflatoxin và phân lập chủng nấm mốc

4.1.1 Kết quả sàng lọc mẫu chứa độc tố aflatoxin 34 4.1.2 Kết quả phân lập và xác định nấm sinh độc tố aflatoxin 34 4.2 Kết quả đánh giá hoạt tính của vi khuẩn lactic với nấm sinh độc tố

aflatoxin và aflatoxin trong ngô nguyên liệu 37 4.2.1 Kết quả xác định khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ vi

4.2.2 Kết quả xác định khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ dịch

4.2.3 Kết quả bổ sung dịch chiết vi khuẩn lactic ở các nồng độ khác nhau vào

4.2.4 Kết quả xác định khả năng giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm của

4.3 Kết quả đánh giá hoạt tính của nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố

aflatoxin và aflatoxin trong ngô nguyên liệu 43 4.3.1 Kết quả đánh giá khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm sinh

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

GRAS Generally Recognized as Safe Công nhận là an toàn

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan IARC International Agency for Research on

Cancer

Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế

về Ung thư

LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic

LD50 Medium letalisdosis Liều lượng gây chết trung bình MRS Man, Rogosa, Sharpe

PDA Potato Dextro Agar Thạch khoai tây

RNA Ribonucleic acid

ST Sterigmatocystin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.3 Giá trị LD 50 đối với aflatoxin B1 9 Bảng 2.4 Giới hạn aflatoxin trong thực phẩm theo QCVN 8-1:2011/BYT 10

Bảng 3.2 Đặc điểm nhận dạng nấm mốc A flavus và A parasiticus 25 Bảng 3.3 Chia số lượng mẫu theo mục đích thí nghiệm: 30 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái các khuẩn lạc xuất hiện sau 5 ngày nuôi cấy 35 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và bào tử của 2 chủng nấm mốc 36

Bảng 4.4 Kết quả theo dõi hoạt tính kháng khuẩn của các chủng lactic 38

Bảng 4.5 Hiệu quả ức chế nấm mốc A parasiticus bằng dịch nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 4.6 Khối lượng bào tử nấm A.parasiticus nuôi cấy trong môi trường lỏng

Bảng 4.7 Khối lượng bào tử nấm A.parasiticus nuôi cấy trong môi trường lỏng

Bảng 4.8 Nồng độ độc tố aflatoxin trong mẫu ngô 42

Bảng 4.9 Hiệu quả ức chế của nấm đối kháng Trichoderma đối với nấm mốc

sinh độc tố bằng phương pháp đồng nuôi cấy 44

Bảng 4.10 Năng suất sinh khối khô của A flavus phát triển trong môi trường PD

Bảng 4.11 Năng suất sinh khối khô của A parasiticus phát triển trong môi trường

PD lỏng có bổ sung dịch chiết của Trichoderma 46 Bảng 4.12 Hàm lượng độc tố aflatoxin trên các mẫu ngô thí nghiệm 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.2 Tổng hợp các aflatoxin bởi tiền chất của nó tức là Sterigmatocystin

(ST) và O-methyl sterigmatocystin (OST) 7

Hình 2.3 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) của nấm A flavus 12

Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lac (A) và bào tử (B) của nấm A.parasiticus 13

Hình 2.5 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) của nấm Trichoderma 18 Hình 3.1 Các bước sàng lọc mẫu ngô nhiễm mốc chứa độc tố aflatoxin 24 Hình 3.2 Các bước xác định nấm sinh độc tố aflatoxin 26 Hình 3.3 Giới thiệu về phương pháp đồng nuôi cấy 28 Hình 3.4 Các bước chuẩn bị mẫu ngô thí nghiệm 30 Hình 3.5 Các bước chuẩn bị mẫu phân tích aflatoxin 31 Hình 3.6 Các bước định lượng aflatoxin trong mẫu ngô nguyên liệu 33

Hình 4.2 Kết quả phân lập nấm sinh độc tố aflatoxin : 35 Hình 4.3 Ảnh thể hiện khả năng ức chế nấm mốc của vi khuẩn lactic 39 Hình 4.4 Sự ức chế của dịch chiết vi khuẩn lactic đối với tăng trưởng của nấm

A parasiticus (1) dịch chiết vi khuẩn lactic sau ly tâm; (2) thử nghiệm của chủng Lab 6; (3) thử nghiệm của chủng Lab19 40

Hình 4.5 Bào tử nấm A parasiticus sau khi sấy 41

Hình 4.6 Kết quả khả năng ức chế A parasiticus của nấm Trichoderma 43

Hình 4.7 Kết quả khả năng ức chế A flavus của nấm Trichoderma 44

Hình 4.8 A flavus phát triển trong môi trường PD có bổ sung dịch chiết

Hình 4.9 A parasiticus phát triển trong môi trường PD lỏng có bổ sung dịch

chiết của Trichoderma và thu sinh khối 46

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Ngô là nông sản đứng thứ ba về sản lượng và đứng đầu trong nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Với điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta thì ngô lại là nguồn

cơ chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển Độc tố aflatoxin được sản sinh bởi các loài

nấm Aspergillus như Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin là độc tố

nguy hiểm nhất, gây độc cho người và gia súc như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan), gây quái thai, gây đột biến… thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong Hàng năm, hàng trăm triệu tấn ngô bị nhiễm aflatoxin và chúng ta không thể vì vậy mà không sử dụng số lượng ngô nhiễm độc đó Cả thế giới đã nghiên cứu và tìm ra rất nhiều phương pháp để làm giảm hàm lượng aflatoxin có trong thức ăn

để đưa nó về hàm lượng cho phép Có rất nhiều biện pháp được sử dụng như biện pháp hóa học, vật lý học, sinh học, trong số đó, kiểm soát sinh học là cách tiếp cận đầy hứa hẹn,

mang tính an toàn cao Một số loài vi khuẩn như Bacillus, Lacto-bacillus, Pseudomonas,

Ralstonia , Burkholderia spp…và một số loài nấm của giống nấm Trichoderma đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus spp và có khả năng giảm độc tố aflatoxin

do chúng gây ra (Reddy et al., 2010) Trong nghiên cứu này, 30 chủng lactic và giống nấm

Trichoderma được thực hiện một loạt các thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin và quan trọng hơn là nó giảm được hàm lượng aflatoxin trong ngô nguyên liệu

Các phương pháp thực hiện thí nghiệm như phương pháp sàng lọc mẫu có chứa

độc tố aflatoxin của Maupin et al., 2003, phương pháp che phủ Magnusson & Schnurer

(2000), phương pháp đục lỗ thạch, phương pháp đồng nuôi cấy và kỹ thuật Elisa Kết quả, chúng tôi đã phân lập được hai chủng nấm mốc sinh độc tố nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

là A flavus và A parasiticus từ các mẫu ngô nguyên liệu Xác định được hai chủng vi khuẩn Lab 6 và Lab 19 chỉ có khả năng ức chế nhẹ nấm mốc A parasiticus, không có khả

năng giảm hàm lượng aflatoxin trên ngô nguyên liệu Xác định được nấm mốc

Trichoderma có khả năng ức chế cả hai loại nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đã phân lập

