Đa dạng thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá rạn san hô (họ mullidae, synodontidae, pomacentridae và serranidae) tại vịnh nha trang, khánh hòa

iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Đa dạng thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá rạn san hô Họ: Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae ở vị

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN QUANG SÁNG

ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ (HỌ: MULLIDAE, SYNODONTIDAE, POMACENTRIDAE VÀ SERRANIDAE)

TẠI VỊNH NHA TRANG, KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN QUANG SÁNG

ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ (HỌ: MULLIDAE, SYNODONTIDAE, POMACENTRIDAE VÀ SERRANIDAE)

TẠI VỊNH NHA TRANG, KHÁNH HÒA

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Đa dạng thành phần loài ký sinh trùng trên một

số loài cá rạn san hô (Họ: Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae) ở vịnh Nha Trang, Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng

được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Nha Trang, ngày tháng năm

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng ban trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường

đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài Đặc biệt là sự hướng dẫn tận

tình của TS Đặng Thúy Bình và GS Arne Levsen đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài

Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm

Tác giả luận văn

v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về cá rạn san hô trong nghiên cứu 4

1.2.1 Cá khoang cổ Amphiprion spp (Họ Pomacentridae) 4

1.2.2 Cá mú Epinephelus spp (Họ Serranidae) 6

1.2.3 Cá mối Synodus spp (Họ Synodontidae) 7

1.2.4 Cá phèn (Parupeneus spp.) (Họ Mullidae) 8

1.3 Tình hình nghiên cứu KST trên cá rạn san hô 9

1.3.1 Thế giới 9

1.3.2 Việt Nam 11

1.3.3 Khánh Hòa ………12

1.4 Tổng quan về sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa ở KST 13

1.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của DNA ribosome (rDNA) 13

1.4.2 Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài 15

1.4.3 Nghiên cứu quá trình đồng tiến hóa 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tương nghiên cứu 20

2.2 Phạm vi nghiên cứu 20

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá rạn san hô 22

2.4.2 Phương pháp phát hiện KST 22

2.4.2.1 Phương pháp thu KST 22

2.4.2.2 Phương pháp kiểm tra KST 23

2.4.3 Phương pháp phân loại và bảo quản KST 24

2.4.4 Phương pháp đo KST 25

2.4.5 Nghiên cứu tình trạng nhiễm KST 25

2.4.6 Phân loại và mô tả KST dựa vào đặc điểm hình thái 25

2.5 Nghiên cứu di truyền KST ký sinh trên cá rạn tại Khánh Hòa 26

2.5.1 Định danh loài dựa trên chỉ thị phân tử 28S rRNA 26

2.5.2 Phân tích mối quan hệ phát sinh loài 28

2.5.3 Khảo sát quá trình đồng tiến hóa (Coevolution) 32

2.5.3.1 Xây dựng và khảo sát phát sinh loài 32

2.5.3.2 Khảo sát quá trình đồng tiến hóa 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân loại hình thái và xác định thành phần loài KST trên cá rạn san hô tại Khánh Hòa 34

3.2 Đặc điểm hình thái 34

A Lớp Trematoda (Sán lá song chủ) 36

3.2.1 Bivesicula claviformis Yamaguti, 1934 36

3.2.2 Transversotrema witenbergi Hunter & Cribb, 2012 38

3.2.3 Lecithochirium sp 40

3.2.4 Diplomonorchis sp 41

3.2.5 Helicometra cf manteri 44

B Lớp Monogenea (Sán lá đơn chủ) 46

vii

3.2.6 Bothitrema cotti Ermolenko & Lukjantschenko, 1988 46

3.2.7 Ligophorus vanbenedenii Euzet & Suriano, 1977 48

3.2.8 Haliotrema banana Lim & Justine, 2007 50

3.2.9 Haliotrema bihamulatum Yang & Liu, 2001 52

3.2.10 Pseudorhabdosynochus cupatus Kritsky & Beverley-Burton, 1986 54

C Lớp Cestode (sán dây) 55

3.2.11 Acanthobothrium brevissime Linton, 1909 55

3.2.12 Rhinebothrium sp (Type1) 58

D Lớp giun tròn (Chromadorea) 60

3.2.13 Hysterothylacium auctum (Con cái) (Rudolphi, 1802) 60

E Lớp giun đầu gai (Palaeacanthocephala) 62

3.2.14 Acanthocephalus parallelcementglandatus Heckmann & Ha, 2014 62

F Lớp giáp xác ký sinh (Maxillopoda) 64

3.2.15 Hatschekia sp (con đực) 64

3.2.16 Hatschekia manea (con cái) Jones & Cabral, 1990 66

3.2.17 Lepeophtheirus acutus (con cái) Heegaard, 1943 68

3.3 Tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài ký sinh trùng trên cá rạn san hô 70

3.4 Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng 75

3.4.1 Khuếch đại đoạn gen 28S rRNA của các loài ký sinh trùng 75

3.4.2 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ký sinh trùng 76

3.5 Nghiên cứu quá trình đồng tiến hóa giữa ký sinh trùng và cá rạn san hô 83

3.5.1 Quá trình đồng tiến hóa giữa sán lá song chủ và cá rạn san hô 83

3.5.2 Quá trình đồng tiến hóa giữa sán lá đơn chủ và cá rạn san hô 85

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91

mtDNA Mitochondrial Deoxyribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Số lượng và kích thước các loài cá nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR 27

Bảng 2.3 Thông tin của 25 loài KST sử dụng gen 28S rRNA trong NCHT và 41 loài trên GenBank 29

Bảng 3.1 Danh sách các loài KST thu được trên cá rạn san hô (Ký hiệu “_” các loài mô tả hình thái) 35

Bảng 3.2 Các thông số hình thái loài Bivesicula claviformis 36

Bảng 3.3 Các thông số hình thái loài Transversotrema witenbergi 38

Bảng 3.4 Các thông số hình thái loài Lecithochirium sp 40

Bảng 3.5 Các thông số hình thái loài Diplomonorchis sp 42

Bảng 3.6 Các thông số hình thái loài Helicometra cf manteri 44

Bảng 3.7 Các thông số hình thái loài Bothitrema cotti 46

Bảng 3.8 Các thông số hình thái loài Ligophorus vanbenedenii 48

Bảng 3.9 Các thông số hình thái loài Haliotrema banana 50

Bảng 3.10 Các thông số hình thái loài Haliotrema bihamulatum 52

Bảng 3.11 Các thông số hình thái loài Pseudorhabdosynochus cupatus 54

Bảng 3.12 Các thông số hình thái loài Acanthobothrium brevissime 56

Bảng 3.13 Các thông số hình thái loài Rhinebothrium sp (Type1) 58

Bảng 3.14 Các thông số hình thái loài Hysterothylacium auctum (con cái) 60

Bảng 3.15 Các thông số hình thái loài Acanthocephalus parallelcementglandatus (Con đực) 62

Bảng 3.16 Các thông số hình thái loài Hatschekia sp (con đực) 64

Bảng 3.17 Các thông số hình thái loài Hatschekia manea (con cái) 66

Bảng 3.18 Các thông số hình thái loài Lepeophtheirus acutus (con cái) 68

Bảng 3.19 Tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài KST trên cá rạn san hô tại Khánh Hòa 70

Bảng 3.20 Kết quả Parafit của các loài sán lá song chủ trên cá rạn san hô Giá trị P-value được tính toán sau khi phân tích 999 hoán vị ngẫu nhiên 84

Bảng 3.21 Kết quả Parafit của các loài sán lá đơn chủ trên cá rạn san hô Giá trị P-value được tính toán sau khi phân tích 999 hoán vị ngẫu nhiên 87

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Amphiprion polymnus 5

Hình 1.2 Epinephelus fasciatus 6

Hình 1.3 Synodus variegatus 7

Hình 1.4 Parupeneus multifasciatus 8

Hình 1.5 Vùng rDNA (5.8S, 18S, 28S) của vi sinh vật nhân thực 14

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 21

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 28S rRNA 27

Hình 3.1 Hình thái ngoài Bivesicula claviformis 37

Hình 3.2 Hình thái ngoài Transversotrema witenbergi 39

Hình 3.3 Hình thái ngoài Lecithochirium sp 41

Hình 3.4 Hình thái ngoài Diplomonorchis sp 43

Hình 3.5 Hình thái ngoài Helicometra cf manteri 45

Hình 3.6 Hình thái ngoài Bothitrema cotti 47

Hình 3.7 Hình thái ngoài Ligophorus vanbenedenii 49

Hình 3.8 Hình thái ngoài Haliotrema banana 51

Hình 3.9 Hình thái ngoài Haliotrema bihamulatum 53

Hình 3.10 Hình thái ngoài Pseudorhabdosynochus cupatus 55

Hình 3.11 Hình thái ngoài Acanthobothrium brevissime 57

Hình 3.12 Hình thái ngoài Rhinebothrium sp (Type1) 59

Hình 3.13 Hình thái ngoài Hysterothylacium auctum (con cái) 61

Hình 3.14 Hình thái ngoài Acanthocephalus parallelcementglandatus (Con đực) 63

Hình 3.15 Hình thái ngoài Hatschekia sp (con đực) 65

Hình 3.16 Hình thái ngoài Hatschekia manea (con cái) 67

Hình 3.17 Hình thái ngoài Lepeophtheirus acutus (con cái) 69

Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rRNA của các loài KST trên cá rạn san hô 76

Hình 3.19 Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rRNA của các loài KST 77

