Nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá da trơn dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Các loài ký sinh trùng KST được phát hiện, bảo quản, nhuộm và phân loại dựa trên đặc điểm hình thái.. Xuất phát từ nhu cầu trên, được sự đồng ý của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc đến Giáo viên hướng dẫn TS Đặng Thúy Bình đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên trong lúc em gặp khó khăn, hướng dẫn tận tình cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án để em có thể kết thúc đề tài và hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian

Em xin chân thành cảm ơn ThS Trần Quang Sáng cùng anh chị, bạn bè trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã giúp đỡ tận tình

Cảm ơn dự án NIFES (Na Uy) đã hỗ trợ kinh phí để hoàn thành đề tài

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã tạo cho em niềm tin, nghị lực, ủng hộ em trong suốt thời gian tham gia học tập và hoàn thành đồ án này Trong khoảng thời gian ngắn, bài báo cáo tốt nghiệp không thể tránh khỏi những thiếu sót rất mong thầy cô giáo góp ý để giúp luận văn được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 06 năm 2017

Sinh viên

Trần Thị Thanh Huyền

TÓM TẮT

Cá da trơn ở Việt Nam được nhiều thị trường quốc tế ưa chuộng và đang giữ vị trí số một trong tổng kim ngạch xuất khẩu hàng Thủy sản Việt Nam Tuy nhiên, sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay có thể làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh trên cá do ký sinh trùng gây ra, đặc biệt ở các giai đoạn cá hương và cá giống Nghiên cứu hiện tại tiến hành thu tổng cộng 77 cá thể của 3 loài cá da trơn (cá lăng

Hemibagrus spilopterus, cá trê đen Clarias fuscus, cá sát sọc Pangasius macronema)

tại miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ Việt Nam Các loài ký sinh trùng (KST) được phát hiện, bảo quản, nhuộm và phân loại dựa trên đặc điểm hình thái Tình trạng nhiễm ký sinh trùng được đánh giá thông qua tỉ lệ nhiễm (%) và mật độ nhiễm (KST/cá nhiễm) Các loài KST được nghiên cứu di truyền dựa vào trình tự gen 28S rRNA và 18S rRNA thuộc gen nhân để xác định mối quan hệ tiến hóa của các loài Kết quả nghiên cứu phát hiện được 18 loài KST trên 3 loài cá thuộc 15 giống, 11

họ, 10 bộ, 6 lớp, 4 loài KST chưa xác định đến loài và ghi nhận sự hiện diện NCHT

đã mô tả 13 loài KST được ghi nhận trên vật chủ mới và chưa có báo cáo rõ ràng Tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm ký sinh trùng dao động trên các loài cá khác nhau Tỉ lệ nhiễm

cao nhất là loài sán lá đơn chủ Cornudiscoides longicirrus (64,71%) trên cá lăng Hemibagrus spilopterus và tỉ lệ nhiễm thấp nhất là loài sán lá song chủ Amurotrema

sp (2,56%) trên cá sát sọc Pangasius macronema Mật độ nhiễm cao nhất là 33 (KST/cá nhiễm) đối với loài sán lá đơn chủ Thaparocleidus campylopterocirrus trên

cá sát sọc và thấp nhất là 1 (KST/cá nhiễm) đối với các loài giun đầu gai Corynosoma semerme trên cá lăng Hemibagrus spilopterus, sán lá song chủ Amurotrema sp.trên cá

sát sọc và trùng bánh xe Trichodia nigra trên cá trê đen Clarias fuscus

Nghiên cứu di truyền dựa trên trình tự gen 28S rRNA và 18S rRNA cho thấy các loài KST thuộc lớp sán lá đơn chủ và song chủ đều nằm trên các nhánh đồng dạng (monophyly) và thể hiện mối quan hệ gần gũi với nhau Tuy nhiên trên cây phát sinh loài dựa trên trình tự 28S rRNA cho thấy sự không phù hợp giữa đặc điểm hình thái và

di truyền ở mức độ bộ và mức độ họ (các loài thuộc 2 họ Heterophyidae và Opisthorchiidae được sắp xếp chung 1 nhánh) Và không có sự khác biệt di truyền quá

lớn trong cùng một giống, ngoại trừ giống Haplorchis và Procerovum

Kết quả của đề tài bổ sung thêm dẫn liệu về thành phần loài ký sinh trùng trên cá

da trơn ở Việt Nam cũng như trên thế giới Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về bệnh lý trên vật chủ và các giải pháp phòng, trị thích hợp

Từ khóa: cá da trơn, ký sinh trùng, 28S rRNA và 18S rRNA

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 6

1.2.1 Cá lăng Hermobagrus spilopterus 6

1.2.2 Cá trê đen Clarias fuscus 7

1.2.3 Cá sát sọc Pangasius macronema 8

1.3 Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt 9

1.3.1 Trên thế giới 9

1.3.1.1 Động vật nguyên sinh, sán lá đơn chủ, song chủ và giun sán 9

1.3.1.2 Ấu trùng metacercariae 11

1.3.2 Ở Việt Nam 12

1.3.2.1 Động vật nguyên sinh, sán lá đơn chủ, song chủ và giun sán 12

1.3.2.2 Ấu trùng metacercariae 13

1.4 Tổng quan về mối quan hệ phát sinh loài KST trên cá nước ngọt 14

1.4.1 Đặc điểm của hệ gen ribosome 15

1.4.2 Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài ký sinh trùng 16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 17

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp thu mẫu cá da trơn 19

2.3.2 Phương pháp thu KST trên cá 19

2.3.3 Phương pháp kiểm tra KST 20

2.3.4 Phương pháp bảo quản, cố định mẫu và nhuộm tiêu bản 21

2.3.5 Phương pháp đo KST 21

2.3.6 Khảo sát tình trạng nhiễm KST 22

2.3.7 Phương pháp phân loại KST dựa vào đặc điểm hình thái 22

2.4 Nghiên cứu đặc điểm di truyền KST trên một số loài cá da trơn 24

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số của các loài KST 24

2.4.2 Phản ứng PCR 24

2.4.3 Giải trình tự 26

2.5 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Thành phần và đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trên các loài cá nghiên cứu 30

3.2 Mô tả đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu 32

3.2.1 Ấu trùng metacercaria Procerovum cheni (Hình 3.5) 32

3.2.2 Haplorchis pumilio (Hình 3.2) 33

3.2.3 Posthodiplostonum minimum 35

3.2.4 Amurotrema sp 37

3.2.5 Gyrodactylus sp 38

3.2.6 Bychowskyella tchangi 40

3.2.7 Thaparocleidus sp 41

3.2.8 Mizelleus siamensis 43

3.2.9 Cornudiscoides longicirrus 45

3.2.10.Contracaecum sp 47

3.2.11.Corynosoma semerme 49

3.2.12.Monobothrioides woodlandi 50

3.3.13 Trichodina nigra Lom (1960) 51

3.3 Tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài KST trên các loài cá nghiên cứu 52

3.4 Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng trên cá da trơn 55

3.4.1 Khuếch đại đoạn gen 28S rRNA và 18S rRNA đối với các loài KST 55

3.4.2 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ký sinh trùng 57

3.4.2.1 Mối quan hệ tiến hóa đối với gen 28S rRNA của các loài KST 57

3.4.2.2 Mối quan hệ tiến hóa đối với gen 18S rRNA của các loài KST 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

mtDNA Mitochondrial Deoxyribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số lượng, chiều dài và khối lượng của các loài cá trong nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR 24 Bảng 2.3 Thông tin của 12 loài KST sử dụng gen 28S rRNA trong NCHT và 15 loài

Bảng 3.2 So sánh các chỉ tiêu phân loại loài Procerovum cheni 33

Bảng 3.4 Tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của các loài KST 53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các địa điểm thu mẫu Cá trong NCHT 4

Hình 1.2 Cá lăng Hemibagrus spilopterus 6

Hình 1.3 Cá trê đen Clarias fuscus 7

Hình 1.4 Cá sát sọc Pangasius macronema 8

Hình 1.5 Vùng rDNA (5.8S, 18S, 28S) của vi sinh vật nhân thực 15

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 18

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của PCR với gen 28S rRNA (Cặp mồi LSU-5, 1500R) 25

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 28S rRNA (Cặp mồi C1, D2 và cặp mồi ThaF, ThaR) 25