được với hiệu quả đối với nấm A flavus (PIRG = 63,51 %) cao hơn A parasiticus (PIRG = 60,22%) sau 7 ngày nuôi cấy và dịch chiết nấm Trichoderma có khả năng làm giảm hàm

lượng độc tố aflatoxin sinh ra bởi nấm mốc trên cả môi trường lý thuyết và thực tế Đây là bước khởi đầu để nghiên cứu làm giàu chất kháng nấm sinh độc tố và tạo chế phẩm

THESIS ABSTRACT

Corn is the third agricultural production and head of the ingredients of animal feed With hot and humid climatic conditions of our country, the corn is ideal substrate

source for mold growth Aflatoxin produced by Aspergillus fungi like Aspergillus

parasiticus and Aspergillus flavus Aflatoxin is the most dangerous toxins to humans and

animals as acute effects, damage to the liver (liver cancer), teratology, mutagenic even the high doses may lead to dead Every year, hundreds of millions of tons of corn are contaminated by aflatoxin and we can not be so without the use of such contaminated maize The world has researched and found so many ways to reduce the levels of Aflatoxins in food to the allowable limit There are many measures that are used as measures of chemistry, physics, biology in which the biological control is a high safety

promising approach Some bacteria like Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Ralstonia,

Burkholderia spp and some fungi of the genus Trichoderma has shown its ability to inhibit the growth of Aspergillus spp and potentially reduce aflatoxin contamination

caused by them (Reddy et al , 2010 ) In this study, 30 strains of lactic and fungus

Trichoderma is proved by a series of experiments to assess the ability to inhibit fungal aflatoxin and more importantly, it reduces the levels of aflatoxins in raw corn

The experimental methods such as sample screening method containing aflatoxin

of Maupin et al., 2003, Magnusson & Schnurer cover method (2000 ), perforated method, co-culturing method and Elisa techniques As a result, we have isolated two

strains of aflatoxin mold which are A flavus and A parasiticus from corn samples Identify 2 strains of Lab 6 and Lab 19 which are only capable of inhibiting A

parasiticus lightly and unable to reduce the levels of aflatoxins in raw corn

Determination of Trichoderma fungi with capability of inhibiting both the 2 types of mold toxins aflatoxin isolated effectively against A flavus (PIRG = 63.51 %) higher than A parasiticus (PIRG = 60.22 % ) after 7 days of culture and Trichoderma fungal

extracts capable of reducing the levels of aflatoxin produced by mold both theory and practice This is the first step to study toxins antifungal enrichment and make preparations

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong nông nghiệp, nếu trồng trọt coi giống là biện pháp hàng đầu thì chăn nuôi động vật phải coi thức ăn là biện pháp số một Trong chăn nuôi, chi phí thức

ăn chiếm 65-70% giá thành các loại sản phẩm động vật Độ an toàn của sản phẩm động vật chịu chi phối bởi nhiều yếu tố nhưng quan trọng hơn cả là yếu tố về thức ăn Thức ăn chăn nuôi không an toàn thì thực phẩm khó an toàn Ở châu Âu, nhiều nước giành 50-60% diện tích nông nghiệp trồng cỏ nuôi gia súc Ở Châu

Á, nhiều nước dành 40-50% tổng sản lượng lương thực làm thức ăn chăn nuôi tiểu gia súc, gia cầm như Trung Quốc, Thái Lan Vì vậy việc nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi bao gồm các kĩ thuật bảo quản nguyên liệu, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên thức ăn đó, đồng thời chế biến chúng thành những thực phẩm

có giá trị dinh dưỡng cao là một vấn đề quan trọng đang được các tổ chức quốc tế cũng như các nhà khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm Phòng chống nấm mốc và độc tố nấm mốc trên các mặt hàng thực phẩm, thức ăn chăn nuôi là phương pháp tốt nhất bảo vệ con người và động vật khỏi các tác động xấu đến sức khỏe

Ở nước ta, các nông sản và các sản phẩm từ chăn nuôi đóng một vai trò rất quan trọng Ngô là nông sản đứng thứ ba về sản lượng và đứng đầu trong nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Với điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam thì ngô là nguồn cơ chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển Khi phát triển trên ngô, nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng, gây ra tổn thất về lượng cũng như về chất của hạt Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát triển chúng sinh ra các loại độc tố (mycotoxin) khác nhau Mycotoxin thường gặp là aflatoxin, fumonisins, ochratoxin, zearalenone… Những độc tố này có khả năng theo thức

ăn vào cơ thể, gây độc cho con người và động vật

1.2 GIẢ THIẾT KHOA HỌC

Độc tố aflatoxin được sản sinh bởi các loài nấm Aspergillus như

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin là độc tố nguy hiểm nhất,

gây độc cho người và gia súc như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan), gây quái thai, gây đột biến… thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới

tử vong Trong rất nhiều loại aflatoxin thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất Vì vậy việc giảm hàm lượng độc tố aflatoxin trong nguyên liệu cho thức ăn chăn nuôi là rất cần thiết

Hiện nay, các phương pháp vật lý, hóa học, và sinh học đều được chú trọng nghiên cứu Trong số đó, kiểm soát sinh học là cách tiếp cận đầy hứa hẹn, do sự an

toàn của nó Một số loài vi khuẩn như Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas,

Ralstonia , Burkholderia spp…và một số loài nấm thuộc Trichoderma đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus spp và có khả năng giảm độc tố aflatoxin do chúng gây ra (Reddy et al., 2010)

Vi khuẩn lactic (LAB) được công nhận là nhóm vi khuẩn an toàn (GRAS) không những thế một số loại còn ức chế được nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

Theo Magnusson et al., (2003), ba cơ chế có thể giải thích được hiệu quả kháng

khuẩn của LAB: (i) khả năng sản sinh axit hữu cơ, hạ thấp pH ; (ii) khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng và (iii) khả năng sản sinh các hợp chất đối kháng

Có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm của vi khuẩn lactic, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc và giảm hàm lượng độc tố của nó

Bên cạnh đó, việc sử dụng các chủng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma

để kiểm soát hàm lượng aflatoxin do Aspergillus spp gây ra ở Ấn Độ cũng đã có kết quả tốt (Mausam et al., 2007)

Khả năng đối kháng của Trichoderma chủ yếu thông qua hoạt động của hệ enzyme ngoại bào mà nó sinh ra Mỗi chủng Trichoderma ssp khác nhau sẽ có

những hệ enzyme khác nhau như catalase, pectinase, protease hay cellulase Kết

quả này cho thấy, Trichoderma có thể được khai thác như một đối tượng tiềm

năng cho lĩnh vực kháng khuẩn, chống nấm mốc và giảm hàm lượng độc tố

aflatoxin do chúng sinh ra (Emma et al., 2008)

Tuy nhiên, hướng ứng dụng nấm Trichoderma trong kiểm soát nấm mốc

sinh độc tố aflatoxin và giảm hàm lượng độc tố aflatoxin trên nông sản chưa được quan tâm nghiên cứu mà chủ yếu là theo hướng phòng trừ nấm bệnh hại rễ cây

trồng, sản xuất phân hữu cơ vi sinh Trichomix (Nguyen Thi Thanh et al., 2014)

Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu khả năng giảm hàm lượng độc tố Aflatoxin

từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm Tricoderma” được thực hiện để khảo sát

khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin và giảm hàm lượng độc tố aflatoxin

trên ngô, từ đó góp phần ứng dụng trên các sản phẩm nông sản khác

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu đánh giá được khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

bởi chủng vi khuẩn lactic và nấm đối kháng Tricoderma

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc sinh độc tố aflatoxin;

- Nghiên cứu được khả năng ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin của vi

khuẩn lactic và nấm đối kháng Trichoderma;

- Nghiên cứu được khả năng ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ dịch

chiết của vi khuẩn lactic và dịch chiết nấm Trichoderma;

- Nghiên cứu khả năng giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm mốc của

vi khuẩn lactic và nấm Trichoderma;

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 đến tháng 11 năm 2015

- Luận văn được thực hiện tại Khoa công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và phòng Lab - công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam chi nhánh Xuân Mai - Hà Nội

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1.5.1.Những đóng góp mới

Đề tài đã xác định được nấm Trichoderma có khả năng ức chế nấm

Aspergillus spp sinh độc tố aflatoxin và có khả năng giảm hàm lượng độc tố aflatoxin trong ngô nguyên liệu

1.5.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả đề tài đã bổ sung thêm cơ sở dữ liệu khoa học về cơ chế kháng

nấm sinh độc tố và độc tố của các chủng Trichoderma spp thu được

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ NẤM MỐC

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của một số loại nấm mốc Một loài nấm mốc có thể sản xuất nhiều độc tố khác nhau và một độc tố nấm mốc cũng có thể được sản xuất bởi nhiều loài nấm khác nhau

Những loài nấm mốc sinh độc tố này có thể phát triển trong lúc canh tác, thu hoạch, dự trữ, sản xuất chế biến thức ăn khi điều kiện thuận lợi

Các độc tố nấm mốc được đề cập đến nhiều là aflatoxin, ochratoxin, patulin, trichothecenes, fumonisin, zearalenone

Bảng 2.1 Các loại độc tố thường gặp

Aflatoxin Aspergillus flavus và A parasiticus Các loại hạt có dầu,

ngô, lạc, sữa

Trichothecenes Chủ yếu là Fusarium Các loại ngũ cốc

Ochratoxin A Penicillium verrucosum và A ochraceus Lúa mỳ, lúa mạch

Fumonisins Fusarium moniliorme Ngô

Zearalenone Fusarium spp. Ngũ cốc, dầu, tinh bột

Độc tố nấm mốc có tính bền vững với nhiệt độ cao và không bị tiêu hủy trong quá trình chế biến thức ăn thông thường Tùy theo từng loại mà độc tố nấm mốc có thể gây nhiễm độc cấp tính và mạn tính Triệu chứng nhiễm độc cấp tính ở gia súc thường là các tổn thương về gan và thận, nhiễm độc hệ miễn dịch hoặc mất tác dụng của hoóc môn có liên quan Nhiễm độc nhẹ hơn, có nghĩa không có các triệu chứng bệnh cấp tính do lượng độc tố hình thành gây nên, có thể là bệnh ung

thư, ảnh hưởng di căn hay không hình thành phôi thai (Đậu Ngọc Hào et al , 2003) Theo Trần Văn An et al., 1997 thì độc tố phổ biến của loại nấm mốc

Aspergillus và Penicillium trong thực tế là aflatoxin và ochratoxin A Aflatoxin

gây nhiễm độc gan Triệu chứng thường gặp là bệnh về gan làm cho gan có màu xám xanh Ochratoxin gây ra các tổn thương ở thận, làm mất chức năng lọc nước trong cơ thể vật nuôi Như đa số các loại độc tố nấm mốc khác, hai loại độc tố

nấm mốc làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm sự tăng trưởng cũng như làm suy yếu hệ miễn dịch

Nhiều năm trước, người ta cho rằng, độc tố nấm mộc ở mỗi nơi thì khác nhau do điều kiện địa lý của từng khu vực Chẳng hạn như aflatoxin thì thường được tìm thấy ở khu vực nhiệt đới, trong khi đó thì zearalenon thường tìm thấy ở

xứ ôn đới Tuy vậy, ngày nay nguyên liệu thức ăn (khô dầu đậu tương, ngô, dầu cọ ) được mua bán, vận chuyển từ khu vực này đến khu vực khác; vì thế, cộng hưởng của các loại mycotoxin là điều dễ hiểu

Với khu vực châu Âu, quy định gắt gao về mức mycotoxin không những

đã ảnh hưởng rất lớn đến các thành viên trong Liên minh châu Âu, ngành chế biến thức ăn gia súc và ngành thực phẩm mà còn ảnh hưởng đến các quốc gia mà hiện nay đang nhập khẩu các sản phẩm nông nghiệp vào châu Âu Mycotoxin không những hiện diện trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt mà còn chuyển qua thịt, sữa, trứng và các sản phẩm từ nuôi trồng thủy sản như tôm, cá Thiệt hại kinh tế do mycotoxin gây ra có thể lên đến hàng triệu USD mỗi năm và ảnh hưởng nhiều nhất cho các nhà chăn nuôi, sản xuất thức ăn gia súc và thực phẩm cho con người

Tóm lại, tác hại của mycotoxin bằng đơn chất hay kết hợp sẽ gây ra hiện tượng

sau (đôi khi thể hiện nhiều hiện tượng trên 1 cá thể) (Trần Văn An et al., 1997)

- Giảm lượng thức ăn vào, giảm năng suất;

- Suy yếu hệ thống miễn nhiễm (giảm lượng kháng thể trong cơ thể);

- Gia tăng mức độ nhạy cảm đối với bệnh tật;

- Hư hại các cơ quan nội tạng (gan, thận, bộ phận sinh dục);

- Năng suất sản xuất kém (giảm tỷ lệ thụ thai, sẩy thai, âm hộ sưng to, động dục giả);

- Mối nguy hại cho sức khỏe của người tiêu dùng khi thực phẩm có nhiễm mycotoxin;

- Có khả năng phân hủy sinh học khi loại thải (theo phân vật nuôi)

2.2 ĐỘC TỐ AFLATOXIN : ĐẶC ĐIỂM, CƠ CHẾ GÂY BỆNH VÀ TIÊU CHUẨN QUY ĐỊNH

2.2.1 Khái quát về độc tố aflatoxin

Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi nấm Aspergilus, đặc biệt A flavus và A parasiticus A flavus chỉ sản xuất độc tố aflatoxin B, trong

khi A parasiticus sản xuất cả aflatoxin B và G Trong số 18 loại khác nhau của

độc tố aflatoxin, như B1, B2, G1, G2, P, Q, M1, M2, B2a… đã được xác định Thường gặp nhất là aflatoxin B1, B2, G1, G2, sau đó là aflatoxin M1 và M2 trong sữa Aflatoxin là những hợp chất có độc tính cao, gây đột biến, gây quái thai và gây ung thư đã được biết đến như tác nhân gây bệnh ở gan và ung thư gan