Hình 3.20 Cây đồng tiến hóa giữa các loài sán lá song chủ và cá rạn san hô 83

Hình 3.21 Cây đồng tiến hóa giữa các loài sán lá đơn chủ và cá rạn san hô 86

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Rạn san hô được biết đến là khu vực có mức độ đa dạng sinh học cao và đang nằm trong danh sách bị đe dọa Các loài cá rạn san hô rất đa dạng về loài, do màu sắc sặc sỡ

và mức độ đa dạng sinh học cao Loài cá sinh sống, phát triển ở rạn san hô được coi như

là nguồn thực phẩm cũng như nguồn lợi về mặt sinh thái, du lịch của hơn 1 tỉ người trên toàn thế giới Hiện nay, các nghiên cứu về sự đa dạng sinh học và thành phần ký sinh trùng trên cá rạn san hô thường bị bỏ qua và ít được biết đến Các báo cáo về thành phần

ký sinh trùng ở Việt Nam chủ yếu trên các loài cá nước ngọt và nước lợ Trên thế giới tập trung ở 2 khu vực có độ đa dạng sinh học lớn nhất thế giới là Great Barrier và New Caledonia

Nghiên cứu tiến hành thu 359 cá thể của 10 loài cá rạn san hô thuộc 4 họ (Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae) tại vịnh Nha Trang, Khánh Hòa từ tháng 10-2015 đến tháng 8-2016 Ký sinh trùng được thu, kiểm tra, nhuộm và đo các thông số để xác định hình thái Tình trạng nhiễm KST được đánh giá thông qua tỉ lệ nhiễm (%) và mật độ nhiễm (KST/cá nhiễm) Các loài ký sinh trùng được kiểm tra di truyền dựa vào trình tự gen 28S rRNA để xác định mối quan hệ tiến hóa của các loài Quá trình đồng tiến hóa được xây dựng dựa trên các loài sán lá song chủ, sán lá đơn chủ (28S rRNA)

và cá rạn san hô (16S rRNA)

Kết quả phát hiện được 25 loài KST thuộc 6 lớp, 11 bộ, 17 họ, 21 giống, 5 loài KST chưa xác định chính xác đến loài được báo cáo sự hiện diện Nghiên cứu hiện tại đã mô tả hình thái 17 loài ký sinh trùng được ghi nhận trên vật chủ mới và chưa có báo cáo rõ ràng Tỉ

lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài KST dao động trên các loài cá, tỉ lệ nhiễm cao nhất

là 89,74% đối với loài sán lá song chủ Macvicaria taksengi trên cá mối Synodus myops, thấp nhất là 2,56% đối với loài giáp xác Lepeophtheirus acutus trên cá khoang cổ Amphiprion clarkii Mật độ nhiễm cao nhất là 24 (KST/cá nhiễm) đối với loài sán lá đơn chủ Bothitrema cotti trên cá mối Synodus myops, thấp nhất là 1 (KST/cá nhiễm) đối với loài Transversotrema witenbergi, Taeniacanthus lagocephali, Haliotrema epinepheli, Acanthocephalus parallelcementglandatus, Rhinebothrium sp (Type1), Lepeophtheirus acutus, Hatschekia manea ký sinh trên cá phèn Parupeneus multifasciatus, cá mú Epinephelus bleekeri, cá mối (Synodus myops, S variegatus), cá khoang cổ (Amphiprion

xiii

clarkii, A polymnus, A perideraion) Nghiên cứu di truyền dựa vào trình tự gen 28S

rRNA của 25 loài ký sinh trùng và 41 loài trên GenBank cho thấy các loài KST đều nằm trên cùng 1 nhánh đồng dạng (monophyly) và thể hiện mối quan hệ gần gũi với nhau Tuy nhiên, ở mức độ bộ (Order), cũng có sự không phù hợp về đặc điểm hình thái và di truyền của một số nhóm loài Quá trình đồng tiến hóa cho thấy 5 cặp đồng tiến hóa được phát hiện giữa 8 loài sán lá song chủ (sử dụng gen 28S rRNA) và 10 loài cá rạn san hô (sử dụng gen 16S rRNA) với giá trị ý nghĩa P-value ≤ 0,001, 3 cặp đồng tiến hóa giữa 7 loài sán lá đơn chủ (sử dụng gen 28S rRNA) và 6 loài cá rạn san hô (sử dụng gen 16S rRNA) với P-value ≤ 0,047

Kết quả của đề tài nhằm bổ sung thêm dẫn liệu về thành phần ký sinh trùng trên các loài cá rạn san hô ở Việt Nam cũng như thế giới và sự đa dạng sinh học của các loài

ký sinh trùng trên cá rạn san hô

Từ khóa: Cá rạn san hô, đa dạng sinh học, ký sinh trùng, đồng tiến hóa, 28S rRNA

LỜI MỞ ĐẦU

Rạn san hô được biết đến là khu vực có mức độ đa dạng sinh học cao Kudla, 1997), và đang nằm trong danh sách bị đe dọa (Roberts et al., 2002; Jone et al., 2004) Hiện nay, các khu vực bảo tồn tốt nhất chứa hơn 700 loài san hô, 600 loài động vật thân mềm và gần 4000 loài cá (IRD, 2007; Spalding et al., 2001; Paulay, 1997) Các loài cá rạn san hô rất phổ biển trong ngành công nghiệp cá cảnh do màu sắc sặc sỡ và mức độ đa dạng sinh học cao (Alevizon, 1994) Loài cá sinh sống, phát triển ở rạn san

(Reaka-hô được coi như là nguồn thực phẩm cũng như nguồn lợi về mặt sinh thái, du lịch của hơn 1 tỉ người trên toàn thế giới (UNEP, 2004; Burke et al., 2002) Trong đó, có ít nhất 85% dân số dựa vào cá làm nguồn thực phẩm protein chủ yếu, còn lại là phục vụ cho nguồn lợi về đa dạng sinh thái và du lịch trên thế giới (UNEP, 2004)

Việc xuất khẩu các loài cá rạn san hô ở nước ngoài được coi là một nguồn lợi kinh

tế quan trọng (UNEP, 2004) Lợi nhuận thu được từ việc kinh doanh cá rạn san hô rất cao, trong khi 1 tấn cá kinh tế trị giá 6.000 USD thì 1 tấn cá rạn biển lên đến 496.000 USD (Burke et al., 2002)

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới với lợi thế là bờ biển dài chạy dọc theo đất nước nên hệ sinh thái san hô phong phú và một trữ lượng cá rạn san hô nhiều về chủng loại, đẹp về màu sắc (Nguyễn Văn Quân, 2005) Trong đó, vùng biển Khánh Hòa được xem là một trong những vùng cá rạn lớn trong nước với nhiều chủng loại, số lượng hiện

có hơn 400 loài cá rạn san hô có thể làm cảnh trong đó có rất nhiều giống loài đẹp và quý hiếm (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) Vịnh Nha Trang còn được biết đến là một trong những nơi có các giá trị đa dạng sinh học cao ở trong nước được đánh giá bởi các nhà khoa học và giữ một vai trò quan trọng ở các nước trong khu vực (Hà ký & Bùi Quang

Tề, 2007) Do gần với quần đảo Trường Sa về vị trí địa lý nên vùng biển vịnh Nha Trang

có số lượng loài cá rạn rất phong phú với trên 300 loài cá rạn san hô (Nguyễn Văn Quân, 2005) Cá rạn san hô chủ yếu tập trung vào 4 họ chính, đó là họ cá thia (Pomacentridae),

họ cá bàng chài (Labridae), họ cá đục (Synodontidae) và họ cá mú (Serranidae) (Hà ký

& Bùi Quang Tề, 2007; Đặng Thúy Bình và cs, 2014)

Từ năm 1960 đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khu hệ ký sinh trùng (KST) ký sinh trên cá nước ngọt ở miền Bắc Việt Nam (Hà Ký và cs, 2007), ở miền Trung và Tây nguyên (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) và ở Đồng bằng Sông Cửu Long (Bùi

Quang Tề, 2006) KST trên cá biển khai thác tại Khánh Hòa (Nguyễn Thị Hải Thanh,

2008), KST trên cá biển nuôi tại Khánh Hòa (Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, 2012) Tuy vậy, đến thời điểm hiện tại, ở Việt Nam, các nghiên cứu về khu hệ KST ký sinh trên các loài cá rạn san hô còn nhiều hạn chế

Mặc dù KST đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rạn san hô (Justine et al., 2010) nhưng đã từ lâu chúng được coi là một nhóm bị bỏ quên khi nói đến sự đa dạng sinh học (Sun et al., 2012) Điều này cũng được lý giải bởi nhóm tác giả là do kích thước nhỏ bé của chúng, nhưng thực tế KST đang ẩn bên trong vật chủ thích hợp (Justine et

al., 2010)

Trong tự nhiên, ký sinh trùng thường sống ký gửi vào vật chủ (cá, cua, ghẹ, tôm…), chúng sống bám hoàn toàn hoặc một phần vào loài khác (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) Bệnh kí sinh trùng gây nên rất nhiều tác hại cho con người, vì vậy, việc tìm hiểu

để biết triệu chứng, phòng bệnh và điều trị hiệu quả là điều cần thiết (Hà ký & Bùi Quang Tề, 2007) Bệnh do nhiễm ký sinh trùng thường gặp ở cá bao gồm bệnh sán lá

gan, sán lá phổi, giun đầu gai, sán dây… (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