Hình 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S Rrna 26

Hình 3.1 Hình dạng và cấu tạo của Procerovum cheni 32

Hình 3.2 Hình dạng và cấu tạo của Haplorchis pumlio 34

Hình 3.3 hình dạng và cấu tạo của Posthodiplostonum minimum 36

Hình 3.4 Hình dạng và cấu tạo của Amurotrema sp 38

Hình 3.5 Hình dạng và cấu tạo của Gyrodactylus sp 39

Hình 3.6 hình dạng và cấu tạo của Bychowskyella tchangi 41

Hình 3.7 Hình dạng và cấu tạo của Thaparocleidus sp 42

Hình 3.8 Hình dạng và cấu tạo của Mizelleus siamensis 44

Hình 3.9 hình dạng và cấu tạo của Cornudiscoides longicirrus 46

Hình 3.10 Hình dạng và cấu tạo của Contracaecum sp 48

Hình 3.11 Hình dạng và cấu tạo của Corynosoma semerme 49

Hình 3.12 Hình dạng và cấu tạo của Monobothrioides woodland 51

Hình 3.13 Hình dạng và cấu tạo của Trichodina nigra 52

Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rRNA và 18S rRNA của các loài KST trên các loài cá da trơn 56

Hình 3.15 Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rRNA của các loài KST trên một số loài cá da trơn (bootstrap 1000) Các loài ký hiệu mã số được lấy từ GenBank

57

Hình 3.16 Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 18S rRNA của các loài KST trên một số loài cá da trơn (bootstrap 1000) Các loài ký hiệu mã số được lấy từ GenBank

61

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam có vị trí địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh Năm 2016 tăng trưởng tốt khi xuất khẩu thủy sản đạt hơn 159,94 tỷ USD, tăng 7,8% so với cùng kỳ năm 2015 (Tổng cục Thủy sản, 2017) Đặc biệt nước ta có diện tích bề mặt nước ngọt lớn với 653.000 ha sông ngòi, 394.000

ha hồ chứa, 85.000 ha đầm phá ven biển, 580.000 ha ruộng lúa nước Ngoài ra, ở ĐBSCL, hàng năm có khoảng 1.000.000 ha diện tích ngập lũ từ 2 đến 4 tháng Nhờ vậy, nguồn lợi cá nước ngọt ở Việt Nam thực sự phong phú (Phạm Đình Văn, 2010) Trong những năm gần đây, ngành Thủy sản nước ngọt ngày càng có vị trí quan trọng trong nền kinh tế của nước ta Theo kết quả điều tra khoa học, đã xác định được khu hệ cá nước ngọt gồm 544 loài, 288 giống, 57 họ và 18 bộ khác nhau phân bố ở Việt Nam (Bộ Thủy sản, 1996) Trong đó, các loài thuộc bộ cá da trơn hay bộ Cá Nheo (Siluriformes) có tới 10 họ, 31 giống, 88 loài và phân loài (chiếm 16,2%), đáng lưu ý

là các họ cá Lăng (Bagridae), họ cá Tra (Pangassidae) và họ cá Nheo (Siluridae) là một trong những loài có vai trò quan trọng trong nghề nuôi cá của nước ta và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Bộ Thủy sản, 1996)

Cá da trơn ở Việt Nam được nhiều thị trường quốc tế ưa chuộng và đang giữ vị trí số một trong tổng kim ngạch xuất khẩu hàng thủy sản Việt Nam Trong năm 2009, sản lượng xuất khẩu cá da trơn đạt được mục tiêu là 607.665 tấn cá, thu hơn 1340 triệu USD (Đỗ Văn Xê và Châu Thanh Bảo, 2010)

Tuy nhiên, sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay có thể làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh trên cá do ký sinh trùng gây ra, đặc biệt ở các giai đoạn cá hương

và cá giống Nhiều loài ký sinh trùng đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá như nhóm động vật đơn bào ngoại ký sinh, sán lá đơn chủ, sán lá song chủ, giun sán, giáp xác Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa tạo điều kiện thuận lợi cho ký sinh trùng phát triển Ký sinh trùng thường gây ra bệnh trên cá làm chậm tăng trưởng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm thủy sản và có thể gây chết hàng loạt cho cá nuôi, gây thiệt hại lớn đến nghề nuôi thủy sản (Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007) Các bệnh do KST có nguồn gốc từ cá rất phổ biến ở Việt Nam, chúng được coi như là một mối nguy đối với sức khỏe cộng đồng và an toàn thực phẩm trong các sản phẩm thủy sản (WHO, 2004)

Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành khảo sát ký sinh trùng trên 110 loài

cá kinh tế trong tổng số 544 loài cá nước ngọt, kết quả xác định và mô tả được 373 loài

ký sinh trùng (Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007)

Do đó việc nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng, mức độ nhiễm cũng như quá trình tiến hóa của các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu hiện nay là rất cần thiết góp phần đảm bảo sản lượng – chất lượng nguyên liệu đầu vào và sức khỏe người tiêu dùng Đồng thời kết quả nghiên cứu nhằm đóng góp một phần về sự đa dạng của các loài ký sinh trùng cũng như xây dựng thêm một danh sách chưa hoàn chỉnh về các loài KST Ngoài ra nghiên cứu có thể cung cấp thông tin về các loại bệnh do KST gây ra

để làm cơ sở cho việc phòng và trị bệnh

Xuất phát từ nhu cầu trên, được sự đồng ý của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, giáo viên hướng dẫn, Em cùng nhóm nghiên cứu

đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá

da trơn dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền”

Mục tiêu nghiên cứu

Mục đích của đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát mức độ cảm nhiễm, đa dạng thành phần loài, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài ký sinh trùng trên một số loài

cá da trơn (cá lăng Hemibagrus spilopterus, cá trê đen Clarias fuscus, cá sát sọc Pangasius macronema) ở Việt Nam

Nội dung nghiên cứu của đề tài

 Thu mẫu các loài cá da trơn (cá lăng, cá sát sọc, cá trê) tại miền Trung, Tây nguyên và Nam Bộ Việt Nam

 Định danh các loài ký sinh trùng dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền, xác định tỷ lệ nhiễm và mật độ nhiễm ký sinh trùng trên các loài cá nghiên cứu

 Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài của các loài ký sinh trùng trên các loài cá

da trơn ở Việt Nam

Ý nghĩa của đề tài

Nghiên cứu cung cấp thêm dữ liệu về thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt (cụ thể là các loài thuộc bộ cá da trơn) Kết quả nghiên cứu đã góp phần làm phong phú khu hệ KST cá nước ngọt ở Việt Nam nói riêng cũng như trong khu vực và thế giới nói chung

Tính mới của đề tài

Phân loại các loài ký sinh trùng dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (sử dụng trình tự gen 28S và 18S rRNA thuộc gen nhân)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu

Lãnh thổ Việt Nam với diện tích 332.000km2 trải dài theo vĩ độ 23022’N –

8030’N vàkinh độ 102010’E – 109021’E nằm ở vị trí tận cùng của lục địa châu Á Và được phân chia làm 3 miền (Bắc, Trung, Nam) với 63 tỉnh thành

Cá thể cá nghiên cứu trong đề tài đã được thu từ 3 khu vực nghiên cứu: sông Cái Nha Trang – Khánh Hòa, tỉnh Đắk Lắk và thành phố Cần Thơ

Hình 1.1 Các địa điểm thu mẫu Cá trong NCHT

 Khánh Hòa

Tỉnh Khánh Hòa nằm ở khu vực duyên hải Nam Trung Bộ Phía Bắc giáp tỉnh Phú Yên, phía Nam giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây giáp hai tỉnh Đắk Lắk và Lâm Đồng, phía Đông giáp biển Đông Diện tích tự nhiên của tỉnh Khánh Hòa cả trên đất liền cùng với hơn 200 đảo và quần đảo là 5197 km2 (Cổng thông tin điện tử tỉnh Khánh Hòa, 2017)

Khánh Hòa nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á và nằm ở vĩ độ thấp, gần về xích đạo nên nhiệt độ ở đây cao hơn một số tỉnh khu vực phía Bắc Khí hậu quanh năm ôn hòa, nhiệt độ trung bình khoảng 260 C Và sông ngòi ở Khánh Hòa nhìn chung ngắn, độ dốc dòng chảy lớn, mức độ tập trung lũ cao, dễ gây nên lũ quét (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006)