ở người Aflatoxin B1 được phân loại theo Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về Ung thư (IARC) là chất gây ung thư nhóm 1A Liều độc cho gia súc khác nhau thay đổi từ 300-700 ppb, ảnh hưởng đến việc tăng cân và chế độ ăn uống; làm suy giảm hệ thống miễn dịch và cũng gây ra chậm phát triển (Nabil Saad, 2004; Victoria, 2000; Roberts, 2002)

- Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc, ngô, đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng… hay trên các loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc có nguồn gốc từ hạt ngũ cốc

2.2.2 Cấu trúc hóa học của aflatoxin

Độc tố aflatoxin là difurocoumarolactones (dẫn xuất difurocoumarin) Cấu trúc của chúng bao gồm một vòng bifuran liên kết lại thành một hạt nhân coumarin với một vòng pentenone (trong aflatoxin B và M) hoặc một vòng sáu lacton trong aflatoxin G Bốn hợp chất này được tách ra bởi các màu sắc của huỳnh quang của chúng dưới sóng dài (Devero, 1999) chiếu sáng cực tím (B = blue, G = green) Hai aflatoxin khác M1 và M2 được phân lập từ nước tiểu, sữa và xác định là chất chuyển

hóa aflatoxin B1, B2 của động vật có vú (Patterson et al., 1978)

Hình 2.1 Các dạng cấu trúc của aflatoxin 2.2.3 Quá trình tổng hợp aflatoxin

Các con đường sinh tổng hợp aflatoxin, tương tự tổng hợp axit béo, bao gồm ít nhất 18 phản ứng chuyển đổi đa enzyme khởi xướng bởi tổng hợp

polypeptide từ acetate Việc đầu tiên ổn định trung gian xuất hiện trong tổng hợp của nó là axit Norsolorinic (NOR) Quá trình chuyển đổi của sterigmatocystin (ST) đến O-methylsterigmatocystin (OMST) và sau đó OMST aflatoxin (Hình

2.2), cuối cùng duy nhất aflatoxin được sản xuất bởi nấm A flavus và A

parasiticus (Wang et al., 2008)

Hình 2.2 Tổng hợp các aflatoxin bởi tiền chất của nó tức là

Sterigmatocystin (ST) và O-methyl sterigmatocystin (OST)

2.2.4 Tính chất hóa lý của aflatoxin

- Aflatoxin là chất kết tinh, dễ tan trong các dung môi tương đối phân cực như chloroform, methanol, dimethyl sulfoxide và hòa tan trong nước đến mức 10-20 mg/lít Chúng có khả năng phát huỳnh quang và hấp phụ mạnh tia tử ngoại (365 nm) ở các mức độ khác nhau Aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang xanh da trời trong khi G1 và G2 phát huỳnh quang màu xanh nước biển

- Aflatoxin là hết sức bền khi không có ánh sáng và đặc biệt là tia cực tím, thậm chí ở nhiệt độ vượt quá 1000C Dung dịch được chuẩn bị trong chloroform hoặc benzen là ổn định trong nhiều năm nếu giữ lạnh và để trong bóng tối Các vòng lacton làm cho chúng dễ bị thủy phân bởi kiềm, các quá trình với sự tham gia của ammonia hoặc hypochlorite đã được nghiên cứu là phương tiện để loại bỏ aflatoxin từ các mặt hàng thực phẩm Nếu xử lý kiềm nhẹ, axit hóa sẽ đảo ngược các phản ứng để biến đổi các aflatoxin ban đầu Trong axit, độc tố aflatoxin B1 và G1 được chuyển đổi thành các độc tố aflatoxin B2a và G2a bằng cách thêm chất xúc tác axit của nước qua nối đôi của vòng furan Các chất phản ứng oxy hóa phản ứng lại và các phân tử mất các đặc tính phát huỳnh quang của chúng

Bảng 2.2 Tính chất hóa lý của aflatoxin

phân tử

Khối lượng phân tử

Điểm nóng chảy

Hấp thụ tối đa UV (e),

nm, methanol

B1 C 17 H 12 O 6 312 268-269 12400 21800 B2 C 17 H 14 O 6 314 286-289 12100 24000 G1 C17H12O7 328 244-246 9600 17700 G2 C 17 H 14 O 7 330 237-240 8200 17100 M1 C 17 H 12 O 7 328 299 14150 21250 (357) M2 C 17 H 14 O 7 330 293 12100 (264) 22900 (357)

2.2.5 Độc tính của aflatoxin

a Ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Độc tính cấp tính: được đặc trưng bởi sốt cao, nước tiểu màu đậm, nôn,

phù nề chân, vàng da, tăng huyết áp tĩnh mạch cửa và tỷ lệ tử vong cao Căn bệnh này phổ biến ở những người nghèo, những người này bị hạn chế về kinh tế phải tiêu thụ ngô xấu có chứa aflatoxin khoảng 6,25-15,6 ppm, mỗi người trung

bình mỗi ngày hấp thụ khoảng 2-6 mg aflatoxin (Krishnamachari et al., 1975a and 1975b; Keeler et al., 1983)

Độc tính mãn tính: Aflatoxin B1 cũng đã được chứng minh là một nguyên

nhân gây ra ung thư biểu mô tế bào gan của con người (HCC) Aflatoxin B1 liên kết với DNA và gây ra những thay đổi cấu trúc DNA với các kết quả là đột biến gen

(Groopman et al., 1985) Nhiễm độc tố aflatoxin, các bệnh do virus gây ra và các

yếu tố di truyền đã được đề xuất là nguyên nhân của xơ gan ở trẻ em Có bằng chứng cho thấy trẻ em tiếp xúc với sữa mẹ nhiễm aflatoxin và các mặt hàng ăn uống như dầu lạc chưa qua tinh chế có thể bị xơ gan Trẻ em suy dinh dưỡng cũng dễ bị

xơ gan khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm Một số nhà nghiên cứu đã đề xuất aflatoxin như một nguyên nhân của hội chứng Reye ở trẻ em ở Thái Lan, New Zealand…

b Ảnh hưởng đến động vật

Aflatoxin có thể gây ung thư, ngộ độc mãn tính hoặc có dấu hiệu bệnh tùy thuộc vào loài, tuổi của động vật, liều lượng và thời gian tiếp xúc với aflatoxin (Smith, 2002) Tất cả các loài động vật dễ bị nhiễm aflatoxin, nhưng dịch xảy ra

chủ yếu ở lợn, cừu và gia súc (Radostits et al., 2000) Thịt bò và bò sữa dễ bị

nhiễm aflatoxin hơn so với cừu hoặc ngựa Các con động vật còn non của tất cả các loài nhạy cảm hơn so với động vật trưởng thành với những tác động của

aflatoxin Động vật mang thai và đang phát triển ít nhạy cảm hơn so với gia súc

non, nhưng lại nhạy cảm hơn động vật trưởng thành (Cassel et al., 1988) Động

vật cho con bú có thể bị ảnh hưởng do tiếp xúc với các chất chuyển hóa aflatoxin

tiết ra trong sữa (Jones et al., 1994) Đối với các loài khác nhau, các giá trị LD50

của aflatoin B1 cũng khác nhau từ 0,03-18 mg/kg trọng lượng cơ thể

- Giai đoạn 3: Tiêu giảm sự tổng hợp DNA và RNA dẫn đến ức chế hoạt động của RNA của chất tế bào, RNA của nhân cũng bị rối loạn;

