Tính trạng về độc tố aflatoxin sản sinh từ aspergillus

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: TS Đàm Thúy Hằng Sinh viên: Lê Thị Thơ 20175203 Phan Thị Nhung 20175051 *Bài thí nghiệm -Tính trạng nào đó quan tâm, xác định gen nà

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: TS Đàm Thúy Hằng

Sinh viên: Lê Thị Thơ 20175203

Phan Thị Nhung 20175051

*Bài thí nghiệm

-Tính trạng nào đó quan tâm, xác định gen nào mã hóa cho tính trạng đó trong các bài báo khoa học

-Tìm kiếm 1 số gen mã hóa protein quan tâm trên ngân hang dữ liệu

-So sánh các trình tư gen mã hóa cho tính trạng đó, tìm được vùng bảo thủ

2 Phân loại

Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên Aflatoxin B1 được coi là

dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus

Aflatoxin G1 và G2 chỉ được sinh ra từ A parasiticus

Sự có mặt của Aspergillus trong các sản phẩm thực phẩm không phải lúc nào cũng

là chỉ thị về mức aflatoxin có hại mà nó biểu thị cho rủi ro đáng kể khi sử dụng thực phẩm

Aflatoxin M1, M2 thường được phát hiện trong sữa của bò được cho ăn bởi các loại hạt bị nhiễm nấm mốc Các độc tố này là sản phẩm của một quá trình chuyển hóa

trong gan động vật Tuy nhiên, aflatoxin M1 cũng có mặt trong sản phẩm lên men

bởi Aspergillus parasiticus Những dạng chuyển hóa của độc tố bao gồm:

a Aflatoxin B1 & B2: được sinh ra bởi Aspergillus flavus và A parasiticus

b Aflatoxin G1 & G2: được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus

c Aflatoxin M1: chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng)

d Aflatoxin M2: chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho

ăn thức ăn nhiễm aflatoxin.[6]

e Aflatoxicol (AFL)

f Aflatoxin Q1 (AFQ)

của các loại aflatoxin của các loại aflatoxin

3 Đặc điểm

-Tương tác với virus viêm gan B

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc đồng phơi nhiễm với virus viêm gan B (HBV) làm tăng nguy cơ ung thư

-Aflatoxin gây bệnh

Độc tố aflatoxin có thể nhiễm vào bất kỳ loài động vật nào Đối với người trưởng thành khả năng chống chịu tốt hơn khi tiếp xúc với nó Đối với trẻ em dễ bị ảnh hưởng và dẫn đến phát triển, tăng trưởng chậm

Aflatoxicosis tấn công cơ quan chính là gan ở động vật có vú vì vậy gây bệnh gan

là chủ yếu Khi bị phơi nhiễm aflatoxin ở mức độ nặng sẽ gây hoại tử gan cấp tính, nặng hơn có thể gây xơ gan hoặc ung thư gan Những triệu chứng suy gan cấp tính như: phù, thay đổi sự hấp thu, thay đổi tinh thần, chảy máu, thay đổi tiêu hóa, chuyển hóa các chất dinh dưỡng, hôn mê

Người bị nhiễm độc tố này lâu năm có nguy cơ cao ung thư túi mật và gan Phơi nhiễm mãn tính không dẫn đến những triệu chứng kịch tính như bệnh aflatoxicosis cấp tính

Aflatoxin B1 có thể gây ức chế miễn dịch và tăng lượng virus ở những người bị nhiễm HIV

Những yếu tố bị ảnh hưởng bởi aflatoxin như loài, dinh dưỡng, khả năng tiếp xúc đồng thời với các chất độc khác, tuổi, giới tính Những điều kiện làm tăng nguy cơ nhiễm ở người bao gồm: điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc trên thực phẩm, thiếu hệ thống kiểm soát và quản lý, hạn chế về thức ăn Hiện nay vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh aflatoxicosis Người bệnh chỉ có thể điều trị triệu chứng và hỗ trợ điều trị bệnh gan ở mức độ nghiêm trọng

Sử dụng dịch truyền tĩnh mạch với dextrose, vitamin B, vitamin K hoạt động, hạn chế với hàm lượng carbohydrate đầy đủ Chế độ ăn uống đầy đủ các loại rau

apiaceous như củ cải vàng, rau mùi tây, cà rốt, cần tây có thể làm giảm nguy cơ ung thư