Độ đa dạng sinh học các loài sinh vật biển cao, có tới 350 loài san hô đang phát triển, chiếm 45% loài được tìm thấy trên thế giới Nhưng hiện nay, biến đổi khí hậu đã

và đang ảnh hưởng trực tiếp đến Khánh Hòa, mực nước biển cũng có xu thế gia tăng, bước đầu xác định được những vùng nhạy cảm (Nguyễn Tác An và Nguyễn Kỳ Phùng, 2014)

 Cần Thơ

Thành phố Cần Thơ nằm trong vùng trung – hạ lưu và ở vị trí trung tâm châu thổ đồng bằng sông Cửu Long, trải dài trên 55km dọc bờ Tây sông Hậu, tổng diện tích tự nhiên 1.401,61 km2 Và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới – gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm (Cổng thông tin điện tử thành phố Cần Thơ, 2017) Có thể nói, các yếu

tố khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển thủy hải sản

Sông ngòi ở Cần Thơ bắt nguồn từ khu vực nội đồng tây sông Hậu, có chiều dài khoảng 16 km, chiều rộng từ 280-350 km Bên cạnh đó, thành phố Cần Thơ còn có hệ thống kênh rạch dày đặc, với hơn 158 sông, rạch lớn nhỏ là phụ lưu của 2 sông lớn là Sông Hậu và sông Cần Thơ đi qua thành phố nối thành mạng đường thủy cho nước ngọt suốt hai mùa mưa nắng, tạo điều kiện cho nhà nông làm thủy lợi và cải tạo đất (Cổng thông tin điện tử thành phố Cần Thơ, 2017) Các lợi thế của Cần Thơ đóng vai trò động lực thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển lĩnh vực đánh bắt và chế biến thủy sản nước ngọt nói riêng cũng như cho phép phát triển mạnh mẽ của toàn vùng đồng bằng sông Cửu Long

 Đắk Lắk

Tỉnh Đắk Lắk nằm trên địa bàn Tây Nguyên có diện tích tự nhiên 13.085 km2(1.308.500ha), chiếm 3,9% diện tích tự nhiên cả nước Việt Nam Do đặc điểm địa lý nên khí hậu ở Đắk Lắk vừa chịu sự chi phối của khí hậu nhiệt đới gió mùa, vừa mang tính chất của khí hậu cao nguyên mát dịu (Nguyễn Văn Hóa, 2014)

Đắk Lắk có hệ thống sông ngòi phân bố tương đối đều trên lãnh thổ (hệ thống sông Srepok; hệ thống sông Ba; hệ thống sông Đồng Nai) cùng với hàng trăm hồ chứa

và 833 con suối có độ dài trên 10km, đã tạo cho Đắk Lắk một mạng lưới sông hồ khá dày đặc Vì vậy, nhiều vùng trong tỉnh có khả năng khai thác nguồn nước mặt thuận lợi để phục vụ sản xuất và đời sống (Nguyễn Văn Hóa, 2014)

Cùng với các sông suối có hồ Lắk rộng trên 600 ha Đây là hồ nước ngọt đẹp nhất và lớn nhất miền Nam Hồ Lắk vừa là một thắng cảnh ngoạn mục có thể khai thác

về dịch vụ du lịch vừa là nguồn nuôi một số lượng thủy sản quan trọng như ốc, lươn, baba, và 12 loại cá khác nhau với sản lượng cung cấp khoảng 12 tấn cá/năm (Phạm Văn Xuân, 2008)

1.2 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

1.2.1 Cá lăng Hermobagrus spilopterus

 Hệ thống phân loại

Giới: Animalia

Ngành: Chordata

Lớp: Actinoterygii Bộ: Siluriformes Họ: Bagridae

Chi: Hemibagrus Loài: Hemibagrus spilopterus, Ng và Rainboth (1999)

 Phân bố

Cá lăng thuộc loài cá nước ngọt sống ở đáy Chúng thường phân bố trong khu vực Đông Nam Á, ở lưu vực sông Mekong tại Lào, Việt Nam, Thái Lan (chủ yếu xuất hiện ở Ban Pakong, Chao Phraya và Mae Khlong) và Campuchia (Allen, 2007)

 Đặc điểm sinh học

Cá lăng có thân thon dài, dẹp ngang về phía đuôi, đầu to Thân màu tím với các đốm màu xanh Miệng cá rộng, mắt lớn, nằm ở đỉnh đầu Chúng có 4 đôi râu, râu hàm trên dài đến vây hậu môn, râu hàm dưới dài đến vây ngực, râu mũi ngắn chưa đến mắt, râu cằm ngắn hơn râu hàm dưới và chưa đến vây ngực (Phạm Đình Văn, 2010)

Vây lưng cá có 7 tia Vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau, tia vây ngực có 1 vây cứng và 8 tia vây mềm Vây bụng màu vàng nhạt, có khoảng 6-7 tia vây bụng, các vây khác màu tím nhạt Vi mỡ ngắn có đốm đen, viền trắng, không gắn liền với vây lưng và vây hậu môn, số tia vây hậu môn từ 12-14 (Phạm Đình Văn, 2010)

Cá lăng ăn côn trùng, ấu trùng thủy sản, tôm và các loài giáp xác khác cũng như

cá nhỏ Ở sông Mekong tại Campuchia, chúng di chuyển vào rừng ngập mặn để đẻ trứng và cá nhỏ được thấy đầu tiên vào tháng 8, còn cá lớn sẽ trở về sông vào tháng 10

và tháng 12 (Allen, 2007)

Hình 1.2 Hemibagrus spilopterus

1.2.2 Cá trê đen Clarias fuscus

Chi: Clarias Loài: Clarias fuscus, Lacépède (1803)

 Phân bố

Cá trê đen là cá nước ngọt, sống ở ao hồ, ruộng nước có nhiều bùn Loài này phân bố ở phía nam Trung Quốc, Đài Loan, ở Việt Nam (Kottelat 2001) và đông bắc Lào Các loài này đã được đưa vào quần đảo Hawaiian (Yamamoto 1992), Nhật Bản (Quần đảo Okinawajima và Ishigakijima, Quần đảo Ryukyu, Masuda và cộng sự, 1984) và Philippines (Cui và Zhao, 2012)

Về mùa đông, cá trê thường rúc trong bùn, nằm im tránh rét Chúng ăn tạp nhưng thức ăn chủ yếu là động vật không xương sống nhỏ, cá con, giun, động vật giáp xác và côn trùng (Cui và Zhao, 2012) Cá trê đẻ gần như quanh năm nhưng mùa sinh đẻ chủ yếu vào tháng 3-6 hàng năm (Mai Đình Yên, 2004)

Hình 1.3 Cá trê đen Clarias fuscus

Chi: Pangasius Loài: Pangasius macronema, Bleeker (1850)

 Phân bố

Cá sát sọc phân bố ở lưu vực sông Mê-kông, chủ yếu trên sông Tiền (tập trung ở Vĩnh Xương, Long Khánh, Hồng Ngự) và sông Hậu (từ An Phú đến Định An, Trần Đề), ngoài ra vào mùa mưa còn tìm thấy ở vùng cửa sông Đây là loài phân bố rộng, số lượng quần thể lớn và có kích thước nhỏ nhất trong họ Pangasiidae (Nguyễn Văn Thường, 2007)

 Đặc điểm sinh học

Cá sát sọc có thân kéo dài, hơi dẹp ngang, chiều dài cá trung bình khoảng 15cm, tối đa khoảng 30cm Đỉnh đầu và lưng có màu xám đậm ánh xanh, hông và bụng màu bạc Thân cá có một vân đậm chạy dọc thân từ sau nắp mang đến cuống đuôi và một vân nhạt hơn từ sau nắp mang đến phía vây ngực, hai vân này dính nhau ở phía trước Đầu hình chóp nhọn Mắt to, nằm trên đường trục thân Mõm cá ngắn, miệng rộng, hàm trên nhô ra Răng lá mía và răng khẩu cái gồm 4 đốm rời nhau Có hai đôi râu, râu hàm trên dài đến gốc vây bụng, râu hàm dưới dài đến nửa chiều dài vây ngực (Phạm Đình Văn, 2010)

Gai cứng, vây lưng và vây ngực có hai răng cưa ở mặt sau Số tia vây lưng của cá

là 7 và vây ngực từ 10-11 Vây mỡ và vây bụng nhỏ, vây bụng có 6 tia Vây hậu môn khá dài, tia vây hậu môn từ 34-36 Vây đuôi chẻ hai Màng vây ngực và rìa vây đuôi

có sắc tố đen Các vây khác trắng nhạt (Phạm Đình Văn, 2010)