Do đó, việc nghiên cứu sự đa dạng thành phần loài ký sinh trùng, mức độ nhiễm cũng như mối quan hệ tiến hóa của các loài ký sinh trùng trên các loài cá rạn san hô ở thế giới nói chung, các loài cá rạn thuộc họ Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae ở vịnh Nha Trang nói riêng là rất cần thiết Đồng thời, kết quả của đề tài nhằm bổ sung thêm dẫn liệu về thành phần KST trên các loài cá rạn san hô ở Việt Nam

cũng như thế giới Vì vậy, nghiên cứu “Đa dạng thành phần loài ký sinh trùng trên

một số loài cá rạn san hô (Họ: Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae) ở vịnh Nha Trang, Khánh Hòa” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát sự đa dạng thành phần loài, tỉ lệ nhiễm, mật độ nhiễm, mối quan hệ phát sinh chủng loại và quá trình đồng tiến hóa của các loài ký sinh trùng trên một số loài cá rạn san hô ở khu vực vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

Nội dung nghiên cứu

Phân loại và xác định thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá rạn san hô thuộc họ Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae, ở vịnh Nha Trang, Khánh Hòa

Xác định tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài ký sinh trùng trên các loài cá nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm di truyền dựa trên chỉ thị phân tử của gen nhân 28S rRNA, khảo sát mối quan hệ phát sinh loài và quá trình đồng tiến hóa của các loài ký sinh trùng

ký sinh trên các loài cá nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cá rạn san hô ở Khánh Hòa

Khánh Hòa là một tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, có hình dạng thon dài hai đầu và phình ra ở giữa, ba mặt giáp với núi và một mặt giáp với biển (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006) Tỉnh Khánh Hòa có tổng diện tích là 5197 km2, trong đó diện tích vùng biển rộng gấp nhiều lần so với đất liền, đường bờ biển dài 385 km kéo dài từ xã Đại Lãnh tới cuối vịnh Cam Ranh (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006)

Vùng biển Khánh Hòa thuộc miền biển Nam Trung bộ của Việt Nam, có gần 400 loài cá rạn san hô có màu sắc rực sỡ Cá rạn san hô chủ yếu ở đây bao gồm 4 họ chính,

đó là họ cá thia (Pomacentridae), họ cá bàng chài (Labridae), họ cá đục (Synodontidae)

và họ cá mú (Serranidae) (Hà ký & Bùi Quang Tề, 2007)

Với những lợi thế về vị trí địa lí và khí hậu ôn hòa, tỉnh Khánh Hòa có nguồn tài nguyên đa dạng phong phú, đặc biệt là nguồn tài nguyên biển (Mai Chi, 2013) Độ đa dạng sinh học các loài sinh vật biển cao, có tới 350 loài san hô đang phát triển, chiếm 45% loài được tìm thấy trên thế giới Khánh Hòa trước đây là nơi chịu ít sự tác động của biến đổi khí hậu hơn các tỉnh khác Nhưng hiện nay, biến đổi khí hậu đã và đang ảnh hưởng trực tiếp đến Khánh Hòa, mực nước biển cũng có xu thế gia tăng, bước đầu xác định được những vùng nhạy cảm, có nguy cơ bị ảnh hưởng cao do tác động của khí hậu biến đổi (Nguyễn Tác An & Nguyễn Kỳ Phùng, 2014)

Theo nghiên cứu của Viện Hải Dương Học Nha Trang, 2002 -2003, tại các rạn san

hô ở quần đảo Trường Sa, đã xác định cá cảnh biển ở đây có 44 họ, 131 giống, 332 loài, với số lượng loài như vậy đây là vùng có số lượng cá cảnh biển đa dạng nhất tại biển Việt Nam

1.2 Tổng quan về cá rạn san hô trong nghiên cứu

1.2.1 Cá khoang cổ Amphiprion spp (Họ Pomacentridae)

❖ Phân loại và phân bố

Cá khoang cổ thuộc giống Amphiprion gồm khoảng 27 loài, phân bố rộng trong

vùng nước ấm của Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương (Aphne & Gerald, 1992) Trong

đó tại Việt Nam xác định có 7 loài cá khoang cổ, toàn bộ cá khoang cổ phân bố tại Việt

Nam đều thuộc giống Amphiprion (Hà Lê Thị Lộc và cs, 2009)

Ngành Chordata Bateson, 1885

Lớp Actinopterygii Huxley, 1880

Bộ Perciformes

Họ Pomacentridae

Giống Amphiprion Welander 1953

Loài Amphiprion spp Hình 1.1 Amphiprion polymnus

Cá khoang cổ phân bố nhiều ở vùng biển miền Trung, mà chủ yếu là ở tỉnh Khánh Hòa, chúng cư trú trong một số hòn đảo của Nha Trang như hòn Tằm, hòn Miếu, hòn Mun, hòn Tre… (Hà Lê Thị Lộc và cs, 2009)

và trội nhất trong đàn sẽ biến đổi giới tính để thay thế cá thể cái, tuy nhiên có những cá thể vẫn giữ mãi giới tính đực cho đến khi chết (Allen, 1972)

Cá khoang cổ gồm những loài sống ở rạn san hô, nơi có độ mặn trung bình 35‰ Trong tự nhiên cá khoang cổ cộng sinh bắt buộc với hải quỳ, đa số chỉ cộng sinh với một loài hải quỳ nhưng có một số loài cộng sinh trên nhiều loài hải quỳ khác nhau

32-Cá khoang cổ ăn những chất có khả năng gây hại mà hải quỳ không hấp thu được cũng như là nguồn cung cấp thức ăn cho hải quỳ (Hà Lê Thị Lộc, 2002)

Trong tự nhiên, cá khoang cổ thường sống theo đôi hoặc sống theo đàn, sinh trưởng chậm, thức ăn chính là mùn bã hữu cơ và động vật đáy (Fautin & Allen 1992) Kích thước của cá khoang cổ phụ thuộc vào vật chủ hải quỳ mà chúng sống cộng sinh Cá sống với

hải quỳ kích thước lớn sẽ tăng trưởng nhanh hơn cá sống với hải quỳ kích thước nhỏ (Fautin, 1991)

Giống Epinephelus Bloch 1793

Loài Epinephelus spp Hình 1.2 Epinephelus fasciatus

Cá mú (còn gọi là cá song) thuộc loại cá biển, có giá trị kinh tế cao Chúng phân

bố nhiều nhất ở các nước Trung Quốc, Đài Loan, Hồng Kông, Nhật Bản, Malaysia, Singapore, Philippines, Thái Lan, Việt Nam…Ở nước ta có 72 loại cá mú, trong đó 7

loài có giá trị kinh tế cao, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu: cá mú vạch (Epinephelus brunneus),

cá mú chấm tổ ong (E merra), cá mú chấm đỏ (E akaara), cá mú hoa nâu (E fuscoguttatus), cá mú đỏ (E fasciatus), cá mú đen chấm nâu (E coioides), cá mú mỡ (E tauvina) (Võ Văn Quang và cs, 2015)

❖ Đặc điểm sinh học

Cá mú thích sống ở các hốc đá, vùng ven bờ quanh các đảo có đá san hô, nơi có

độ sâu từ 10-30m Cá thích hợp ở nhiệt độ từ 22-28oC, cá bắt đầu bỏ ăn ở mức 15oC, cá hầu như không hoạt động Cá mú chịu được độ mặn trong giới hạn 11-41‰ (Lê Đình Bửu, 2002)

Cá mú thuộc nhóm cá dữ, thức ăn chủ yếu là động vật phù du, có tập tính rình bắt mồi ở nơi yên tĩnh Cá mú có tính tranh giành thức ăn dữ dội Khi thiếu thức ăn, chúng

có thể ăn thịt lẫn nhau Cá con mới nở ăn động vật phù du Khi lớn lên, cá ăn các loại cá con, tôm, mực… Cá thích ăn mồi sống, không ăn mồi chết và thức ăn chìm ở đáy Trong môi trường nuôi nhốt, thường cho cá ăn thức ăn tự chế biến từ các nguồn nguyên liệu

có sẵn ở địa phương như: cá tạp, cua, ốc, các phụ phế phẩm… (Đào Mạnh Sơn & Đỗ Văn Nguyên, 2002)

Tốc độ tăng trưởng của cá mú tùy thuộc vào từng loài Với cá giống cỡ 8-12cm, trung bình nuôi từ 8-10 tháng thì được cá thương phẩm cỡ 500g/con (Đào Mạnh Sơn, 2002)

Cá mú thành thục lần đầu khi đạt khoảng 3 năm tuổi Mùa vụ sinh sản của cá mú tùy thuộc vào từng vùng địa lý Ở phía Bắc nước ta, cá mú sinh sản vào tháng 5-7; ở miền Trung và miền Nam mùa sinh sản rơi vào tháng 12 đến tháng 3 năm sau Hệ số thành thục và sức sinh sản của cá mú tùy theo loài (Đào Mạnh Sơn, 2002)

Cá mú có tập tính chuyển đổi giới tính, cá còn nhỏ dưới 50cm đều là cá cái, khi đạt chiều dài 70cm trở lên thì chuyển thành cá đực (Lê Đình Bửu, 2002)

1.2.3 Cá mối Synodus spp (Họ Synodontidae)

❖ Phân loại và phân bố

Ngành Chordata Bateson, 1885

Lớp Actinopterygii Huxley, 1880

Bộ Aulopiformes

Họ Synodontidae

Giống Synodus Scopoli, 1777

Loài Synodus spp Hình 1.3 Synodus variegatus

Cá mối là loài cá có thể đánh bắt quanh năm tại vùng bờ biển miền Trung Việt Nam, từ Quảng Ngãi xuống đến Nha Trang và cả tại Vũng Tàu Chúng còn phân bố ở vùng biển Thái Bình Dương, dọc bờ biển duyên hải phía tây Hoa Kỳ, một số loài sống