4 Cách phát hiện nhiễm Aflatoxin ở người

Hiện tại có 2 cách xét nghiệm phát hiện mức độ nhiễm aflatoxin ở người:

 Tính lượng phức AFB1-guanine trong nước tiểu: Phương pháp này sẽ dựa vào sự có mặt của các phân tử nhỏ hơn cho thấy tồn tại trong vòng 24 giờ

Tuy nhiên đây không phải là phương pháp tốt nhất vì mức độ AFB1-guanine

có thể thay đổi theo từng ngày

 Tính lượng phức AFB1-albumin trong huyết thanh: Đây là cách tính hàm

lượng aflatoxin phơi nhiễm trong thời gian vài tuần đến vài tháng

II Tìm kiếm gen mã hóa

1 Tìm kiếm trên NCBI - Xác định tính trạng và tìm kiếm thông tin

Gen 1:

Gen2, gen 3 tương tự

=> Tìm các bài báo theo Nucleotide – tránh lựa chọn các bài báo “ Partial”

2 Kết quả

>gen1

ATGGTTGACCATATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGGACCGATCCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCCCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCAGGTCGGAACAGGGACTTC CGGCGCATAACACGTACTCAACGCCTCATGCTCATACGCAGGCCCACACTCATGCTCATTCTCATCCGCA ACCGCATCCACAATCTCATCCTCAATCGAATCAACCACCACACGCTCTGCCCACCCCCAATGGTAGCAGT AGCGTCTCCGCCATCTTTTCTCATCAGAGTCCGCCGCCACCCGTGGAGACCCAGGGCCTTGGAGGAGATC TGGCTGGTCAGGAGCAAAGCACCCTGTCTTCCCTAACAGTCGATTCGGAATTCGGGGGCTCTTTGCAGTC AATGGAACACGGAAACCATGTCGATTTCTTGGCCGAGTCGACGGGGAGTCTTTTCGACGCGTTTTTGGAA GTAGGGACCCCCATGATCGACCCGTTCCTCGAGTCGGCCCCACTACCACCGTTTCAGGCGCGCTATTGCT GCTTTTCGCTAGCACTACAAACACTGACCCACCTCTTCCCCCACGCCCCGCTGGGCTGTCAACTACGGCT GACGGACGGTGAGGACAGTTCGTGCAACCTGATGACGACTGATATGGTCATCTCGGGGAACAAGAGGGCT ACCGATGCGGTCCGGAAGATCCTCGGGTGTTCGTGCGCGCAGGATGGCTACTTGCTGAGCATGGTCGTCC TTATCGTTCTCAAGGTGCTGGCATGGTATGCTGCGGCAGCAGGCACCCAGTGTACCTCAACGGCGGCGGG TGGAGAAACCAACAGTGGCAGCTGTAGCAACAGTCCCGCCACCGTGTCCAGTGGCTGTCTGACGGAAGAG CGCGTGCTGCACCTCCCTAGTATGATGGGCGAGGATTGTGTGGATGAGGAAGACCAGCCGCGAGTGGCGG CACAGCTTGTTCTGAGTGAACTGCACCGAGTCCAGTCGCTGGTGAACCTATTGGCCAAGCGCCTGCAAGA AGGTGGAGACGATGCAGCAGGGATACCGGCGCACCATCCAGCGTCCCCTTTCTCACTACTCGGGTTTAGT GGCCTCGAAGCAAATCTCGCCACCGCTTGGCGCCGTGTCCTCCGACATTATTGA