Đây là loài sống và dinh dưỡng ở tầng đáy đến tầng mặt ở các thủy vực nước ngọt Trong giai đoạn từ tháng 4 đến tháng 6, loài này di cư theo mùa vượt thác Khone

ở biên giới Lào - Campuchia và Thái Lan, Việt Nam (ĐBSCL) đã tạo nên một nghề cá đặc biệt quan trọng ở đây (Baird và cs, 2000)

Hình 1.4 Cá sát sọc Pangasius macronema

1.3 Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt

Đã từ lâu, việc nghiên cứu KST của cá được nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như trong khu vực Đông Nam Á quan tâm nghiên cứu

Trong những năm gần đây, khi thủy sản nước ngọt Việt Nam (nhất là các loài cá

da trơn có giá trị kinh tế cao) ngày càng có vai trò quan trọng trong phục vụ nhu cầu tiêu dùng thực phẩm trong và ngoài nước, nâng cao đời sống của người dân thì vấn đề bệnh ở cá cần được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn trên các loài cá nước ngọt (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

1.3.1 Trên thế giới

1.3.1.1 Động vật nguyên sinh, sán lá đơn chủ, song chủ và giun sán

Hầu hết các loài KST và các bệnh do chúng gây ra ảnh hưởng ít nghiêm trọng đến cá, tuy nhiên một số bệnh làm cá chậm phát triển khiến năng suất, sản lượng giảm đáng kể Vì vậy hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về ký sinh trùng cá nước ngọt nói chung và KST trên các loài cá da trơn nói riêng

Trên thế giới, nghiên cứu về KST cá được bắt đầu từ khá sớm, công trình nghiên cứu của viện sỹ Dogiel năm 1962 đã mô tả 1211 loài KST của khu hệ cá nước ngọt Liên Xô

Trên cơ sở kế thừa phương pháp phân loại KST của Dogiel, nhiều tác giả đã phát triển hệ thống phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái và di truyền để định danh chính xác các loài KST Nagasawa và Urawa (1989) nghiên cứu ký sinh trùng trên cá nước ngọt ở Hokkaido – Nhật Bản xác định được 96 loài ký sinh trùng khác nhau bao gồm động vật đơn bào Protozoa 21 loài, sán lá đơn chủ Monogenea 11 loài, sán lá song chủ Trematoda 22 loài, sán dây Cestoda 10 loài, lớp giun tròn Nematoda 15 loài, giun đầu gai Acanthocephala 7 loài, ngành thân mềm Mollusca 2 loài, giáp xác Copepoda 6 loài, phân lớp chân hàm Branchiura 1 loài, giáp xác trong bộ chân bơi Isopoda 1 loài và 38 loài chưa xác định Carmen (1975) xuất bản cuốn sách “Sán lá song chủ Trematoda ở cá Philippines” trong đó nghiên cứu mô tả 73 loài thuộc 50 giống, 21 họ sán lá song chủ ký sinh trên 27 họ cá của Philippines (trích dẫn bởi Trương Thị Hoa, 2008)

Arthur và Lumanlan-May (1975) nghiên cứu ký sinh trùng trên cá ở Philippines

và xác định được 201 loài ký sinh trùng ở 172 loài cá gồm: 1 loài trùng bào tử ngành

Apicomplexa, trùng lông Ciliophora 16 loài, 2 loài trùng roi thuộc chi Mastigophora,

động vật nguyên sinh Myxozoa 9 loài, lớp sán lá song chủ Trematoda 90 loài, sán lá

đơn chủ Monogenea 22 loài, sán dây Cestoda 6 loài, lớp giun tròn Nematoda 20 loài,

giun đầu gai Acanthocephala 5 loài, ngành thân mềm Mollusca 1 loài, phân lớp chân hàm Branchiura 2 loài, giáp xác Copepoda 21 loài và 5 loài giáp xác thuộc bộ Isopoda

(trích dẫn bởi Trương Thị Hoa, 2008)

Ở Thái Lan, Yutisri và Thuhanruksa (1985) thực hiện điều tra khu hệ ký sinh trùng trên một số loài cá tự nhiên ở Thái Lan Nghiên cứu phát hiện 16 loài ký sinh trùng, trong đó tác giả đã xác định được 3 loài ngoại ký sinh và 13 loài nội ký sinh trên

cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus)

Ahmed và Ezaz (1997) đã nghiên cứu KST trên 17 loài cá da trơn ở Banglades Nghiên cứu xác định được 69 loài KST bao gồm 1 loài sán lá đơn chủ Monogenea, 24 loài sán lá song chủ Digenea, 10 loài sán dây Cestoda, 28 loài giun tròn Nematoda và

6 loài giun đầu gai Acanthocephala

Purivirojkul và Areechon (2008) tiến hành nghiên cứu KST ở sông Mekong, tỉnh Chiang Rai trên tổng số 672 cá thể cá thuộc 14 loài thuộc bộ da trơn (Siluriform) Kết quả đã phát hiện 14 loài sán lá đơn chủ Monogenea, 18 loài sán lá song chủ Digenea, 3 loài sán dây Cestoda, 4 loài giun đầu gai Acanthorhynchus, 7 loài giun tròn Nematoda

và 4 loài chân khớp Arthoropods Trong đó, 10 loài KST được tìm thấy trên

Hemibagrus nemurus với 9 loài chưa xác định thuộc lớp sán lá đơn chủ, song chủ, giun tròn và giun đầu gai Ở 5 loài thuộc giống Pangasius, 10 loài được phát hiện, tuy

nhiên, chỉ có 3 loài được định danh

Cho đến nay, nghiên cứu ký sinh trùng ở cá nước ngọt ngày càng phổ biến và chuyên sâu Thuy và Buchmann (2008) ghi nhận trên cá tra nuôi nhiễm 2 loài sán lá

đơn chủ (Thaparocleidus siamemsis và T caecus) Trong đó, T siamensis có tỷ lệ nhiễm 57%, cường độ nhiễm 148, T caecus có tỷ lệ nhiễm thấp (< 50%)

Das và Goswami (2014) tiến hành khảo sát tình trạng nhiễm ký sinh trùng trên cá

rô Anabas testudineus ở ba vùng đất ngập nước thuộc bang Assam, Ấn Độ Kết quả ghi nhận 3 loài sán lá song chủ (Asymphylora kedarai, Brahamputratrema sp., Neopodocotyl sp.) và 6 loài giun tròn (Camallanus anabantis, C trichuris, C intestinaluss, Onchocamallanus sp., Parascarophis sp và Cosmoxynemoid nandusi)

Chaudhary và cs (2014) khảo sát ký sinh trùng trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở Ấn Độ Kết quả đã phát hiện loài Thaparocleidus caecus trên các sợi

tơ mang dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền gen 28S rRNA

Nghiên cứu KST trên cá trê Clarotes laticeps thuộc bộ cá da trơn Siluriformes ở sông Niger- Benue, Lokoja, Nigeria của Eyo và Iyaji (2014) ghi nhận loài Trichodinid ciliates thu được trên mang và da cá trê Clarotes laticeps có tỷ lệ nhiễm cao nhất (22,2%) trong số các ký sinh trùng thu được trong nghiên cứu (sán dây Monobothroides woodlandii tỉ lệ nhiễm 9, 52%, sán dây Protocephalus largoprosglotis 4,76%, giun tròn Procamallanus laevionchus 3,17%)

1.3.1.2 Ấu trùng metacercariae

Vòng đời phát triển của sán lá song chủ trải qua nhiều giai đoạn phức tạp với 2 hay nhiều vật chủ trung gian khác nhau Ở giai đoạn bào nang metacercaria ký sinh trên cá, KST ảnh hưởng đến sinh trưởng và có thể gây chết hàng loạt cá ở giai đoạn giống trưởng thành Con người khi ăn cá sống hoặc nấu chưa chín có thể bị nhiễm các loại ký sinh trùng này và gây ảnh hưởng đến sức khoẻ (Nguyễn Văn Đề và cs, 2003)

Sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ký sinh trên cơ thể người gây bệnh trên gan, nói

chung gây bệnh phổ biến cho con người tại khu vực Đông Nam Á Gần đây, các nhà khoa học còn tìm thấy trường hợp bị nhiễm sán lá gan nhỏ tại Iran (Heidarpour và cs, 2007) Theo thống kê của WHO (2004), hiện nay chỉ tính riêng khu vực Đông Nam Á

có khoảng hơn 40 triệu người bị nhiễm sán lá gan (WHO, 2004)

Kim và cs (2006) nghiên cứu trên 5 loài cá là cá rô (Lateolabrax japonicus), cá biển (Konosirus punctatus), cá đối (Mugil cephalus), cá đối môi đỏ (Chelon haematocheilus) và cá bống (Acanthogobius flavimanus) tại vịnh Jinju, Hàn Quốc phát hiện được 3 loài metacercariae trên cá rô (Heterophyopsis continua 55,6%, Stictodora spp 28,9%, Metagonimus takahashii 6,7%), 4 loài trên cá đối (Pygidiopsis summa 100%, Heterophyes nocens 40%, Heterophyopsis continua 13,3%, Stictodora spp 6,7%), 3 loài trên cá đối môi đỏ (Pygidiopsis summa 91,7%, Heterophyes nocens 16,7%, Stictodora spp 16,7%), 1 loài trên cá biển (Heterophyopsis continua 65,7%) và 2 loài trên cá bống (Stictodora spp 82,9%, Heterophyopsis continua 27,7%)

Skov và cs (2009) nghiên cứu ký sinh trùng gây hại cho người trên cá nước ngọt tại Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền Kết quả tìm thấy 3 loài cercariae

(Parapleuro lophocercous Type A, B và C) trên vật chủ là ốc (Melanoides

tuberculata) và 3 loài metacercariae (Procerovum sp., Haplorchis pumilio và H taichui) trên cá (cá mè trắng, cá trôi Trung Quốc và cá rô đồng) Khi so sánh trình tự

gen ITS2 rDNA của các loài cercariae và metacercariae với các loài trên Genbank cho thấy trình tự tương đồng của gen ITS2 rDNA được xác nhận giữa cercaria Type A từ

ốc Melanoides tuberculata với metacercariae từ cá và cá thể trưởng thành của Haplorchis pumilio từ miền bắc, Việt Nam

Cho và cs (2011) thực hiện một cuộc khảo sát với quy mô lớn về tình trạng

nhiễm ấu trùng Clonorchis sinensis của các loài cá nước ngọt trong 3 khu vực ở bán

đảo Triều Tiên từ phía bắc Gangwon, trung tâm Chungcheongbuk và Gyeongsangbuk, khu vực phía nam Jeollanam, Ulsan-si và Gyeongsangnam Kết quả là ở khu vực phía

bắc, chỉ có 11 cá thể bị nhiễm ấu trùng Clonorchis sinensis (0,7%), ở khu vực trung tâm có 149 cá thể bị nhiễm ấu trùng Clonorchis sinensis (12,8%), khu vực phía nam có

538 cá thể bị nhiễm ấu trùng Clonorchis sinensis (39,5%)

1.3.2 Ở Việt Nam

1.3.2.1 Động vật nguyên sinh, sán lá đơn chủ, song chủ và giun sán

Sự phát triển nhanh chóng ngành thủy sản hiện nay dẫn đến sự xuất hiện của nhiều loại bệnh, trong đó KST là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh KST trên cá được bắt đầu và quan tâm nghiên cứu từ lâu Bác sỹ Albert Billet (1856- 1915) là người đầu tiên nghiên cứu KST

trên cá ở Việt Nam và mô tả được loài sán lá song chủ Distomun hypselobagri (1989)

ký sinh trong bóng hơi cá nheo Việt Nam (trích dẫn bởi Bùi Quang Tề, 2001)

Arthur và Bùi Quang Tề (2003) hệ thống khu hệ KST cá biển và nước ngọt tại Việt Nam bao gồm 453 loài ký sinh trùng gồm động vật nguyên sinh 48 loài Protozoa, Myxozoa (33 loài), sán lá song chủ 151 loài, sán lá đơn chủ 112 loài, sán dây 16 loài, giun tròn 16 loài, giun đầu gai 21 loài, lớp giun đốt 2 loài, phân lớp chân hàm Branchiura 3 loài, giáp xác Copepoda 12 loài và 2 loài giáp xác thuộc bộ Isopoda

Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) hệ thống khu hệ KST cá nước ngọt Việt Nam bao gồm động vật đơn bào, sán dây, sán lá đơn chủ, sán lá song chủ, giun tròn, giun đầu gai, giun đốt, thân mềm và chân khớp Trong đó, tìm thấy 11 loài trên cá lăng chấm

Hemibagrus guttatus và 13 loài trên cá lăng nha Hemibagrus nemurus thuộc giống Hemibagrus Ở giống Clarias, tìm thấy 17 loài (3 loài chưa được xác định) trên cá trê đen Clarias fuscus, 14 loài trên cá trê trắng Clarias batrachus, 30 loài tìm thấy trên cá

trê vàng Clarias macrocephalus và 4 loài trên cá trê phi Clarias garienpinus Trên các loài thuộc giống Pangasius, tìm thấy 29 loài (4 loài chưa xác định) trên cá tra nuôi Pangasiandon hypophthalmus, 18 loài trên cá ba sa Pangasius bocourti, 12 loài trên cá

hú Pangasius conchophilus và 11 loài trên cá vồ đém Pangasius larnaudii

Bên cạnh đó, hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về KST theo hướng chuyên sâu, khảo sát tình trạng nhiễm KST giữa cá giống và cá thịt, từ đó đưa ra các biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả

Nghiên cứu khảo sát KST ở cá thuộc giai đoạn giống và cá nuôi thương phẩm của

Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) cho thấy ở giai đoạn cá giống thường gặp các loài ngoại

ký sinh có chu kì phát triển trực tiếp không qua ký chủ trung gian ví dụ như trùng bánh

xe (Trichodina, Tripartiella, Trichodinella), sán lá đơn chủ (Dactylogyrus, Gyrodactylus, Thaparocleidus), trùng mỏ neo (Lernaea, Therodamas) với mức độ

nhiễm cao và có nguy cơ gây dịch bệnh làm cá chết nhiều, thiệt hại cho nghề nuôi Trong giai đoạn cá nuôi thương phẩm còn gặp thêm các KST có chu kì phát triển phức tạp và qua vật chủ trung gian

Theo Nguyễn Thị Thu Hằng và cs (2008) KST trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh

Kiên Giang thường nhiễm các loài ngoại KST như Acineta sp., Balandium polyvacuolum, Ichthyonyctus pangasia, Trichodia sp., … và nội ký sinh như Dactyloyrus sp., Bucephalosis gracilescens, Cucullanellus minutus

Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh (2015) tiến hành xác định thành

phần giống loài ký sinh trùng trên cá lóc (Channa striata) từ giai đoạn giống đến nuôi thương phẩm Kết quả cho thấy có 7 giống KST là Trichodina, Epistylis, Apiosoma, Dactylogyrus, Gyrodactylus, Pallisentic và Spinitestus Ký sinh trùng có tỷ lệ nhiễm cao nhất là Trichodina (1-183 trùng/thị trường 10X) và thấp nhất là Dactylogyrus (1

metacercariae là Centrocestus formosanus, Clonorchis sinensis và Haplorchis taichui,

tỷ lệ nhiễm ấu trùng metacercariae trên cá chép là 65,4% và cá trắm cỏ là 55,8% Ấu trùng Clonorchis sinensis chủ yếu ký sinh trong cơ của cá, tỷ lệ nhiễm C sinensis trên

cá chép là 27,5% và trên cá trắm là 24,6%

Dinh Thi Thuy và cs (2010) đánh giá tình trạng nhiễm ấu trùng SLSC metacercariae trên cá tra dựa theo mùa và độ tuổi ở Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam Nghiên cứu thu mẫu cá tra trên 2 hệ thống: hệ thống ao nuôi qui mô nhỏ, không xử lý môi trường (FHS) (279 con cá) và hệ thống ao nuôi qui mô lớn có xử lý môi trường (FHS) (848 con cá) vào mùa mưa và mùa khô Kết quả cho thấy sự xuất hiện và cường độ nhiễm của ấu

trùng metacercariae (Haplorchis pumilio, H taichui, Centrocestus formosanus và Procerovum sp.) có liên quan đến sự biến đổi theo mùa và độ tuổi Tỉ lệ nhiễm của các

loài ấu trùng metacercariae cao vào mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10 và độ tuổi từ 61 đến 90 ngày