ở vùng nước sâu tới 400m, còn đại bộ phận sống ở vùng gần bờ Trên thế giới có tới 73

loài cá mối thuộc 3 giống (Froese et al., 2016), trong đó, ở vùng biển nước ta đến nay,

đã phát hiện được 16 loài thuộc 3 giống Saurida, Synodus, Harpodon (Trần Văn Thanh

và cs, 2013)

❖ Đặc điểm sinh học

Các loài thuộc họ cá mối là loài cá dữ, thức ăn của chúng gồm khá nhiều chủng loại, nhưng chủ yếu là cá, chiếm tỉ lệ trên dưới 70% và loại thức ăn khác bao gồm tôm, mực (Trần Văn Thanh, 2013)

Cá mối có tốc độ lớn nhanh, tốc độ tăng trưởng giảm và trọng lượng tăng khi cá lớn, cá mối có sức sinh sản lớn, mùa đẻ kéo dài, có loài hầu như đẻ quanh năm nhưng chủ yếu vào mùa lạnh Cá cái có kích thước lớn hơn cá đực (Thái Thanh Dương, 2007)

Các loài cá mối xuất hiện ở độ sâu 70-100 m, nơi có đáy cát hoặc cát pha bùn, nồng độ muối cao khoảng 33-34 ‰, một số loài sống ở vùng nước sâu 400 m (Thái Thanh Dương, 2007)

Trứng cá mối có dạng hình cầu, thụ tinh ngoài tự nhiên, nổi trên mặt nước, tách rời nhau, đường kính 1,01 – 1,34 mm, noãn hoàng nhẵn, không màu (Thái Thanh Dương, 2007)

Ở vịnh bắc bộ, cá mối có xu hướng di chuyển vào bờ hoặc ra khơi theo mùa rõ rệt, vào mùa hè, ở vùng nước nông hơn 60 m trở vào bờ số lượng cá đánh bắt được tăng lên

rõ rệt và ngược lại ở vùng nước sâu lại giảm đi Mùa đông cá di chuyển về phái Nam theo hướng dòng chảy và dọc theo đường thẳng sâu 70 -100 m Mùa hè cá di chuyển về phía Bắc, tạo thành khu tập trung bãi cá vào tháng 8-9 (Trần Văn Thanh và cs, 2013)

Giống Parupeneus Bleeker, 1863

Loài Parupeneus spp Hình 1.4 Parupeneus multifasciatus

Cá phèn là loài cá nhiệt đới và có khuynh hướng sống trong các vùng nước ấm hơn của trái đất Trong quá trình phát triển, chúng có thể được phát hiện trong các đàn cá thuộc các loài cá khác, nhưng không ở lại lâu Cá phèn thường thấy ở các vùng nước nhiệt đới của Đại tây dương và Thái bình dương Mặc dù nước mặn là môi trường sống bình thường, chúng cũng tồn tại ở các sông và vùng nước ngọt khác Chúng cũng không

có tính cộng đồng, phần lớn trong cuộc đời sống đơn độc (Randall & Kulbicki, 2006)

❖ Đặc điểm sinh học

Nguồn thức ăn của cá phèn là cá nhỏ, động vật giáp xác, giun biển và động vật thân mềm Cá phèn có những sợi râu nhỏ từ cằm, những cơ quan đặc biệt ở những râu này giúp chúng cảm nhận và tìm kiếm mồi Cá thường ở mực nước sâu 150 - 300m, cơ quan ở râu hiệu quả đến nỗi chúng cảm nhận được con mồi ở tận đáy biển Một số loài

ăn đêm, một số đi săn vào ban ngày (Cressey, 1986; Randall & Kulbicki, 2006)

Cá phèn là những loài cá đẻ trứng ngoài biển cả; nghĩa là chúng sẽ đẻ nhiều trứng nhỏ trôi nổi trên mặt nước và các trứng này sẽ trôi theo dòng nước khoảng 4-8 tuần cho đến khi nở và phát triển râu Cá phèn chưa trưởng thành thường thích sống ở khu vực đáy mềm, trong thảm cỏ biển và thay đổi môi trường sống khi chúng phát triển Hầu hết các loài đến sự trưởng thành và sinh sản sau đó một hoặc hai năm (Uiblein, 2007) Tất cả các loài cá phèn đều có khả năng thay đổi màu sắc, phụ thuộc vào hoạt động

sinh sống của chúng Giống như cá phèn yên vàng (Parupeneus cyclostomus) sẽ thay

đổi màu từ màu vàng chanh sang màu kem nhạt trong khi kiếm ăn (Lim & Justine, 2007; Hendrix, 2004)

Tính ăn của cá phèn thay đổi theo giai đoạn phát triển của cơ thể Điểm chung nhất của các loài cá phèn là khi mới nở từ trứng, dinh dưỡng được cung cấp bằng noãn hoàng Đây là quá trình dinh dưỡng bên trong Hết noãn hoàng cá chuyển sang tìm kiếm thức

ăn trong môi trường nước Thức ăn thích hợp cho giai đoạn này (ấu trùng) là động vật phù du có kích thước phù hợp với khả năng bắt mồi của cá Sau giai đoạn này, cá chuyển sang ăn thức ăn của chúng (Randall & Kulbicki, 2006)

1.3 Tình hình nghiên cứu KST trên cá rạn san hô

1.3.1 Thế giới

Các nghiên cứu về sự đa dạng thành phần loài ký sinh trùng được quan tâm nhiều ở

2 khu vực rạn san hô có độ đa dạng sinh học lớn nhất thế giới: Great Barrier và New Caledonia (Justine et al., 2010; Justine et al., 2012) Rất nhiều loài ký sinh trùng được tìm thấy chủ yếu trên các loài cá mú thuộc giống Epinephelus, cá phèn thuộc họ Mullidae

(Justine, 2010; Justine et al., 2010; Justine et al., 2012)

Grutter (1999) nghiên cứu KST trên 7 loài cá rạn san hô trên một số đảo thuộc

Australian là Hemigyrnnus melapterus (Labridae), Siganus doliatus (Siganidae), Scolopsis bilineatus (Nemipteridae), Thalassoma lunare (Labridae), Scarus sordidus (Scaridae), Ctenochaetus stnatus (Acanthuridae), và Acanthochromis polyacanthus (Pomacentridae) cho thấy số lượng KST nhiễm trên cá Hemigyrnnus melapterus là cao nhất lên đến 110 trùng/cá, sau đó là cá Siganus doliatus và Scolopsis bilinea trên 20 trùng/cá Ở loài Thalassoma lunare và Scarus sordidus chỉ cảm nhiễm từ 1-5 trùng/cá

Tuy nhiên số lượng KST ký sinh trên các loài cá giữa các đảo lại không chênh lệch nhau

Cribb et al (2000) đã khảo sát thành phần ký sinh trùng trên 386 cá thể cá rạn san

hô ở New Caledonia và cho thấy tỉ lệ nhiễm của ký sinh trùng thuộc lớp sán lá song chủ (trematode) trên cá không cao, cao nhất là 13.15% và mật độ nhiễm cao (23 KST/cá nhiễm)

Nghiên cứu của Zouhir et al (2007) kiểm tra ký sinh trùng trên tổng số 1131 cá thể cá rạn san hô ở Algeria, kết quả cho thấy 9 loài ký sinh trùng có tỉ lệ nhiễm thấp (0,92% - 33,33%) trong tổng số 68 cá thể KST thu được trên một số loài cá rạn san hô, các loài KST phát hiện bao gồm các lớp sán lá song chủ, sán lá đơn chủ, giun tròn và giáp xác

Watchariya & Nontawith (2008) khảo sát thành phần giáp xác ký sinh Copepod trên 61 loài cá biển ở vịnh Thái Lan, tỉnh Chon Buri, tổng cộng 18 giống, 39 loài được

phát hiện, trong đó số lượng loài Caligus spp chiếm tỉ lệ cao nhất (10 loài Caligus spp trên 9 loài cá), tiếp theo là Lernanthropus spp và Ergasilus spp tương ứng tìm thấy 6

và 4 loài trên 5 và 4 loài cá

Nghiên cứu của Edgar et al (2008) phát hiện được 2 loài sán lá đơn chủ mới

(Monogenean) thuộc giống Diplectanum (Diplectanidae) và 1 giống mới thuộc họ

Dactylogyridae từ mang của các loài cá biển thuộc lớp cá vây tia từ Đại tây dương, phía

nam vịnh Mexico và Trung mỹ (Panama) Giống Diplectanum có sự khác nhau về mặt

hình thái cơ quan giao cấu, đĩa bám và kích thước tinh hoàn nhưng có mối quan hệ gần gũi với nhau trong quá trình biệt hóa

Carrie et al (2009) khảo sát ký sinh trùng trên 1850 mẫu ruột của các loài cá biển

thuộc họ cá đuối Dasyatidae từ biển Arafura ngoài khơi phía bắc nước Úc Kết quả phát

hiện được 5 loài sán dây chủ yếu thuộc giống Acanthobothrium (Tetraphyllidea), trong

đó, loài Acanthobothrium oceanharvestae được ghi nhận là loài mới và có sự khác biệt

với các loài còn lại về số lượng, kích thước tinh hoàn và lỗ sinh dục

Justine (2010) nghiên cứu thành phần ký sinh trùng ở khu vực New Caledonia, tác giả phát hiện được 371 loài KST, trong đó KST thuộc ngành Platyhelminthes là nhóm lớn nhất với 239 loài bao gồm 105 loài sán lá song chủ, 98 loài sán lá đơn chủ monogenea, 61 loài giáp xác, 41 loài giun tròn và 132 loài thuộc các ngành khác