- Giai đoạn 4: Biến đổi hình thái hạt nhân Các aflatoxin gây ức chế các hoạt tính enzyme, dẫn đến sự rối loạn mô hạt nhân;

- Giai đoạn 5: Tiêu giảm sự tổng hợp protein Đây là hậu quả cuối cùng

và cũng là nguy hiểm nhất gây ra ung thư biểu mô tế bào gan

Bảng 2.3 Giá trị LD 50 đối với aflatoxin B1

2.2.6 Các quy định về aflatoxin trong thực phẩm

Trên thế giới (Richard Lawley, 2013):

- EU: EU đặt ra giới hạn cho aflatoxin B1 và cho tổng số aflatoxin (B1, B2, G1và G2) trong các loại hạt, trái cây sấy khô, ngũ cốc và các loại gia vị Giới hạn khác nhau tùy theo loại hàng hóa, nhưng phạm vi 2-12 mg/kg cho B1 và 4-

15 mg/kg cho tổng số aflatoxin Ngoài ra còn có một giới hạn 0,05 mg/kg đối với aflatoxin M1 trong sữa và sản phẩm sữa Giới hạn 0,1 mg/kg cho B1 và 0,025

mg/kg cho M1 đã được đề ra cho các loại thực phẩm cho trẻ sơ sinh

- Hoa Kỳ: Quy định an toàn thực phẩm của Mỹ bao gồm một giới hạn 20 mg/kg cho tổng aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) trong tất cả các loại thực phẩm trừ sữa và một giới hạn là 0,5 mg/kg cho M1 trong sữa Giới hạn cao hơn áp dụng trong thức ăn chăn nuôi

- Các nước khác: Cả Australia và Canada thiết lập giới hạn cho tổng aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) trong các loại hạt là 15 mg/kg Điều này cũng giống như là giới hạn quốc tế đề nghị cho đậu phộng nguyên do Ủy ban Codex Alimentarius

Quy chuẩn Việt Nam

Bảng 2.4 Giới hạn aflatoxin trong thực phẩm theo QCVN 8-1:2011/BYT

Aflatoxin M1

1

Lạc và các loại hạt có dầu khác sử dụng làm thực

phẩm hoặc làm thành phần nguyên liệu của thực

phẩm (không bao gồm lạc và các loại hạt có dầu

khác sử dụng để sản xuất dầu thực vật)

2

Hạt Almonds, hạt dẻ cười (pistachios), nhân hạt mơ

(apricot kernels) sử dụng làm thực phẩm hoặc làm

thành phần nguyên liệu của thực phẩm

3

Hạt Hazelnuts sử dụng làm thực phẩm hoặc làm

thành phần nguyên liệu của thực phẩm

Aflatoxin M1

4

Các loại hạnh nhân khác (không bao gồm các sản

phẩm quy định trong mục 2, 3) sử dụng làm thực phẩm

hoặc làm thành phần nguyên liệu của thực phẩm

Sử dụng trực tiếp không cần sơ chế (bao gồm sản

phẩm chế biến từ các loại hạnh nhân này)

5

Quả khô sử dụng làm thực phẩm hoặc làm thành

phần nguyên liệu của thực phẩm

Ngô và gạo, phải sơ chế trước khi sử dụng làm

thực phẩm hoặc làm thành phần nguyên liệu của

Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc (processed

cereal-based food) và các thực phẩm khác dành cho trẻ

dưới 36 tháng tuổi (dạng khô) (không bao gồm sản

phẩm quy định tại mục11, 12)

11 Thức ăn công thức dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi

(Infant formulae and follow-on formulae)

12

Thực phẩm sử dụng với mục đích y tế đặc biệt

dành cho trẻ dưới 12 tháng tuổi (Dietary foods

for special medical purposes intended specifically

for infants)

2.3 CÁC LOÀI NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN VÀ ĐIỀU KIỆN PHÁT TRIỂN

Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc giống Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 loài A flavus, A parasiticus và A nomius Người ta xác

định được rằng sự tổng hợp các aflatoxin là sự tác động qua lại của genotip của

chủng nấm mốc và điều kiện môi trường ngoài A flavus là chủng nấm mốc điển

hình của hệ nấm mốc không khí và đất, được tìm thấy hầu hết ở các nông sản bảo quản như ngô, lúa gạo, lúa mì, hạt bông, lạc, đậu tương, ớt…

2.3.1 Nấm mốc Aspergillus flavus

A flavus là loại nấm mốc sản sinh ra độc tố chịu nhiệt, vì vậy độc tố của nó

có thể tồn tại ở nhiệt độ mà các độc tố khác có thể không tồn tại A flavus xuất hiện khi các nguyên liệu thực vật được bảo quản ở độ ẩm cao A flavus tăng trưởng và phát triển mạnh ở vùng khí hậu nóng và ẩm ướt (Hedayati MT et al., 2007)

Nhiệt độ tối thiểu cho sự tăng trưởng của A flavus 120C (540F), nhiệt độ tăng trưởng tối đa 480C (1180F) và nhiệt độ tối ưu là 370C (98,60F) A flavus có

sự tăng trưởng nhanh chóng ở 30-550C, tăng trưởng chậm ở 12-150C và hầu như không còn tăng trưởng 5-80C (Agrios et al., 2005)

Độ ẩm: A flavus phát triển ở độ ẩm khác nhau với các loại nguyên liệu

khác nhau Đối với các loại ngũ cốc giàu tinh bột chúng phát triển ở 13,0-13,2%,

đậu tương ở 11,5-11,8% và các cây trồng khác thì ở 14% A flavus phát triển phổ

biến ở các nước nhiệt đới (Saori A et al., 2011)

Đặc điểm nấm mốc A flavus (Tiêu chuẩn ngành Y tế 52 TCN-TQTP

0001:2003):

Hình 2.3 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) của nấm A flavus (William

McDonald, 2001)

Đại thể: Khóm nấm mốc có đường kính d = 3-5 cm trên đĩa thạch PDA

sau 5 ngày Khóm nấm lúc đầu hơi vàng, cuối cùng trở nên xanh lục hoặc vàng lục, hoá nâu khi già

Vi thể: Bông lớn hình cầu, hình tia, đôi khi tạo thành những cột không rõ

rệt Bọng hình cầu đến gần cầu Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình hai tầng Vách cuống conidi xù xì Hạt đính hình cầu đến gần cầu, trơn hoặc có gai

2.3.2 Nấm mốc Aspergillus parasiticus

Loài này tương tự như loài A flavus, chỉ có hai điểm khác là chúng chỉ có

một bộ cuống đính bào tử và bề mặt cuống nhẵn hoặc xù xì

Đặc điểm nấm mốc A parasiticus (Tiêu chuẩn ngành Y tế 52 TCN-TQTP

0009:2004):

Đại thể: Khóm nấm mốc có đường kính d = 3-5 cm trên đĩa thạch PDA

sau 5 ngày nuôi cấy Khóm nấm mốc có màu xanh lá cây, hơi vàng Không bao giờ hóa nâu khi già