Dang và cs (2013) phát hiện 9 loài ấu trùng sán lá song chủ trên các loài cá tra

(Pangasianodon hypophthamus), cá rô đồng (Anabas testudineus) và cá đối (Liza tade) Tỉ lệ cảm nhiễm dao động tùy theo loài metacercariae và loài cá nghiên cứu, thấp nhất là 2,13% đối với Centrocestus formosanus trên cá tra và cao nhất là 83,33% đối với Procerovum sp trên cá đối

Qua các hoạt động điều tra nghiên cứu KST trên cá nước ngọt nói chung và cá da trơn nói riêng ở Việt Nam cho thấy hầu hết các loài cá nước ngọt có giá trị cao đều được khảo sát Tuy nhiên, các phân loại KST trên các loài cá da trơn cũng chủ yếu

nghiên cứu ở cá tra Pangasianodon hypophthamus và cá trê (cá trê đen Clarias fuscus

và trê vàng Clarias macrocephalus) Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về thành phần ký sinh trùng và mối quan hệ tiến hóa được thực hiện trên cá lăng

(Hemibagrus spilopterus) và cá sát sọc (Pangasius macronema)

1.4 Tổng quan về mối quan hệ phát sinh loài KST trên cá nước ngọt

Ký sinh trùng là những loài có cấu tạo hình thái rất đa dạng, khi phân loại dựa vào hình thái thì rất dễ xảy ra sự nhầm lẫn giữa các loài trong cùng một giống hoặc giữa các giống với nhau Do đó việc bổ sung nghiên cứu về di truyền để định danh phân loại KST

sẽ giúp xác định chính xác các loài KST

Mối quan hệ phát sinh loài được thể hiện dưới dạng cây phát sinh chủng loại cho thấy mối quan hệ họ hàng, quá trình tiến hóa của các loài sinh vật thông qua dữ liệu về chỉ thị phân tử di truyền

1.4.1 Đặc điểm của hệ gen ribosome

Hệ gen của một sinh vật chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động Ở các sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), 99% hệ gen nằm trong nhân tế bào, phần còn lại nằm trong một số cơ quan như ty thể và lạp thể

Trong các nghiên cứu phân loại học thường sử dụng DNA nhân vì các DNA này

có kích thước lớn, tần số đột biến thấp, việc truyền tính trạng tuân theo các định luật chặt chẽ (Brown và cs, 1979)

Trong hệ gen nhân tế bào, gen ribosome DNA (rDNA) là một tổ hợp gen quan trọng Gen ribosome DNA (rDNA) là nhóm gen mã hóa của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh loài (White và cs, 1989)

Cấu tạo của Ribosome: rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome, rRNA chiếm

tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến 75% của tổng số RNA Ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi các hằng số S (White và cs, 1989) Ở Eukaryote, ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm 2 đơn vị: đơn vị lớn (60S) và đơn vị nhỏ (40S)

Hình 1.5 Vùng rDNA (5.8S, 18S, 28S) của vi sinh vật nhân chuẩn

(Nguồn: http://www.genomebiology.com)

Các chỉ thị phân tử của gen ribosome (18S, 28S, ITS1 và ITS2) được ứng dụng rộng rãi trong định danh loài và nghiên cứu di truyền phả hệ (Kim Văn Vạn và cs, 2007; Katokhin và cs, 2008)

Các rDNA 5.8S, 18S, 28S phiên mã thành các rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ các vùng

phiên mã trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) (Hình 1.4) Giữa các nhóm

gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không

có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại rDNA 5S thường chỉ có ở nhân Kích thước của mỗi vùng lập lại nằm trong khoảng 7.7 – 24 kbp Trong các loại rDNA nêu trên, 28S có vai trò quan trọng trong phân loại học; cạnh đó, vùng ITS là

vùng có nhiều biến đổi thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa ở vi sinh vật nhằm xác định mức độ biệt hóa (Guarro Josep và cs, 1999)

1.4.2 Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài ký sinh trùng

Hiện nay có nhiều nghiên cứu KST trên cá nước ngọt dựa vào đặc điểm hình thái

và di truyền và khảo sát mối quan hệ tiến hóa

Leon và cs (2010) đã phát hiện được ấu trùng metacercariae Posthodiplostomum

sp trên cơ cá nước ngọt ở sông Nazas, miền bắc Mexico Kết quả của nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (sử dụng gen ribosome) Các cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen 18S rRNA, 28S rRNA, ITS rDNA để đánh giá mối quan hệ giữa các giống loài trong họ Diplostonidae

Anshu và Hridaya (2013) đã nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh

loài dựa vào gen 28S rRNA của 2 loài sán lá đơn chủ Thaparocleidus và Bifurcohaptor Kết

quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các loài của cùng một giống

Vũ Đặng Hạ Quyên và cs (2013) nghiên cứu thành phần ký sinh trùng trên cá tra

(Pangasianodon hypophthamus) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền Kết quả phát

hiện được 9 loài KST bao gồm trùng bào tử, trùng lông, sán lá đơn chủ, sán lá song chủ và giun tròn Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rRNA cho thấy mối quan

hệ gần gũi giữa các loài sán lá đơn chủ với nhau (sự khác biệt trình tự 2,2 đến 2,9%)

và đối với các loài sán lá song chủ (sự khác biệt trình tự 18,55 và 18,7 %)

Đặng Thúy Bình và cs (2014) xác định ấu trùng sán lá song chủ (metaceriae) ký

sinh trên một số loài cá (cá tra Pangasianodon hypophthamus, cá rô đồng Anabas testudineus, cá đối Mugil cephalus) dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền Kết quả

cây phát sinh loài với dữ liệu trình tự gen 28S rDNA dựa trên phương pháp MP, ML cho

thấy sự đồng dạng của các giống nghiên cứu, ngoại trừ giống Haplorchis và Procerovum Các loài thuộc 2 họ Heterophyidae và Opisthorchiidae được sắp xếp chung

1 nhánh Sự khác biệt di truyền của các loài dao động từ 2% đến 9%

Fathy và cs (2015) khảo sát một số loài giun tròn trên 80 cá thể cá bơn (Solea solea) ở bờ biển thành phố Alexandria dọc theo biển Địa Trung Hải, Ai Cập Kết quả phát hiện được một loài giun tròn thuộc giống Hysterothylacium (Anisakidae) trên vật chủ mới và sử dụng chỉ thị phân tử 18S rRNA để định danh tới loài Hysterothylacium aduncum, cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc giống H aduncum và Hysterothylacium sp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng: Thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá da trơn ở khu vực

Trung Bộ (Sông Cái Nha Trang), Nam Bộ (Cần Thơ) và Tây Nguyên (Đăk Lăk)

Vật liệu: 3 loài cá da trơn bao gồm cá lăng (Hemibagrus spilopterus), cá trê đen

(Clarias fuscus), cá sát sọc (Pangasius macronema)

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng 6 năm 2017

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu:

Mẫu cá lăng Hemibagrus spilopterus được thu tại các chợ địa phương Đăk Lăk

Mẫu cá sát sọc Pangasius macronema thu tại các chợ địa phương ở Cần Thơ Mẫu cá trê đen Clarias fuscus được thu tại khu vực sông Cái Nha Trang

Tiến hành thu mẫu và phân tích ký sinh trùng tại Phòng Sinh học phân tử - Trung

tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

Thu mẫu cá, chụp hình

Tính tỷ lệ nhiễm và

mật độ nhiễm trung

bình

Tiến hành soi và thu mẫu KST

Đo kích thước và cân khối lượng cá

Giải phẫu cá Tiêu cơ cá

Đếm KST (thu thập

số liệu)

Tách chiết DNA Bảo quản,

nhuộm tiêu bản

Điện di kiểm tra kết quả

Giải trình tự và định danh loài bằng di truyền Chạy PCR

Xây dựng cây phát sinh loài Nghiên cứu đặc điểm hình thái Nghiên cứu đặc điểm di truyền

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu, cố định, nhuộm màu và bảo quản KST theo phương pháp nghiên cứu KST toàn diện trên cá của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007)

Vật liệu phân loại ký sinh trùng: Bao gồm tiêu bản nhuộm màu và không nhuộm màu Các tiêu bản được lưu trữ tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Trung tâm

Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang

2.3.1 Phương pháp thu mẫu cá da trơn

Tổng số mẫu cá thu và kiểm tra là 77 cá thể của 3 loài cá da trơn gồm cá trê đen (21 cá thể) thu tại khu vực sông Cái Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa, cá lăng (17 cá thể) thu tại tỉnh Đắk Lắk và cá sát sọc (39 cá thể) được thu ở Cần Thơ

Mẫu cá thu trong tình trạng còn sống hoặc còn tươi, chưa bị khô nhớt, ít bị tổn thương do đánh bắt và bảo quản tươi để vận chuyển về phòng thí nghiệm Chiều dài và

khối lượng của các loài cá da trơn nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Số lượng, chiều dài và khối lượng của các loài cá trong nghiên cứu

Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) 17 22,75 ± 2,38 129,05 ± 17,25

Cá trê đen (Clarius fuscus) 21 15,24 ± 4,14 59,79 ± 19,77

(Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

2.3.2 Phương pháp thu KST trên cá

Nội và ngoại ký sinh trùng được thu dựa vào Hà ký và Bùi Quang Tề (2001), được bổ sung bởi Hà Ký (2007)

Ngoại ký sinh: Nghiên cứu quan sát cá bằng mắt thường để phát hiện các loài

KST có kích thước lớn (≥1mm) trên da, vây, vẩy, mắt và miệng Những KST không nhìn thấy bằng mắt thường (<1mm) được tiến hành cạo nhớt da một số khu vực đặc trưng (vây, đuôi) Sau đó, tiến hành lấy nhớt mang và cắt rời từng cung mang cho vào

đĩa Petri có chứa một ít nước muối sinh lý để chuẩn bị cho quá trình kiểm tra KST

Nội ký sinh: Tiến hành giải phẫu cá để thu và tách riêng các bộ phận nội quan

(tim, gan, ruột, dạ dày) chuẩn bị tiến hành kiểm tra KST

Trong cơ cá, bào nang ấu trùng metacercaria có thể ký sinh Metacercariae được

thu bằng phương pháp tiêu cơ được trình bày trong Phụ lục 3

2.3.3 Phương pháp kiểm tra KST

Ngoại ký sinh trùng

Tiến hành lấy nhớt cho lên lam kính, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý, đậy lamel lên rồi quan sát dưới kính hiển vi Olympus BX41TF (Nhật Bản) để quan sát rõ hình dạng, cấu tạo của trùng Sau đó quan sát hình dạng KST dưới kính hiển vi Olympus (4x, 10x, 40x, 100x)

Từng cung mang sau khi được cắt, dùng dùi giải phẫu xem xét kỹ các tơ mang và quan sát trực tiếp trên kính soi nổi để phát hiện KST, sau đó cho trực tiếp KST trên lam kính và tiến hành kiểm tra trên kính hiển vi

Gan: trước hết tách gan ra, quan sát phía ngoài gan (gan cá được quan sát màu sắc, hình dạng), tiếp đó gan cá được cắt, nén ép trên lam kính và quan sát bằng kính giải phẫu Tiến hành nghiên cứu lá lách cũng tương tự như vậy

 Ruột: thu mẫu KST ở ruột có thể bắt đầu từ ruột sau đến ruột trước và ngược lại Dùng kéo nhọn, dao nhỏ cắt ruột thành từng đoạn, mổ dọc ra xem xét (cắt cẩn thận tránh ảnh hưởng đến KST) Tất cả những KST có thể thấy bằng mắt thường thì dùng kẹp nhọn lấy ra cho vào nước muối sinh lý Sau đó lấy nội chất ép giữa hai miếng kính

để quan sát dưới kính lúp hoặc kính hiển vi soi nổi, có thể tìm thấy sán lá, sán dây, giun tròn, giun đầu gai

 Thận: Khi kiểm tra, ép một ít thận trên lam kính để quan sát dưới kính hiển vi

 Dạ dày: Tiến hành mổ dạ dày theo đường dọc, đẩy thức ăn cùng KST bên trong

ra rồi kiểm tra bằng mắt thường và trên kính hiển vi soi nổi

Kiểm tra KST (ấu trùng metacercariae) trong cơ cá

Để nghiên cứu ấu trùng metacercaria ta tiến hành quan sát phần lắng cặn trong đĩa petri dưới kính hiển vi soi nổi, kiểm tra và định loại metacercariae

Tách riêng từng loại và đếm số lượng metacercariae của mỗi loài ấu trùng sán lá

 Sau khi phát hiện KST thì cần đếm số lượng, ghi chú vị trí ký sinh để xác định tỷ lệ nhiễm và mật độ nhiễm

2.3.4 Phương pháp bảo quản, cố định mẫu và nhuộm tiêu bản

Ký sinh trùng sau khi được thu nhận, tiếp tục nghiên cứu hình thái bằng cách soi tươi hoặc nhuộm Các mẫu tươi còn lại được bảo quản trong cồn tuyệt đối để nghiên cứu di truyền

Cố định và nhuộm tiêu bản

Mẫu là các loài KST (sán lá đơn chủ, sán lá song chủ, giun tròn, giun đầu gai và sán dây)

Sử dụng phương pháp nhuộm carmin

 KST được cố định qua các thang cồn có nồng độ 300, 700 và mỗi thang nồng độ duy trì 15 phút, sau đó làm trong KST trong Lactophenol (Thành phần bao gồm Phenol và acid lactic trong glycerol và nước) hoặc acid lactic trong 10 phút, và nhuộm bằng Ammonium picrate (Thành phần bao gồm Amonium và acid picric trong glycerol) hoặc Carmin (Thành phần bao gồm Carmin, HCl, Cồn 90% và nước cất) trong 45 – 60 phút, (tùy vào cơ quan phân loại, muốn phát hiện các cơ quan cứng như móc bám và cơ quan giao cấu thì nhuộm bằng Ammonium picrate, còn đối với cơ thể gồm tinh hoàn, buồng trứng thì sử dụng Carmin) tùy vào kích thước của KST

 Sau khi nhuộm hút toàn bộ dịch nhuộm ra bằng ống hút thủy tinh và rửa lại bằng cồn 500 trong 1 phút, gắn vaselin 4 góc, đậy lamen và quan sát KST dưới kính

hiển vi độ phóng đại 4X - 100X

Mẫu là ấu trùng sán lá song chủ metacercariae

 Phá nang: Muốn xác định được loài metacercariae thì cần phải phá bào nang của chúng, ép nhẹ nang metacercariae dưới lamen với nước cất hoặc nước muối sinh

lý để làm vỡ nang metacercariae Việc này giúp việc quan sát, những đặc điểm hình thái quan trọng dễ dàng hơn để phân loại

 Soi tiêu bản tươi trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 4X - 100X

Đối với các giống sán lá nhỏ như Haplorchis, Metagonimus, Procerovum và một số

giống khác nên được cố định trong formaline nóng 5%

2.3.5 Phương pháp đo KST

Đối với các mẫu KST làm tiêu bản, thực hiện đo trên tiêu bản Mẫu không làm tiêu bản, đo trên mẫu tươi hoặc mẫu đã cố định

Những loài KST có kích thước lớn (> 1mm) có thể dùng thước đo trực tiếp (độ chính xác ±0,5mm)

Những loài KST có kích thước nhỏ được đo bằng kính hiển vi Olympus BX41TF

có gắn thước đo trên thị kính tương ứng với 100 vạch quan sát

KST được quan sát dưới vật kính (4X, 10X, 40X, 100X), quan sát chiều dài của KST tương ứng với số vạch của thước đo khi quan sát thị kính sau khi đã được hiệu chỉnh bằng thước đo chuẩn (1 vạch/vật kính 10X = 0,01mm, 1 vạch/vật kính 4X = 0,025mm), từ đó suy ra kích thước của KST phân loại

Cách đo các cơ quan của các loài sán lá đơn chủ Monogenean, sán lá song chủ Digenea, sán dây Cestoda, Giun tròn Nematoda, giáp xác Crustacea, giun đầu gai

Acanthocephala, ấu trùng Metacercariae được trình bày trong Phụ lục 1

Được đánh giá dựa vào số lượng của KST trên tổng số cá nhiễm

 Mật độ nhiễm KST trung bình trên cơ thể cá:

Số liệu được xử lý dựa vào phần mềm Microsoft Excel (2013)