Justine et al (2012) khảo sát 207 loài cá rạn san hô chủ yếu là các họ Lutjanidae,

Nemipteridae và Caesionidae ở New Caledonia và tìm thấy 58 loài KST xác định đuợc

tới loài với sự hiện diện của isopods (4), copepod (6), monogenea (11), digenea (21), cestodea (7), và nematode (9)

Theo Sun et al (2012) khảo sát tỉ lệ nhiễm của ký sinh trùng trên các giai đoạn phát triển của 401 cá thể cá rạn san hô của cùng một loài trong vòng 7 tháng từ giai đoạn

ấu trùng đến trưởng thành, kết quả cho thấy cá rạn san hô bị nhiễm cao nhất ở giai đoạn

ấu trùng (97%), còn đối với các cá thể cá giai đoạn khác thì tỉ lệ nhiễm chỉ khoảng 60% Delane (2012) báo cáo về thành phần loài ký sinh Monogenean trên mang cá hồng

ở khu vực biển phía tây Thái Bình Dương và vịnh Mexico Tổng cộng 21 loài Monogenean ký sinh trên 29 loài cá hồng (Lutijanidae) được phát hiện, chủ yếu là các

loài thuộc giống Euryhaliotrema Trong đó, 16 loài mới được phats hiện, và 11 loài đã

được mô tả trước đây

Daisuke & Kazuya (2013) đã mô tả 4 loài giáp xác mới thuộc giống Hatschekia (Copepod) trên các loài cá rạn thuộc họ cá nóc (Tetraodontidae) ở đảo Ryukyu, Nhật

Bản Kết quả cho thấy các loài thuộc giống Hatschekia có sự khác biệt với các loài khác

bởi các đặc điểm quan trọng như dạ dày lớn, có khung kitin trên đầu ngực, thân hình thoi kết hợp với thùy sau phát triển

Ian et al (2014) khảo sát sự đa dạng các loài ấu trùng sán dây (metacestodes) trên

các loài cá rạn san hô thuộc lớp cá vây tia (bao gồm Cá mú, cá hồng, cá đổng) ở Australia

và New Caledonia Hơn 12000 cá thể cá được thí nghiệm và thu được 33 loài ấu trùng sán dây, trong đó chủ yếu ở các bộ Gymnorhynchoidea (5), Lacistorhynchoidea (14), Otobothrioidea (5), Tentacularioidea (9), trong đó, 3 loài thuộc bộ Tentacularioidea chưa có tên phân loại trong danh sách KST-vật chủ

Yuan et al (2015) phát hiện được 2 loài mới thuốc giống Haiotrema trên các loài

cá rạn thuộc họ cá đuôi gai (Acanthurus nigrofuscus và A triostegus) ở biển phía Nam Trung Quốc Tác giả cho thấy loài Haliotrema nanhaiense thu được khác với các loài thuộc giống Haliotrema còn lại bởi cơ quan giao cấu đực phức tạp bao gồm 1 ống giao cấu hình chữ C và một đĩa hình lưỡi liềm, loài Haliotrema triostegum có cơ quan giao

cấu hình cái cúp nối với ống giao cấu hình chữ L và các gai kitin nhô ra từ phần bên

1.3.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, một số báo cáo phổ biến về thành phần ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt và nước lợ (Pham et al., 2009; Dinh et al., 2010; Vo et al., 2008; Dang et al.,

Bùi Quang Tề (1998) đã phát hiện 10 giống KST thuộc 7 họ, 5 bộ, 5 lớp, 4 ngành

ký sinh trên 3 loài cá mú nuôi lồng tại vịnh Hạ Long trong đó loài sán lá đơn chủ

Pseudorhabdosynochus epinepheli và Ancyrocephalus sp ký sinh ở mang với tỉ lệ

nhiễm rất cao 71,4 – 93,8%

Arthur & Bui (2006) hệ thống khu hệ KST cá biển và nước ngọt tại Việt Nam bao gồm 453 loài ký sinh trùng gồm 48 loài Protozoa, Myxozoa (33 loài), Digenea (151 loài), Monogenea (112 loài), Cestoda (16 loài), Nematoda (53 loài), Acanthocephala (21 loài), Hirudinea (2 loài), Branchiura (3 loài), Copepoda (12 loài), và Isopoda (2 loài) Nguyễn Thị Ngọc Diễm (2007) khi nghiên cứu về thành phần KST trên cá giò

Rachycentron canadum đã phát hiện được 20 loài KST thuộc 18 giống, 15 họ, 12 bộ, 9

lớp và 4 ngành Trong đó có 7 loài KST đơn bào và 13 loài KST đa bào Kết quả phát hiện 2 loài KST thuộc lớp giáp xác ký sinh trên cá biển và được mô tả ở Việt Nam Nguyễn Văn Hà và cs (2012) nghiên cứu thành phần loài giun sán ký sinh trên một

số loài cá biển ở vịnh Hạ Long Kết quả khảo sát 127 cá thể cá biển tìm thấy được 4 loài

sán lá song chủ (Digenea) Hemiurus arelisci và Parahemiurus sp (họ Hemiuridae), Cetiotrema carangis (họ Gorgoderidae), và Stephanostomum ditrematis (họ

Acathocolpidae)

1.3.3 Khánh Hòa

Phan Văn Út (2006) nghiên cứu bệnh do sán lá đơn chủ Monogenea ký sinh trên

cá mú Epinephelus spp và cá hồng Lutijanus argentimaculatus nuôi lồng tại Khánh

Hòa, kết quả tìm thấy sán lá đơn chủ cảm nhiễm với cường độ cao 30-40 KST/cá và

TLCN là 100% Nghiên cứu cũng chỉ ra được một số phương pháp trị bệnh có hiệu quả bằng phương pháp tắm đối với bệnh do sán lá đơn chủ (Monogenea) gây ra ở cá mú

Võ Thế Dũng và cs (2008) khảo sát tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng trên 3 loài cá biển ở

Khánh Hòa là cá đối (Mugil cephalusi) và 2 loài cá mú (Epinephelus coioides và E bleekeri) Kết quả cho thấy các loài cá trên đều bị nhiễm ấu trùng sán lá song chủ (metacercariae), cụ thể là các loài Heterophyopsis continua và Pygidiosis summa đã được tìm thấy ở cá mú Tỉ lệ nhiễm Heterophyopsis continua nằm trong khoảng 2,0 – 6,0% Tỉ lệ nhiễm Pygidiosis summa trên cá đối nhìn chung rất cao, từ 17,6 – 75,5% cao hơn đáng kể so với Heterophyopsis continua (2,5 – 32,4%)

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải Thanh (2008) trên 3 giống cá cảnh biển

(Amphiprion, Halichoeres, Chaetodon) ở Nha Trang, Khánh Hòa đã phát hiện 22 loài

ký sinh trùng trên 218 cá thể cá Trong đó, sán lá song chủ (Digenea) có số lượng loài với tỉ lệ nhiễm cao nhất (9 loài), sán lá đơn chủ (Monogenea), sán dây (Cestoda) và giun tròn (Nematoda) mỗi lớp có 3 loài, giáp xác (Copepoda) có 2 loài và nguyên sinh động vật (Protozoa), đỉa (Hirudinea) mỗi lớp có 1 loài

Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn (2008) tìm thấy 14 loài KST thuộc 14 giống, 14 họ,

12 bộ, 6 ngành trên cá chẽm Lates calcarifer tại Khánh Hòa

Dang et al (2013) phát hiện 9 loài ấu trùng sán lá song chủ trên các loài cá tra (Pangasianodon hypophthamus), cá rô đồng (Anabas testudineus) và cá đối (Liza tade)

Tỉ lệ cảm nhiễm dao động tùy theo loài metacercariae và loài cá nghiên cứu, thấp nhất

là 2,13% đối với Centrocestus formosanus trên cá tra và cao nhất là 83,33% đối với Procerovum sp trên cá đối

Đặng Thị Kim Hường (2016) khảo sát sự đa dạng thành phần loài KST ký sinh

trên 3 loài cá mó (Iniistius baldwini), cá dò (Siganus canaliculatus) và cá dìa (Siganus guttatus) Kết quả phát hiện được 9 loài KST bao gồm 4 loài trên cá mó, 6 loài trên cá

dò và 2 loài trên ca dìa, trong đó sán lá đơn chủ Monogenean (2), sán dây Cestodes (2), sán lá song chủ Digenea (2), giun tròn Nematode (1), giun đầu gai Acanthocephala (1)

và giáp xác Crustacea (1)

1.4 Tổng quan về sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa ở KST 1.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của DNA ribosome (rDNA)

rDNA là nhóm gen mã hóa của ribosome, đóng vai trò quan trọng các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được quan tâm nghiên cứu rất sớm vì nó là một gen có

nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein (White et al., 1989)

RNA ribosome (rRNA) là nhóm gen mã hóa từ rDNA và liên quan đến các yếu tố

di truyền được nghiên cứu trong hơn sáu thập kỷ (Noller, 2005), với lợi ích từ các điều tra sinh hóa để so sánh nghiên cứu sinh học về các thông tin cấu trúc, chức năng và đặc

điểm tiến hóa của các phân tử này (Gillespie et al., 2006)

rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome, rRNA chiếm tỉ lệ cao trong tế bào

có thể đến 75% của tổng RNA Ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng

được đặc trưng bởi hằng số lắng S (White et al., 1989)

Eukaryote: ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm 2 đơn vị:

Đơn vị lớn (60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S

Đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S

Prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 đơn vị:

Đơn vị lớn (50S): có loại rRNA 23S; 5S

Đơn vị nhỏ (30S): có rRNA 16S

Hình 1.5 Vùng rDNA (5.8S, 18S, 28S) của vi sinh vật nhân thực

Trong gen rRNA, tỉ lệ tiến hóa khác nhau dựa trên sự thay thế trình tự của các vùng

bảo tồn rRNA (Cannone et al., 2002; Misof et al., 2002; Baele et al., 2006) Tỉ lệ thay

thế thậm chí còn nhanh hơn trong vùng phiên mã và vùng không mã hóa, cho thấy mức

độ cao về sự khác nhau của các loài, ngay cả khi so sánh mối quan hệ gần gũi của các

loài (Osorio et al., 2005)

Các rDNA 5.8S, 18S, 28S phiên mã thành các rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ các vùng

phiên mã trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) (Hình 1.5.) Giữa các nhóm

gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có

vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại rDNA 5S thường chỉ có ở nhân

(Guarro Josep et al., 1999)

Trong nhiều sinh vật nhân chuẩn, các gen RNA ribosome (rRNA) được lặp đi lặp lại liên tục, với mỗi lần lặp lại, gen mã hóa 18S, 5.8S và 28S rRNA được phân tách ra khỏi gen ITS (internal transcribed spacers) sau quá trình phiên mã Mỗi lần lặp lại được sao chép bởi enzyme RNA Polymerase I và các rRNA sau khi mã hóa tạo thành phức hợp kết hợp với protein (Eichler & Craig, 1994; Maxwell & Fournier, 1995)

Bộ gen của sinh vật nhân chuẩn có chứa nhiều nhóm trình tự lặp đi lặp lại, bao gồm các gen ribosome 5S Sinh vật nhân chuẩn thấp hơn và cao hơn cho thấy sự khác nhau của tổ chức gen 5S (Selker et al., 1981) Trong loài nấm Neurospora crassa, phần lớn 100 bản sao của gen 5S được phân bố rộng trong bộ gen (Metzenberg et al., 1985)

Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae, hầu hết các gen 5S được sắp xếp như một

phần không thể thiếu của các đơn vị mã hóa di truyền cho RNA ribosome, mặc dù một

số mảng độc lập vẫn được tìm thấy ở một vị trí nhiễm sắc thể (McMahon et al., 1984)

Gen 5S từ tất cả các loài được chứng minh là có một đặc điểm chung, đó là quá trình tiến hóa phối hợp (Concerted evolution), quá trình tiến hóa này cũng được quan sát trong tất cả các nhóm gen khác, được đặc trưng bởi các nhóm khác nhau của các gen hiển thị mức độ cấu trúc tương đồng cao trong mỗi loài (Coen et al., 1982; McMahon

et al., 1984; Samson & Wegnez, 1984; Morzycka-Wroblewska et al., 1985)

Vùng IGS được tách ra khỏi tiểu đơn vị lớn của gen rRNA (LSU) (mã hóa gen 5.8S và 28S rRNA) và tiểu đơn vị nhỏ của gen rRNA (SSU) (mã hóa gen 18S rRNA) sau quá trình phiên mã Đoạn IGS có chứa các vị trí khởi đầu quá trình phiên mã, đánh dấu sự khởi đầu đoạn 5’ của gen external transcribed spacer (ETS) (Murray et al., 2000)

Vùng ITS là vùng có nhiều biến đổi, thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro Josep et al., 1999)

1.4.2 Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

Kirsten & Stephen (2010) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài thuộc họ sán dây Tetraphyllidean và Rhinebothriidean trên cá rạn ở vịnh Mexico dựa vào gen 28S rRNA Tổng cộng 198 loài sán dây thuộc 23 giống bao gồm các loài trên GenBank được

sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài Cây phát sinh loài cho thấy các loài sán dây được chia thành 8 nhóm chính dựa vào đặc điểm hình thái kết hợp với di truyền, các nhóm nhỏ của 8 nhóm chính có các đặc điểm chung bao gồm 4 giác lớn ở đỉnh đầu, cơ thể hình bầu dục và giác bám lớn ở trung tâm

Dang et al (2010) khảo sát thành phần loài sán lá đơn chủ Monogenean trên 85 cá thể cá mú thuộc 2 loài Epinephelus coioides và E bleekeri tại biển Nha Trang Dựa vào

đặc điểm di truyền, chỉ thị phân tử 28S rRNA, 18S rRNA và ITS (ITS1 + 5.8S + ITS2) rDNA được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài dựa trên 49 loài monogenea bao gồm các loài trên GenBank Nghiên cứu đã mô tả 3 loài Monogenean thuộc giống

Haliotrema dựa vào đặc điểm hình thái

Hoàng Kim Quỳnh & Đặng Thúy Bình (2010) phân loại một số loài sán lá đơn chủ

(Monogenea) thuộc giống Pseudorhabdosynochus ký sinh trên cá mú (Epinephelus

spp.) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền Kết quả phát hiện được 10 loài sán lá đơn chủ, trong đó 2 giống chưa xác định đến loài Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen

28S rRNA cho thấy các loài thuộc giống Pseudorhabdosynochus có mối quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh, các loài không thuộc giống Pseudorhabdosynochus

thể hiện sự khác biệt rõ ràng trong cây phát sinh loài

Freeman et al (2013) phân tích trình tự gen 18S rRNA, 16S rRNA và CO1 mtDNA

của các loài giáp xác thuộc họ Caligidae ký sinh trên các loài cá dìa và cá nóc ở Nhật

Bản Kết quả cho thấy mối quan hệ gần gũi của các loài giáp xác thuộc giống Caligus

và Lepeophtheirus trên cây phát sinh loài dựa trên thuật toán Maximum likelihood, tuy nhiên, các loài giáp xác thuộc giống Pseudocaligus lại có quan hệ gần gũi với các giống Caligus hơn các giống khác

Soyoung & Wonchoel (2013) sử dụng gen COI mtDNA của hệ gen ty thể để xác

định 7 loài giáp xác thuộc giống Hatschekia trên các loài cá mú Epinephelus spp ở bờ

biển New Caledonia Kết quả cho thấy sự phù hợp về đặc điểm hình thái và di truyền

khi phân loại các loài giáp xác, trong đó, tác giả mô tả 3 loài Hatschekia maculatus, H cyanopodus và H cadenati

Vũ Đặng Hạ Quyên và cs (2013) nghiên cứu thành phần ký sinh trùng trên cá tra

(Pangasianodon hypophthamus) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền Kết quả phát

hiện được 9 loài KST bao gồm trùng bào tử, trùng lông, sán lá đơn chủ, sán lá song chủ

và giun tròn Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rRNA cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các loài sán lá đơn chủ với nhau (sự khác biệt trình tự 2,2 đến 2,9%) và đối với các loài sán lá song chủ (sự khác biệt trình tự 18,55 và 18,7 %)

Douniazed et al (2014) phát hiện 2 loài sán lá song chủ mới thuộc giống Saturnius

trên 22 cá thể cá đối (Mugilidae) ở phía tây bờ biển Địa Trung Hải của Algeria dựa vào hình thái và di truyền Cây phát sinh loài dựa vào gen 28S rRNA của 15 loài KST cho

thấy 2 loài mới thuộc giống Saturnius có quan hệ gần gũi với các loài khác và sự khác

biệt di truyền đối với 2 loài này là 0.9%

Fathy et al (2015) khảo sát một số loài giun tròn trên 80 cá thể cá bơn (Solea solea) ở bờ biển thành phố Alexandria dọc theo biển Địa Trung Hải, Ai Cập Kết quả phát hiện được một loài giun tròn thuộc giống Hysterothylacium (Anisakidae) trên vật chủ mới và sử dụng chỉ thị phân tử 18S rRNA để định danh tới loài Hysterothylacium aduncum, cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc giống H aduncum và Hysterothylacium sp

Zhao et al (2016) xác định các đặc điểm hình thái và di truyền của loài giun tròn Hysterothylacium reliquens trên các loài cá bơn ở Trung Quốc Nghiên cứu mô tả hình thái và các đặc điểm quan trọng của loài Hysterothylacium reliquens dựa trên các chỉ

tiêu phân loại Kết quả di truyền của trình tự gen 28S rRNA, Cox2 mtDNA và ITS rDNA cho thấy sự phù hợp về đặc điểm hình thái và di truyền khi định danh tới loài dựa trên chỉ tiêu hình thái ban đầu

1.4.3 Nghiên cứu quá trình đồng tiến hóa

Một trong những chủ đề hấp dẫn nhất trong sinh học tiến hóa là sự phát triển của quá trình đồng tiến hóa (coevolution) giữa các loài sinh vật (Filipiak et al., 2016) Sự tương tác và cạnh tranh giữa các quần thể sinh vật trong tự nhiên đã khiến các nhà nghiên cứu bắt đầu kết hợp quá trình đồng tiến hóa (coevolution) vào trong các thuật toán di truyền (Paredis, 1998)

Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các loài sinh vật thường cho thấy sự phù hợp dựa vào các đặc điểm hình thái của các nhóm sinh vật (Hafner & Nadler, 1990) Sự phù hợp này được cho là quá trình biệt hóa của các nhóm sinh vật trong quá trình tương tác (Johnson et al., 2003) Tuy nhiên, đôi khi, sự tương tác của các nhóm sinh vật với nhau trong quá trình đồng tiến hóa lại không thực sự hoàn hảo (Desdevises et al., 2002)