>gen2

ATGGTTGACCATATTTCCCCCCGGGCATCTCCCGGGCCGATGCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCTCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGTTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCGGATCGGAACAGGGACATC CGGCGCATAACACGTATTCAACTCCTCATGCTCATCCCCAACCGCATCCACAATCTCATCCTCAATCGAA TCAACCACCACACGCTCTGCCCACCCCCAATGGTAGCAGTGGTGTCTCCGCCATCTTTTCTCATCAGAGT CCCCCGCCACCCGTGGAGACCCAGGGCCTTGGAGGAGATTTGGCCGGTCAGGAGCAAAGCACCCTGTCTT CCCTAACAATCGATTCGGAATTTGGGGGCTCTTTGCAGTCCATGGAACACGGAAACCATGCCGATTTCTT GGCTGAGCCGACGGGAAGTCTTTTCGACGCGTTTTTGGAAGTGGGGACCCCCATGATCGACCCGTTCCTC GAGTCGGCCCCACTGCCACCGTTTCAGGCGCGCTATTGCTGCTTTTCGCTTGCACTACAAACACTGACCC ACCTCTTCCCCCACGCCCCGCTGGGCTGTCAGCTGCGGCTGACAGACGGCGAGGACAGTTCGTGCAACCT GATGACGACTGATATGGTCATCTCGGGGAACAAGAAGGCTACAGATGCGGTCCGGAAGATCCTCGGGTGT TCGTGCGCGCAGGATGGCTACTTGCTGAGCATGGTCGTCCTTATCGTTCTCAAGGTGCTGGCGTGGTATG CAGCGGCAGCAGGCACCCAGTGTACCTCGACGGCGGTGGGGGGAGAAACCAGCAGTGGCAGCTGTGGCAA CAGTCCCGGCACCGTGTCCAGTGGCTGTCTGTCGGAAGAGCGCGTGCTGCACCTACCAAGTATGGTGGGC GAGGATTGTGTGGATGAGGAAGACCACCCGCGAGTGGCGGCACAGCTCGTTCTGAGTGAACTGCACCGAG TACAGTCGCTGGTGAATCTATTGGCCAAGCGCCTGCAAGAAGGTGGAGACGATGCAGCAGGGATACCGAC GCACCATCCAGCATCCCCTATCTCACTACTCGGATTTAGCGGCCTCGAAGCAAATCTCCGCCACCGCTTG CGCGCCGTGTCCTCTGACATTATTGATTACCTGCATCGAGAATGA

>gen3

ATGGTTGACCATATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGGACCGATCCGTTCCTCCCAGACTCGCCGCGCCCGAA AGCTCCGGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGC TCGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCTCCAAGCGGATGGGCCGCAATCCGCGCGCT CCCAGTCCCCTTGATTCAACTCGGCGACCATCAGAGAGTCTTCCTTCAGCCAGGTCGGAACAGGGACTTC CGGCGCATAACACGTACTCAACGCCTCATGCTCATACCCAGGCCCACACTCATGCTCATTCTCATCCGCA

Kết quả khi so sánh các trình tự mã hóa protein (tìm vùng bảo thủ)

3 Chạy so sánh các đoạn gen với nhau

+Dùng Clustal Omega

+Hoặc dùng

4 Thiết kế đoạn mồi Primer

Nhân gen, trình tự 2 đoạn đầu Mồi bắt cặp, tag sẽ kéo từ đầu 3’ của mồi

Trình tự mồi của mạch 3’-5’(mồi xuôi) giống mạch đơn trên ngân hàng dữ liệu, còn mồi ngược thì giống trình tự mạch bổ sung

-Giúp thiết kế mồi nhanh hơn

-Yêu cầu của mồi trong PCR

-Điền dữ liệu, nhập các thông số

Phần trình tự đoạn gen để thiết kế mồi là trình tự đoạn gen của sinh vật có quan hệ gần gũi nhất với sinh vật ta đang làm

Thay đổi các lựa chọn cho phù hợp với Aspergillus flavus

-Kết quả

=>Chương trình thiết kế 1 đoạn mồi

Trình tự mồi:

Mồi xuôi : TGGTTGACCATATCTCCCCC

Mồi ngược: TCAATAATGTCGGAGGACACG

+ Kiểm tra các thông số liên quan nếu cần: chiều dài nucleotide “length” từ 18 đến

24, trình tự 5 nucleotide cuối, %GC, nhiệt độ chênh lệch <5, Tm chênh từ 40-60 độ với độ chênh từng đợt là 5 “ self comple…” bé hơn 4

=> Lấy các kết quả PRIMER đã chạy được

-Kiểm tra sản phẩm PCR có tạo thành không

5 Xác định các tính trạng của đoạn protein sau khi chạy PCR ảo

Từ kết quả PCR, tiến hành các thao tác để:

• Trình tự protein mà gen được tách dòng mã hóa

• Dự đoán chức năng của protein đó

• Khối lượng phân tử, điểm đẳng điện

• Vị trí của protein nằm trong tế bào chất, trên màng hay ngoại bào

=> Kết quả:

Chọn dữ liệu bôi vàng vì có sự tương đồng về trình tự cao nhất

Chuyển về dạng FASTA thì được trình tự protein:

>AAA57137.1 aflatoxin [Aspergillus flavus]

MVDHISPRASPGPIRSSQTRRARKLRDSCTSCASSKVRCTKEKPACARCIERGLACQYMVSKRMGRNPRA

PSPLDSTRRPSESLPSARSEQGLPAHNTYSTPHAHTQAHTHAHSHPQPHPQSHPQSNQPPHALPTPNGSS

6 Kiểm tra các điều kiện cơ bản của Protein

-Để biết khối lượng phân tử và điểm đẳng điện của protein đó:

=>Kết quả:

- Vị trí của protein: dùng Phobius

=>Kết quả:

Ngoại bào: phần axit amin từ 1 đến 295

Xuyên màng: từ axit amin 296 đến 315

Nội bảo: từ axit amin 316 đến 437

-Dự đoán chức năng của protein đó:

=>Kết quả:

Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin Cần thiết cho sự biểu hiện của gen NOR1 và VER1

Con đường : sinh tổng hợp aflatoxin

Protein này có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin, là một phần của quá trình sinh tổng hợp Mycotoxin

Tất cả các protein của sinh vật này được biết là có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin và trong sinh tổng hợp Mycotoxin

III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TÁCH DÒNG GEN

a Xác định gen cần tách:

- Xác định tính trạng chủng vi sinh vật ta quan tâm

- Xác định gen quy định tính trạng đó trong các báo cáo khoa học ( NCBI )

b.Thiết kế mồi:

- Consensus các trình tự mã hóa protein bằng Multalin có độ tin cậy và chính xác hơn sau khi được so sánh từ các trình tự lấy từ ngân hàng dữ liệu Xác định vùng bảo thủ (mồi được thiết kế sẽ nằm trong vùng bảo thủ

này)

- Thiết kế mồi: sử dụng các chương trình như: Primer Blast, Primer3Plus,

Primer3

c.Kiểm tra mồi: Sử dụng PCR ảo SMS

=> Xem xét đoạn kết quả sau khi chạy SMS xem có tương đương (kích

thước, ) với trình tự ban đầu , rồi cho vào BlastX của NCBI để dự đoán và kiểm tra ngược tính trạng product của PCR ảo có đúng hướng tính trạng - sản phẩm mình quan tâm ban đầu không

d Phân tích cấu trúc 3D, tìm và dự đoán các đặc tính của protein tách dòng và biểu hiện protein (khối lượng phân tử, điểm pI , vị trí trên màng tế bào)

( ExPASy )

e.Xây dựng phương án tách dòng gen

 Tách ARN tổng số, tổng hợp cDNA và khuếch đại bằng PCR

 Tạo vector tách dòng tái tổ hợp => biến nạp

 Tìm và lựa chọn chủng tái tổ hợp

( làm việc với nhiệt độ, pH, … các điều kiện tương thích với đặc điểm của chủng và đặc điểm tính trạng)

7 Tìm hiểu về cấu trúc 3D của protein đó:

Chuỗi xoắn anpha: hình giống mũi tên

Tấm phẳng beta:

Thực hiện BLAST lại với Protein Data Bank

=> Kết quả:

E value : càng thấp thì giống cấu trúc nhau càng cao

=>Chọn dữ liệu đầu tiên:

Chọn FASTA :

Ấn vào protein 3D structure:

Cấu trúc hóa học và không nằm trong cấu trúc sinh học : 2,4PENTANEDIOL và ZINC ION:

(4S)-2-METHYL-Download về máy => Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => Mở file

- Vào Style => Coloring Shortcuts => Secondary Structure

-Xác định các tính trạng, cấu trúc Ví dụ:

Chuỗi α và β: Style =>Coloring Shortcuts =>Secondary Structure

Vùng: Style >Coloring Shortcuts =>Domain

Vùng kỵ nước: Style =>Coloring Shortcuts =>Hydrophobicity

Các phân tử: Style =>Coloring Shortcuts =>Molecule

Vùng bảo thủ: Style =>Coloring Shortcuts =>Sequence Conservation

Nhiệt độ: Style =>Coloring Shortcuts =>Temperature

IV Kết luận sau môn học

- Đã hoàn thành mục đích thí nghiệm

- Biết cách sử dụng các trang database trong CNSH , đặc biệt là NCBI

- Xác định các tính trạng phù hợp, quan tâm, giúp cho các công việc nghiên cứu