Vi thể: Bông nhỏ, hình cầu tỏa tia Vách cuống conidi xù xì Bọng hình

gần cầu Thể bình 1 tầng Hát đính hình cầu, vách có gai

2.4.1 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin trên thế giới

Một nghiên cứu đã được tiến hành tại Iran để đánh giá thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin trong thực phẩm Aflatoxin B1 đã được phát hiện chiếm 58,3%

và 80% ở các mẫu ngô thu được từ các tỉnh Kermanshah và Mazandaran

(Ghiasian et al., 2011)

Vargas et al., (2001) đã chỉ ra rằng 38,3% mẫu ngô ở Brazil bị nhiễm

aflatoxin B1 ở mức trung bình là 9,4 µg/kg, tối đa là 129 µg/kg và chỉ có 3,7% cho thấy ở trên mức 20 µg/kg Họ đã tìm thấy sự xuất hiện đồng thời của aflatoxin B1 và fumonisin B1 trong tất cả 82 mẫu nhiễm aflatoxin Đồng xuất hiện của hai mycotoxin trên với zearalenone chỉ được quan sát thấy trong 18 mẫu

Ngộ độc aflatoxin lớn nhất và nghiêm trọng nhất đã được ghi nhận ở mức cao tới 8000 µg/kg ở Kenya vào năm 2004, khiến 125 người chết trên 317 trường

hợp bệnh nhân (Wagacha et al., 2008)

Theo một nghiên cứu được tiến hành bởi Sugita-Konishi et al., (2006) về

sự ô nhiễm trong nhiều loại thực phẩm bán lẻ của Nhật Bản với aflatoxin B1, B2, G1, G2 và mycotoxin khác giữa năm 2004 và 2005, các độc tố aflatoxin chỉ được phát hiện ở gần một nửa số mẫu bơ lạc với nồng độ cao nhất của aflatoxin B1 vào khoảng 2,59 µg/kg Trong khi các sản phẩm khác như các sản phẩm ngô, lạc, bột kiều mạch, gạo, dầu mè, ô nhiễm aflatoxin đã không được phát hiện

Aflatoxin cũng đã được phát hiện trong phần lớn các mẫu chip khoai lang sấy khô khảo sát tại Benin với mức cao đến 220 µg/kg, mặc dù mức trung bình thấp hơn nhiều (14 µg/kg) Hơn 54% các chip khoai lang sấy khô ở Nigeria dương tính với nhiễm độc aflatoxin, 10-120 µg/kg đã được phát hiện trong

khoảng hơn một phần ba mẫu của hạt hổ (Cyperus esculentus) trong cùng một nước (Bankole et al., 2004)

Mức nhiễm aflatoxin cao trong ngô ở một số nước khác của châu Phi, đặc biệt là Benin và Togo đã được thông báo và một phần ba số hộ gia đình có hạt ngũ cốc chứa độc tố aflatoxin cao gấp khoảng năm lần so với giới hạn an toàn

(Wagacha et al., 2008)

Các mức nhiễm aflatoxin cao nhất được tìm thấy trong bột ngô từ Ấn Độ, hỗn hợp các món ăn nhẹ từ Ấn Độ và gạo từ Thái Lan Ô nhiễm aflatoxin trong thực phẩm tươi sống và chế biến có thể được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký

hoặc kết hợp với kháng thể (Seo et al., 2011) Aflatoxin B1 đã được phát hiện ở

trong tất cả các mẫu của các loại ngũ cốc Nigeria: 17,01-20,53 µg/kg trong lúa mì; 34,00-40,30 µg/kg trong kê; 27,22-36,13 µg/kg ở ngô Guinea và 40,06-48,59

µg/kg trong bánh mì hoa quả (Odoemelam et al., 2009)

2.4.2 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin tại Việt Nam

Với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thích hợp cho độc tố nấm mốc phát triển Theo khảo sát của Nguyễn Phùng Tiến (1992) nhận thấy tỷ

lệ nhiễm aflatoxin trên ngô bị mốc ở miền Nam và miền Bắc khá cao từ 95,5% với hàm lượng từ 16-100 µg/kg Năm 1990 - 1995 Viện Dinh dưỡng đã kiểm tra 387 mẫu lương thực thực phẩm nhận thấy có 73 mẫu (19%) bị ô nhiễm aflatoxin và trong đó có 19 mẫu (4,9%) có hàm lượng aflatoxin vượt quá giới hạn cho phép theo quy định 867/QĐ-BYT/1998 của Bộ Y tế Kết quả khảo sát, phân tích trên 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biến làm thức ăn gia súc tại 3 xã thuộc huyện Tân Kỳ Nghệ An tháng 6/2002 đã phát hiện mức độ và nguy cơ ô nhiễm aflatoxin khá cao: trên 90% số mẫu lấy tại các hộ gia đình đang được bảo quản bị ô nhiễm aflatoxin và tỷ lệ vượt giới hạn cho phép theo quy định của Bộ

73,3-Y tế là trên 23% (56/243 mẫu)

Thực trạng trên cho ta thấy, hàng trăm triệu tấn ngô bị nhiễm độc tố nấm mốc cả ở Việt Nam và trên thế giới mỗi năm, chúng ta không thể vứt bỏ hết số lượng ngô đó Vậy phải làm sao để có thể sử dụng được phần nào lượng ngô đã nhiễm độc tố mà vẫn không nguy hại tới sức khỏe của người và vật nuôi? Cả thế giới đã và đang không ngừng tìm ra các giải pháp khắc phục vấn đề này, nhằm nâng cao chất lượng nông phẩm và tăng giá trị sử dụng nó

2.4.3 Các biện pháp phòng, trừ aflatoxin

Khả năng phòng, trừ aflatoxin được thể hiện ở 3 biện pháp là biện pháp

vật lý, biện pháp hóa học và biện pháp sinh học

Biện pháp vật lý có thể sử dụng một số tác nhân như độ ẩm, không khí

nóng; áp suất cao; sử dụng các hấp phụ như than hoạt tính, một số polymer, một

số đất sét đặc biệt; dung môi hữu cơ; các tia bức xạ

Biện pháp hóa học: Nhiều hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hay

aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên Những hóa chất này bao gồm: chlorine, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau:

- Phá hủy hay khử aflatoxin;

- Không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm chuối cùng;

- Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng

có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm;

- Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu

Biện pháp sinh học dùng các loài nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn,

đã được thử nghiệm về khả năng khử aflatoxin Có thể kể đến Bacillus subtilis,

Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., Ralstonia spp., Burkholderia spp.,

Candida krusei , Pichia anomala, chủng không sinh độc tố của Aspergillus flavus

và Aspergillus parasiticus… Trong phạm vi của khóa luận, sẽ đi sâu vào nghiên cứu vi khuẩn lactic và nấm Trichoderma

2.5 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN LACTIC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ NẤM MỐC

2.5.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, catalase

âm tính Được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm

Vi khuẩn lactic được sử dụng trong việc sản xuất các sản phẩm lên men như sữa chua, phô mai và rau củ muối chua Ngoài ra, vi khuẩn lactic có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây hư hỏng và các mầm bệnh trong môi trường bằng cách giảm độ pH hoặc thông qua việc sản xuất của các peptide kháng khuẩn, gọi là bacteriocins Vi khuẩn lactic cũng được cho là có khả năng tăng cường sức khỏe và nhiều người đang sử dụng như chế phẩm sinh học để phòng ngừa, giảm và điều trị các rối loạn đường ruột ở người và động vật (Sonomoto K

et al., 2011)