Đồng tiến hóa là một quá trình sinh học, nơi quần thể của các cá thể tương tác với nhau trong một chu kỳ thích nghi lâu dài và đủ dài để tác động đến sự tiến hóa của loài khác (Ronquist, 1998; Paracer & Ahmadjian, 2000) Quá trình này có thể diễn ra dưới nhiều hình thức: giữa động vật ăn thịt và con mồi, sự cộng sinh giữa các cá thể trong một hệ sinh thái hoặc sự ký sinh của các loài ký sinh trùng và vật chủ (Lipson & Bongard, 2004) Quá trình đồng tiến hóa giữa vật chủ và ký sinh trùng đã là chủ đề của nhiều nghiên cứu trong một thời gian dài (Kellogg, 1913; Paterson & Banks, 2001)

Các loài ký sinh trùng có thời gian thế hệ khác nhau, có một hoặc nhiều hơn một vật chủ tùy vào từng loài KST ký sinh và do đó chúng tiến hóa nhanh hơn, thích ứng và tăng áp lực chọn lọc trên vật chủ (Filipiak et al., 2016) Khi ký sinh trùng thích ứng với vật chủ, chúng sẽ ký sinh trên vật chủ một khoảng thời gian dài, dẫn đến những thay đổi tần số kiểu gen trong quần thể vật chủ Tần số này phụ thuộc vào kết quả chọn lọc về sự biến động tần số tương đối của các kiểu gen và cũng duy trì tính đa dạng di truyền (Decaestecker et al., 2007; Filipiak et al., 2016)

Phân tích quá trình đồng phát sinh loài (Cophylogenetic) giữa vật chủ và ký sinh trùng đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự phù hợp về mô hình đồng tiến hóa và suy ra lịch sử tiến hóa của các liên kết giữa chúng (Page, 2003) Một vấn đề chung là xác định cây phát sinh loài của ký sinh trùng liên quan đến cây phát sinh loài của vật chủ như một kết quả của quá trình đồng tiến hóa (coevolution) giữa vật chủ - ký sinh trùng (Hommola et al., 2009)

So sánh quá trình tiến hóa giữa ký sinh trùng và vật chủ rất phức tạp bởi thực tế rằng, bên cạnh quá trình tiến hóa song song (cospeciation), các quá trình khác cũng được phát hiện trên ký sinh trùng – vật chủ (Huelsenbeck et al., 2000; Hommola et al., 2009)

Ký sinh trùng có thể chuyển vật chủ từ loài này sang loài khác trong quá trình tiến hóa (Host switch), hoặc tiến hóa độc lập với vật chủ (Duplication), hoặc không xuất hiện trên một dòng vật chủ khi vật chủ của chúng cùng tiến hóa (sorting, Loss), mối quan hệ phát sinh loài của ký sinh trùng và vật chủ là rất hiếm khi xảy ra hoàn toàn tương đồng (Page, 2003)

Có một số phương pháp ước tính mối quan hệ tiến hóa song song giữa ký sinh trùng – vật chủ, những phân tích này được tiến hành sử dụng phần mềm phân tích BPA (Brooks, 1990), Component (Page, 1993), TreeMap 1.0 (Page, 1994), TreeFitter

(Ronquist, 1998), Jane 4 (Chris et al., 2010), CoRe-PA (Merkle et al., 2009), Copycat (Jan et al., 2007) Những phương pháp kiểm tra này sử dụng một mô hình tính toán phức tạp mà một vài thông số của mô hình phải được ước tính sẵn

Legendre (2002) đề xuất một phương pháp hoán vị, gọi là ParaFit, để kiểm tra giả thuyết ban đầu (H0) về sự tiến hóa của vật chủ và ký sinh trùng, đồng thời, thiết lập các liên kết giữa vật chủ - ký sinh trùng Juan et al (2013) cũng đưa ra một phương pháp tương tự giúp phân tích được đồ thị vecto giữa ký sinh trùng và vật chủ, đó là PACo (Procrustean Approach to Cophylogeny)

Bonnie & Kevin (2014) nghiên cứu quá trình đồng tiến hóa giữa dơi, động vật gặm nhấm và vi khuẩn khi khảo sát dựa trên trình tự gen 16S mtDNA và Cytb mtDNA Andrewa & Kevin (2016) cũng cho thấy quá trình đồng tiến hóa của các loài chim bồ câu và bọ chét ở khu vực Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Nam Mỹ Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên gen COI mtDNA sử dụng thuật toán Maximum likelihood và sử dụng phương pháp phân tích để kiểm tra sự chính xác của quá trình đồng tiến hóa Nghiên cứu của Cesar et al (2016) phát hiện mối quan hệ đồng tiến hóa giữa các loài nấm ký

sinh thuộc giống Cosmospora và các loài nấm Dựa vào cây phát sinh loài với trình tự

gen ITS rDNA sử dụng thuật toán Maximum likelihood

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tương nghiên cứu

Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh trên một số loài cá rạn san hô thuộc họ Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae, ở khu vực vịnh Nha Trang, Khánh Hòa

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung khảo sát thành phần loài ký sinh trùng trên đối tượng cá rạn san hô thuộc họ Mullidae, Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae ở khu vực quanh vịnh Nha Trang

Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 10-2015 đến tháng 8-2016

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

Thu mẫu cá rạn san hô

Đo kích thước cá

Kiểm tra ngoại và nội ký sinh

Thu mẫu KST

Nghiên cứu đặc điểm hình thái Nghiên cứu đặc điểm di truyền

PCR

Điện di

Xây dựng cây phát sinh loài

Xây dựng cây đồng tiến hóa Định danh KST dựa trên các chỉ

tiêu hình thái

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá rạn san hô

Tổng cộng 359 cá thể của 10 loài cá rạn san hô thuộc 4 họ (Mullidae,

Synodontidae, Pomacentridae và Serranidae) bao gồm cá hề vàng (Amphiprion sandaracinos), cá hề hồng (A perideraion), cá hề yên ngựa (A polymnus), cá hề đuôi vàng (A clarkii), cá mối vện (Synodus variegatus), cá mối hoa (S myops), cá mú 6 sọc ngang (Epinephelus fasciatus), cá mú chấm đỏ (E bleekeri), cá phèn chấm (Parupeneus multifasciatus) và cá phèn hồng (P heptacanthus) được thu quanh vịnh Nha Trang (Hòn

Nón, Hòn Đụn), tỉnh Khánh Hòa Cá còn sống được thu mua trực tiếp từ ngư dân đánh

cá gần cảng, đối với các chợ gần cảng Nha Trang, cá còn tươi (vừa chết) được tiến hành nghiên cứu và vận chuyển trực tiếp về phòng thí nghiệm Kích thước và trọng lượng của

các loài cá rạn được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Số lượng và kích thước các loài cá nghiên cứu

Loài cá Số lượng (n) Chiều dài (mm) Khối lượng (g)

Nội và ngoại ký sinh trùng được thu dựa vào Hà ký & Bùi Quang Tề (2001), được

bổ sung bởi Hà Ký & Bùi Quang Tề (2007)

Ngoại ký sinh: Nghiên cứu quan sát cá bằng mắt thường để phát hiện các loài KST

có kích thước lớn (≥1mm) trên da, vây, vẩy, mắt và miệng Những KST không nhìn thấy bằng mắt thường (<1mm) được tiến hành cạo nhớt da một số khu vực đặc trưng (vảy,

vây, đuôi) và các loài cá bị nhiều tổn thương ở da thì được nhúng toàn bộ vào trong cốc nước biển để thu các loài ngoại KST bên ngoài Sau đó, tiến hành lấy nhớt mang và cắt cung mang để quan sát bằng mắt thường, cắt rời từng cung mang cho vào đĩa Petri có chứa một ít nước muối sinh lý để chuẩn bị cho quá trình kiểm tra KST

Nội ký sinh: Tiến hành giải phẩu cá để thu các nội quan chuẩn bị tiến hành kiểm

tra KST bao gồm, ruột, gan, dạ dày, mật, tim

2.4.2.2 Phương pháp kiểm tra KST

Ngoại ký sinh: Tiến hành lấy nhớt cho lên lam kính, nhỏ thêm một giọt nước muối

sinh lý, đậy lamel lên rồi quan sát dưới kính hiển vi Olympus BX41TF (Nhật Bản) để quan sát rõ hình dạng, cấu tạo của trùng Toàn bộ dịch nước biển được quan sát dưới kính soi nổi Olympus SZX-ILLK200 và SZ2-ILST (Nhật Bản) để thu KST, sau đó quan sát hình dạng KST dưới kính hiển vi Olympus Từng cung mang được cắt rời và quan sát trực tiếp trên kính soi nổi để phát hiện KST, sau đó cho trực tiếp KST trên lam kính

và tiến hành kiểm tra trên kính hiển vi

Nội ký sinh: Giải phẫu cá để kiểm tra cơ quan bên trong cá, dùng panh tách riêng

từng bộ phận: Gan, ruột, dạ dày, tim, mật rồi tiến hành kiểm tra từng cơ quan

Tim: Lấy tim ngâm trong nước muối sinh lý và sau đó cắt thành các mẫu nhỏ cho lên lam kính, dùng lamen đè mỏng tim sau đó quan sát dưới kính hiển vi

Mật: Tách túi mật, dùng kéo cắt và nhỏ dịch mật lên lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi

Gan: Trước tiên quan sát màu sắc, hình dạng của gan Nếu có triệu chứng đổi màu hay biến dạng tiến hành chụp hình ngay để xác định tình trạng nhiễm của cá Sau đó, cắt

lá gan ép lên lam kính và lamen lớn rồi quan sát qua kính hiển vi

Ruột: Dùng kéo nhọn, nhỏ giải phẫu ruột Loại bỏ thức ăn trong ruột, sau đó cắt ruột thành các đoạn vừa phải (tránh tình trạng cắt quá nhỏ ảnh hưởng đến KST) Các phần ruột được quan sát bằng mắt thường để thu các loài KST có kích thước lớn Sau

đó tiến hành quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra các loài KST có kích thước nhỏ

Dạ dày: Với những loài có dạ dày nhỏ, kiểm tra trực tiếp trên kính soi nổi bằng cách cách một phần nhỏ phía đầu dạ dày rồi đẩy toàn bộ thức ăn cùng với KST bên trong rồi kiểm tra trên kính hiển vi Các loài cá có dạ dày lớn hơn, tiến hành mổ dạ dày theo

một đường dọc (cắt cẩn thận để tránh ảnh hưởng đến KST), quan sát bằng mắt thường thu giun sán cỡ lớn và kiểm tra dưới kính hiển vi

2.4.3 Phương pháp phân loại và bảo quản KST

Ngoại ký sinh: Kí sinh trùng thuộc lớp sán lá đơn chủ Monogenea

KST được cố định qua các thang cồn có nồng độ 300, 700, mồi thang duy trì 15 phút, sau đó làm trong KST trong Lactophenol (Thành phần bao gồm Phenol và acid lactic trong glycerol và nước) hoặc acid lactic trong 10 phút, và nhuộm bằng Ammonium picrate (Thành phần bao gồm Amonium và acid picric trong glycerol) hoặc Carmin (Thành phần bao gồm Carmin, HCl, Cồn 90% và nước cất) trong 45 – 60 phút, (tùy vào

cơ quan phân loại, muốn phát hiện các cơ quan cứng như móc bám và cơ quan giao cấu thì nhuộm bằng Ammonium picrate, còn đối với cơ thể gồm tinh hoàn, buồng trứng thì

sử dụng Carmin) tùy vào kích thước sán lá đơn chủ, sau khi nhuộm hút toàn bộ dịch nhuộm ra bằng ống hút thủy tinh và rửa lại bằng cồn 500 trong 1 phút, gắn vaselin 4 góc, đậy lamen và quan sát sán lá đơn chủ dưới kính hiển vi độ phóng đại 40X và 100X

Kí sinh trùng thuộc phân ngành giáp xác Crustacae

KST được cố định qua các thang cồn có nồng độ 300, 700, mồi thang duy trì 15 phút (cồn 700 được lặp lại 2 lần), sau đó làm trong KST trong acid acetic khoảng 35 phút

và nhộm bằng Carmin trong 2 lần, lần 1 khoảng 40 – 45 phút, lần 2 khoảng 60 – 90 phút tùy vào kích thước của giáp xác Sau khi nhuộm, hút toàn bộ dịch nhuộm ra bằng ống hút thủy tinh và rửa lại bằng cồn 500 trong 1 phút, gắn vaselin 4 góc, đậy lamen, và quan

sát giáp xác dưới kính hiển vi độ phóng đại 10X, 40X và 100X

Nội ký sinh: KST thuộc lớp Sán lá song chủ (Trematoda), sán dây (Cestoida)

KST được cố định qua các thang cồn có nồng độ 300, 700, mồi thang duy trì 15 phút, sau đó làm trong KST trong acid lactic khoảng 10 phút và nhộm bằng Carmin trong 30 -

40 phút tùy vào kích thước của KST Sau khi nhuộm, hút toàn bộ dịch nhuộm ra bằng ống hút thủy tinh và rửa lại bằng cồn 500 trong 1 phút, gắn vaselin 4 góc, đậy lamen, và quan sát sán lá song chủ, sán dây dưới kính hiển vi độ phóng đại 10X, 40X và 100X

Kí sinh trùng thuộc lớp giun đầu gai – Acanthocephala và giun tròn – Nematoda

KST được cố định qua các thang cồn có nồng độ 700, 900 mồi thang duy trì 20 phút, sau đó làm trong KST trong acid lactic trong 2 lần, lần 1 khoảng 25 phút và lần 2 khoảng 15 phút, sau đó nhộm bằng Carmin trong 60 phút – 1 ngày tùy vào kích thước của KST Sau khi nhuộm, hút toàn bộ dịch nhuộm ra bằng ống hút thủy tinh và rửa lại

bằng cồn 500 trong 1 phút, gắn vaselin 4 góc, đậy lamen, và quan sát giun đầu gai, giun tròn dưới kính hiển vi độ phóng đại 10X, 40X và 100X

2.4.4 Phương pháp đo KST

Những loài KST có kích thước lớn (> 1mm) có thể dùng thước đo trực tiếp (độ chính xác ±0,5mm)

Những loài KST có kích thước nhỏ được đo bằng kính hiển vi Olympus BX41TF

có gắn thước đo trên thị kính tương ứng với 100 vạch quan sát

KST được quan sát dưới vật kính (4x, 10x, 40x, 100x) và quan sát chiều dài của KST tương ứng với số vạch của thước đo khi quan sát thị kính sau khi đã được hiệu chỉnh bằng thước đo chuẩn (1 vạch/vật kính 10X = 0,01mm, 1 vạch/vật kính 4X = 0,025mm), từ đó suy ra kích thước của KST phân loại

Cách đo các cơ quan của các loài sán lá đơn chủ Monogenean, sán lá song chủ Digenea, sán dây Cestoda, Giun tròn Nematoda, giáp xác Crustacea, giun đầu gai

Acanthocephala được trình bày trong Phụ lục 1 Kích thước được đo dưới dạng (chiều

dài x chiều rộng) và đơn vị đo micromet (µm)

2.4.5 Nghiên cứu tình trạng nhiễm KST

Tình trạng nhiễm KST được đánh giá thông qua tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm

Tỉ lệ nhiễm (TLN) (%): Được đánh giá dựa vào số cá bị nhiễm

Mật độ nhiễm (I) (KST/cá nhiễm): Được đánh giá dựa trên tổng số KST trên cá nhiễm

2.4.6 Phân loại và mô tả KST dựa vào đặc điểm hình thái

Sau khi quan sát dưới kính hiển vi, KST được phân loại và mô tả hình thái theo khóa phân loại của Yamaguti (1958), Hà Ký & Bùi Quang Tề (2007), sán dây (Cestode), giun tròn (Nematode) được phân loại theo Beveridge & Justine (2006), sán lá song chủ (Digenea) (Bray & Justine, 2011), sán lá đơn chủ (monogenea) (Sherman, 1994; Kritsky

et al., 2013), giáp xác (copepod) (Boxshall et al., 2008)

Tổng số KST

Số cá nhiễm Mật độ nhiễm (KST/cá nhiễm) =

Số cá nhiễm KST

Số cá kiểm tra

Đặc điểm hình thái KST được vẽ trực tiếp dựa trên phần mềm ArcGis 10.1 và xử lý bằng Photoshop CS6 Đặc điểm phân loại chủ yếu của các nhóm KST:

Sán lá đơn chủ (Monogenea): Căn cứ vào cơ quan giao cấu đực và cái, móc bám,

thanh nối và các móc rìa

Sán lá song chủ (Digenea): Căn cứ vào hình dạng, cấu tạo của cơ thể Hình dạng,

cấu tạo của cơ quan bám, vị trí và tỉ lệ về kích thước của giác bụng và giác miệng, kích thước buồng trứng, tinh hoàn

Sán dây (Cestoda): Căn cứ phần đầu của sán biến đổi thành các cơ quan bám có

nhiều dạng khác nhau

Giun tròn (Nematoda): Căn cứ vào hình dạng, cấu tạo cơ thể, phần đầu, phần đuôi,

thực quản Ngoài ra còn dựa vào gai giao cấu, túi tinh của con đực, mấu nhọn ở con cái

Giáp xác (Crustacea): Dựa vào hình dạng, kích thước râu, tỉ lệ chiều dài, chiều

rộng cơ thể, kích thước các chân bơi, hình dạng đốt sinh dục và chiều dài buồng trứng

Giun đầu gai (Acanthocephala): Dựa vào hình dạng, kích thước vòi gai, số lượng

gai trên vòi, tinh hoàn và buồng trứng

2.5 Nghiên cứu di truyền KST ký sinh trên cá rạn tại Khánh Hòa

2.5.1 Định danh loài dựa trên chỉ thị phân tử 28S rRNA

DNA của từng cá thể KST cùng 1 loài được tách chiết bằng bộ kit DNeasy® Blood

& Tissue (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) Một phần của đoạn gen

28S rRNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi khác nhau cho các nhóm KST khác nhau

Phản ứng PCR với đoạn gen 28S rRNA được tiến hành với tổng thể tích 50μl bao gồm 9 μL khuôn DNA (20 ng/1 μL), 5 μL 10X Dream Tag Buffer, 1 μL dNTP (10nM),

1 μL mỗi mồi (10 μM), 0.25 μL Tag DNA polymerase (5 Unit/1 μL) và 32.75 μL nước cất cho đủ thể tích, chu trình nhiệt gồm 940C trong 3 phút; 40 chu kỳ của 940C trong 30s, 560C trong 45s (Cặp mồi LSU-5, 1500R) hoặc 600C trong 45s (Cặp mồi C1, D2 và cặp mồi GX20-F, GX19-R), 720C trong 1 phút; chu kỳ cuối 720C trong 7 phút (Olson et

al 2003, Mollaret et al 1997) (Hình 2.2)

Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR

Sán lá song chủ, sán dây, giun tròn

Sán lá đơn chủ, một số loài giáp xác

Một số loài giáp xác

Sản phẩm PCR được tiến hành giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 960C trong 20 giây, 500C trong

20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 28S rRNA

3 phút 30s

560C 45s

940C 940C

1X 1X

600C