Trong khi nhiều nghiên cứu tập trung vào các hoạt động kháng khuẩn của

vi khuẩn axit lactic (Dodd và Gasson, 1994 ; Lindgren và Dobrogosz, 1990), có tương đối ít các báo cáo về tác dụng chống nấm của vi khuẩn này Nghiên cứu

của El-Gendy và Marth (1981) cho thấy Lactobacillus casei ức chế sự phát triển

và sản xuất aflatoxin của Aspergillus parasiticus Nhóm nghiên cứu Lavermicocca et al., (2000) đã chứng minh rằng các hợp chất như axit phenyllactic và acid 4-hydrophenyllactic được sản xuất bởi Lactobacillus

plantarum có khả năng chống nấm Ngoài ra, chất bacteriocin và các hợp chất phân tử lượng thấp khác đã được sản xuất bởi L pentosus và L coryniformis (Okkers et al., 1999, Magnusson et al., 2003)

2.5.2 Các chất chuyển hóa kháng nấm được sản xuất bởi vi khuẩn lactic

2.5.2.1 Axit béo

Một số vi khuẩn lactic có thể sản xuất các axit béo kháng khuẩn, nâng cao

chất lượng cảm quan của sản phẩm lên men Axit caproic phân lập từ Lb

sanfranciscensis CB1 đến nay được biết là các chất kháng nấm mạnh sản xuất

bởi chính chủng này (Corsetti et al., 1998) Hợp chất này có thể hoạt động trong

sự hợp lực với các axit khác như propionic, butyric và axit valeric Gần đây, sự xuất hiện của các axit béo hydroxy (C3) với rất nhiều hoạt động kháng nấm đã được mô tả Trong số các axit béo, hoạt động nhiều nhất đã được chứng tỏ là có chiều dài chuỗi nguyên tử 12 carbon Hợp chất axit béo hydroxy trình bày một quang phổ ức chế rất rộng và có hiệu quả chống lại nấm mốc và nấm men Nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) của acid béo hydroxy hóa trong khoảng giữa 10 và 100

lg/ml (Sjogren et al., 2003)

2.5.2.2 Reuterin

Reuterin là một sản phẩm của quá trình lên men glycerol được sản xuất

bởi Lactobacillus reuteri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri,

Lactobacillus collinoides và Lactobacillus coryniformis trong điều kiện yếm khí

Nó đã được chứng minh rằng trong các sinh vật mục tiêu, hợp chất này đã có thể ngăn chặn hoạt động ribonuclease, các enzyme chính tham gia vào quá trình tổng

hợp DNA (Dobrogosz et al., 1989) Reuterin đã được báo cáo là có khả năng ức chế sự phát triển của Aspergillus và Fusarium (Chung et al., 1989) Việc bổ sung

glycerol với một số nền văn hóa LAB sản xuất reuterin làm tăng hoạt tính kháng nấm của chúng

2.5.2.3 Hợp chất có bản chất protein

Không có bằng chứng rõ ràng ở thời gian này trong vai trò của các hợp chất protein trong sự ức chế phát triển nấm mốc bởi LAB Tuy nhiên, một số tác giả đã

báo cáo rằng một số chủng lactic như Lc lactis subsp lactis, Lb casei subsp

pseudoplantarum và Pediococcus pentosaceus (Rouse et al., 2008) sản xuất các chất

chuyển hóa kháng nấm là nhạy cảm với các enzyme phân giải protein

Các loại peptide kháng nấm được xác định là dipeptides theo chu kỳ bao

gồm cả cyclo (Phe-Pro), cyclo (Phe-OH-Pro) và cyclo (Gly-L-Leu) (Strom et al., 2002) Cyclo (Phe-Pro) và cyclo (Phe-OH-Pro) được sản xuất bởi Lb plantarum MiLAB 393, Pediococcus pentosaceus, Lb sakei và Lb coryniformis, trong khi

cyclo (Gly-L-Leu) được phân lập từ Lb plantarum VTTE-78.076 (Niku-Paavola

et al., 1999)

2.6 NẤM TRICHODERMA

2.6.1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma

Trichoderma là một loài nấm đứng đầu của hệ vi sinh vật đất, nó có tính đối kháng cao và được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Trong tự nhiên

nấm Trichoderma là một loại vi sinh vật có lợi cho cây trồng và không độc hại Nấm Trichoderma phân giải các chất hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng

và là tác nhân sinh học đối kháng lại các loại nấm bệnh cho cây trồng trong đất

như Rhizoctonia solani, Fusarium, Rolfsii Sclecrotium, Verticillium (Nguyen Thi Thanh et al., 2014)

Một số chủng Trichoderma được ứng dụng nhiều phải kể đến là T

harzianum , T viride, T auroviride, T longibrachiatum, T hamatum Trong phạm vi khóa luận sẽ tập trung nghiên cứu vào chủng T harzianum

T harzianum là loài quen thuộc nhất Trichoderma vì nó là thường xuyên xuất hiện nhất trong đa số các mẫu trên toàn thế giới Loại nấm Trichoderma

harzianum là một loài phổ biến trong môi trường với một số chủng được khai thác thương mại cho việc kiểm soát sinh học của nấm gây bệnh thực vật

Hình 2.5 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) của nấm Trichoderma

Nhiệt độ có thể phát triển của Trichoderma harzianum là từ 30 - 37 oC, nhiệt độ tối ưu là từ 32 - 35 oC

Trichoderma harzianum có tốc độ tăng trưởng từ 8 - 9 cm sau 3 ngày nuôi cấy, khóm nấm màu xanh đậm, bề mặt khóm nấm gợn sóng, màu sắc thái bào tử

là xanh đen (Shahid et al., 2014)

T harzianum đã được áp dụng thương mại ở dạng bào tử như đại lý sinh

học cho các loại cây trồng như dâu tây, rau diếp, cà chua và cây cảnh ngoài trời

Khả năng của các bào tử của nấm Trichoderma harzianum đã có hiệu quả ngăn chặn sự tăng trưởng của A flavus và A parasiticus và cũng để giảm lượng aflatoxin được sản sinh ra (Gachomo et al, 2008)

2.6.2 Lợi ích của nấm Trichoderma

Lợi ích của nấm Trichoderma là rất lớn và sau đây là một số lợi ích chính của nấm Trichoderma:

Kiểm soát bệnh tật: Trichoderma là một nguồn kiểm soát sinh học mạnh

và được sử dụng rộng rãi để kiểm soát dịch bệnh sau thu hoạch Rất nhiều giống

Trichoderma có khả năng kiểm soát tất cả các loài nấm gây bệnh khác Tuy nhiên, một số giống thường có hiệu quả hơn những giống khác trên một số bệnh

nhất định Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng chống lại nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như Pythium, Rhizoctonia và

Fusarium Quá trình đó được gọi là ký sinh nấm Trichoderma tiết ra một enzym

làm tan vách tế bào của các loài nấm khác Sau đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó tiết ra nhiều enzym chủ yếu là endochitinase Sự kết

hợp này cho phép Trichoderma bảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại

nấm gây thối rễ trên đồng ruộng

Thúc đẩy sự sinh trưởng thực vật: Trichoderma là chủng hòa tan phốt phát và các vi chất dinh dưỡng Các ứng dụng của Trichoderma với sự kích

thích làm tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m so với mặt đất), do đó làm tăng khả năng phát triển của cây để chống lại hạn hán

Cây biến đổi gen: Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm

soát sinh học Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có

tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh ví dụ như chọn dòng chuyển gen có khả năng chịu các tác nhân

gây bệnh trên lá như A solani và Botrytis cirerea, cũng như các tác nhân gây bệnh cho đất Rhizectonia spp Tuy chưa có gen nào được thương mại hóa, nhưng

có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển

Xử lý sinh học: chủng Trichoderma có một vai trò quan trọng trong việc

xử lý sinh học của đất mà đang bị ô nhiễm với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ với khả năng phân huỷ một loạt các thuốc trừ sâu như organochlorines, organophosphates và cacbonat

Bên cạnh những ứng dụng chính của Trichoderma thì còn các lĩnh vực

công nghệ sinh học xanh và trắng ngày càng trở nên quan trọng đối với sản xuất các enzym và kháng sinh an toàn với môi trường (André S and Monika S., 2010)

Cuối cùng nhưng không kém phần quan trọng, các nghiên cứu sâu rộng về

đặc điểm sinh lý có sẵn và những đặc điểm còn tiến triển cuả Trichoderma được ứng dụng cho các nghiên cứu Trichoderma trong quá trình lên men công nghiệp

cũng như các hiện tượng tự nhiên (André S and Monika S., 2010)

2.6.3 Tính đối kháng của nấm Trichoderma

Trichoderma spp là nguồn kiểm soát sinh học nghiên cứu rộng rãi nhất để chống lại tác nhân gây bệnh bởi vì khả năng của nó để giảm sự sinh trưởng của

các tác nhân gây bệnh Cơ chế của Trichoderma spp để kiểm soát bệnh thực vật, bao gồm cạnh tranh, ký sinh nấm và kháng sinh (Anita Patil et al., 2012)

Cạnh tranh: Đây là hiện tượng trong đó mầm bệnh và các tác nhân kiểm soát sinh học (đối kháng) cạnh tranh về không gian và chất dinh dưỡng Trong quá trình này, các chất đối kháng có thể ức chế sự phát triển của các tác nhân gây

bệnh trong vùng rễ và do đó làm giảm phát triển bệnh Ví dụ, Trichoderma

harzianum làm giảm 80 - 85% bệnh lở cổ rễ ở khoai lang

Kháng sinh: các chủng Trichoderma có khả năng sản sinh chất kháng khuẩn và có ảnh hưởng trực tiếp trên các sinh vật Ví dụ Trichoderma có tác

dụng kháng khuẩn trên các vi khuẩn và nấm

Ký sinh nấm: Đây là hiện tượng trong đó nấm đối kháng ký sinh nấm khác

Cơ chế của sự tương tác bao gồm các giai đoạn khác nhau Giai đoạn đầu tiên, kích thích phản ứng hóa học của nấm gây bệnh thu hút các loại nấm đối kháng Giai đoạn thứ hai, nhận biết giữa các tác nhân gây bệnh và các chất đối kháng Giai đoạn thứ

ba, sự tương tác giữa các sợi nấm của các mầm bệnh và nấm đối kháng Sợi nấm của

Trichoderma phát triển dọc theo các sợi nấm chủ hoặc cuộn dây xung quanh nó và tiết ra các enzym khác nhau như chitinase, glucanase

2.6.4 Tình hình nghiên cứu tính đối kháng của nấm Trichoderma với nấm

mốc sinh độc tố aflatoxin

2.6.4.1 Tình hình nghiên cứu tính đối kháng của nấm Trichodermar với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên thế giới

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về khả năng ức chế nấm mốc sinh độc

tố aflatoxin cũng như độc tố aflatoxin T harzianum có thể ức chế A flavus phần

trăm ức chế dao động từ (68,8-100%) bởi dịch chiết của T harzianum (Monira

Rashed Al-Othman et al., 2013) Theo Mumtaz Baig et al 2012 T harzianum ức chế

tăng trưởng của A flavus là 67% sau 5 ngày đồng nuôi cấy với nấm A flavus

Anita S patil đã chứng minh T harzianum là một nấm đối kháng có hiệu

quả chống lại các tác nhân gây bệnh thực vật kiểm tra, cho thấy phạm vi của tỷ lệ

ức chế khác nhau 56,52 - 71,01% với A flavus và 50,00 - 64,00% so với A

parasiticus (Anita S patil et al., 2012)

Một số chủng nấm Trichoderma spp đã được chứng minh làm suy giảm aflatoxin B1 từ 65-99% trong 5 ngày ở 28 ± 2 ° C (Dimitrios et al., 2012)

2.6.4.2 Tình hình nghiên cứu tính đối kháng của nấm Trichodermar với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam nấm Trichoderma đã xác định được 33 loài, nhưng hướng ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát sinh học nấm mốc

sinh độc tố aflatoxin trong nông sản chưa được quan tâm nghiên cứu Việt Nam

nghiên cứu sử dụng nấm đố kháng Trichoderma mới chỉ tập trung theo hướng

phòng trừ nấm bệnh hại rễ cây trồng, phân hữu cơ vi sinh ví dụ như phân hữu cơ

vi sinh Trichoderma (Nguyen Thi Thanh et al., 2014)

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng

Đối tượng được tiến hành để phân lập nấm mốc sinh độc tố là các mẫu ngô được lấy ở các vị trí khác nhau ở kho chứa nguyên liệu của công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam chi nhánh Xuân Mai – Chương Mỹ - Hà Nội và công ty TNHH Thành Sơn – Kì Sơn – Hòa Bình

Bảng 3.1 Đặc điểm các mẫu ngô đem sàng lọc

N1 Ngô lấy ở Silo 1 – Công ty C.P 3kg

N2 Ngô lấy ở Silo 2 – Công ty C.P 3kg

N3 Ngô lấy ở Silo 4 – Công ty C.P 3kg

N4 Ngô lấy ở Silo 5 – Công ty C.P 3kg

N5 Ngô lấy ở Silo 8 – Công ty C.P 3kg

N6 Ngô lấy ở công ty TNHH Thành Sơn 3kg

Các chủng vi khuẩn lactic được lấy từ bộ sưu tập giống của khoa Công Nghệ Thực Phẩm - VNUA Vi khuẩn được lưu trữ trong các ống thạch nghiêng trên môi trường MRS ở nhiệt độ 40C

Nấm Trichoderma được cung cấp bởi Bộ môn bệnh cây, Khoa Nông học -

3.1.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: cân điện tử, kính hiển vi quang học, máy đo pH, máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm cao tốc, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh giữ giống, tủ nuôi cấy, tủ sấy, cân đo độ ẩm, buồng đếm hồng cầu, máy đọc ELISA, máy Vortex

Dụng cụ: Đĩa petri, pipette tự động các loại, ống nghiệm, cốc đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20 – 1000 ml), que cấy