2.3.7 Phương pháp phân loại KST dựa vào đặc điểm hình thái

Sau khi quan sát dưới kính hiển vi, KST được phân loại và mô tả hình thái theo khóa phân loại của Yamaguti (1958), Hà Ký (2007), sán dây (Cestode), giun tròn (Nematode) được phân loại theo Beveridge và Justine (2006); sán lá song chủ (Digenea) (Bray và cs, 2011); sán lá đơn chủ (monogenea) (Sherman, 1994; Kritsky và cs, 2013),

giáp xác (copepod) (Boxshall và cs, 2008; Boxshall và cs, 2009); ấu trùng metacercariae

được phân loại theo Hà ký và cs (2007), Sohn (2009), Sohn và cs (2009), Pinto và cs (2012), Fibozopa laboratory Manual

Đặc điểm hình thái KST được vẽ trực tiếp dựa trên phần mềm ArcGis 10.1 và xử

lý bằng Photoshop CS6

Đặc điểm phân loại chủ yếu của các nhóm KST:

Trùng bánh xe (Trichodina): phân loại dựa vào hình dạng, cấu tạo, số lượng

răng, số lương răng bám, đường kính vòng móc bám, đường phóng xạ

Sán lá đơn chủ (Monogenea): Căn cứ vào cơ quan giao cấu đực và cái, móc

bám, thanh nối, số lượng và hình dạng các móc rìa

Sán lá song chủ (Digenea): Căn cứ vào hình dạng, cấu tạo của cơ thể Hình

dạng, cấu tạo của cơ quan bám, vị trí và tỷ lệ về kích thước của giác bụng và giác miệng, kích thước buồng trứng, tinh hoàn

Sán dây (Cestoda): Căn cứ phần đầu của sán biến đổi thành các cơ quan bám có

nhiều dạng khác nhau và sự sắp xếp tinh tùng, buồng trứng

Giun tròn (Nematoda): Căn cứ vào hình dạng, cấu tạo cơ thể, phần đầu, phần

đuôi, thực quản Ngoài ra còn dựa vào gai giao cấu, túi tinh của con đực, mấu nhọn ở con cái

Giáp xác (Crustacea): Dựa vào hình dạng, kích thước râu, tỷ lệ chiều dài, chiều

rộng cơ thể, kích thước các chân bơi, hình dạng của đốt sinh dục và chiều dài của buồng trứng

Giun đầu gai (Acanthocephala): Dựa vào hình dạng, kích thước vòi gai, số

lượng gai trên vòi và gai phần thân, tinh hoàn và buồng trứng

Ấu trùng Metacercariae: Dựa vào các đặc điểm hình thái sau:

Dạng ấu trùng và dạng trưởng thành

Hình dạng và kích cỡ bào nang: Hình tròn hoặc hình bầu dục

Các giác (miệng và bụng), kích thước các giác, số lượng và hình dạng các vòng răng/gai

Hình dạng tuyến bài tiết

Đo các thông số hình thái gồm kích thước bào nang, thành bào nang (nếu dày), giác miệng, giác bụng, tinh hoàn, kích thước gai miệng, gai quanh lỗ sinh dục, số lượng móc

và răng quanh vòi sinh dục (Haplorchis taichui có 11-16 móc, Haplorchis pumilio có

36-42 răng nhỏ và Haplorchis yokogawi có 70-74 răng nhỏ)

2.4 Nghiên cứu đặc điểm di truyền KST trên một số loài cá da trơn

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số của các loài KST

Cách tiến hành: DNA của 1 cá thể KST (sán lá song chủ, đơn chủ, giun sán, giáp xác)

và 10 – 15 cá thể ấu trùng (metacercariae) của cùng 1 loài được tách chiết bằng bộ kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen) theo các bước được trình bày ở Phụ Lục 2 DNA sau

khi tách chiết được bảo quản trong tủ đông ở – 400C

2.4.2 Phản ứng PCR

Cách tiến hành: Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 μL gồm 9 μL

khuôn DNA, 5 μL 10X Dream Taq Buffer, 1 μL dNTP (10mM), 1 μL mỗi mồi (10µM), 0.25 μL Taq DNA polymerase (5 Unit/1 µl) và 32,75 nước cất cho đủ thể tích Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phản ứng khuếch đại đoạn gen được trình bày

ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR

Sán lá song chủ, sán dây, giun tròn, giun đầu gai

Sán lá song chủ, đơn chủ, giun tròn, sán dây, giun đầu gai

Trong nghiên cứu hiện tại có 2 cặp mồi thiết kế để chạy phản ứng PCR đó là cặp mồi ThaF, ThaR và 18SpF, 18SpR

Cặp mồi ThaF, ThaR được thiết kế dựa trên một số trình tự có sẵn trên Genbank

của 7 loài sán lá đơn chủ thuộc giống Thaparocleidus (Thaparocleidus sp., T obscura,

T mutabilis, T asoti, T magnicirrus, T omegavagina, T varicus) của gen 28S rRNA

Độ dài của mồi thiết kế nằm trong khoảng 20-21 nucleotide Nhiệt độ nóng chảy của mồi ThaF là 62,50C và ThaR là 59,40C Nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi tối ưu là 560C và

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 28S rRNA (Cặp mồi C1, D2 và cặp mồi

là 62,50C Nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi tối ưu là 560C và sản phẩm PCR khoảng

1350-1400 bp Trình tự bắt cặp của mồi thiết kế được trình bày trong phần Phụ lục 3

Chu trình phản ứng PCR:

Đối với gen 28S rRNA (cặp mồi LSU-5, 1500R): Chu trình nhiệt gồm 940C trong 3 phút; 40 chu kỳ của 940C trong 30s, 560C trong 45s, 720C trong 1 phút; chu kỳ cuối 720C trong 7 phút (Olso và cs, 2003, Mollare và cs, 1997) (Hình 2.2)

Đối với gen 28S rRNA (Cặp mồi C1, D2 và cặp mồi ThaF, ThaR): Chu trình nhiệt gồm 940C trong 5 phút; 30 chu kỳ của 940C trong 1 phút, 560C trong 1 phút,

720C trong 1 phút; chu kỳ cuối 720C trong 5 phút (Hình 2.3)

Đối với gen 18S rRNA: Chu trình nhiệt gồm 950C trong 4 phút; 35 chu kỳ của

920C trong 1 phút, 560C trong 1 phút, 720C trong 1 phút; chu kỳ cuối 720C trong 10

phút (Hình 2.4)

3 phút 30s

560C 45s

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của PCR với gen 28S rRNA (Cặp mồi LSU-5, 1500R)

Điện di sản phẩm PCR, kiểm tra kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % bổ sung 2µl Ethidium bromide

Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem

các băng DNA dưới tia cực tím

2.4.3 Giải trình tự

Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96o

C trong 20 giây,

50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.5 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài

Trình tự gen 28S rRNA và 18S rRNA của 12 loài KST thu được từ 3 loài cá nghiên cứu được xử lý và kết nối bằng phần mềm Vector NTI verson 11.5.0 (Huang và Xiaoqiu,

1996), sau đó kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast) Các trình tự được dóng hàng (alignment) bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường và xác định mức độ tương đồng của các loài Sự khác biệt di truyền được tính theo công thức sau

Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen 28S rRNA của 12 loài KST thu được trong NCHT và 10 loài trên GenBank; đối với gen 18S rRNA gồm 12 trình tự thu được và 6 trình tự từ Genbank Thông tin về loài, vật chủ, khu vực nghiên

cứu, mã số GenBank được trình bày ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4

Hình 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S rRNA

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài của KST được tiến hành dựa trên phần mềm MEGA 6.06 (Kumar và cs, 2009), sử dụng thuật toán Maximum likelihood (ML) Đối với thuật toán Maximum likelihood (ML), các mô hình tiến hóa được kiểm tra bằng Modeltest trong R-studio (Robert và Ross, 1993) trước khi xây dựng cây tiến hóa Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 28S rRNA có mô hình tối ưu là GTR được lựa chọn dựa trên 46 mô hình tiến hóa với tần suất các base nitơ là A = 0,2145; C

= 0,188; G = 0,2914; T = 0,3058; tỷ lệ các vị trí không biến đổi là 0,1638 và thông số dạng phân bố gamma là 1,630 Đối với trình tự gen 18S rRNA, cây phát sinh loài cũng được dựa trên mô hình tối ưu là GTR với tần suất các base nitơ là A = 0,2868; C = 0,2849; G = 0,2046; T = 0,2237; tỷ lệ các vị trí không biến đổi là 0,4524 và thông số dạng phân bố gamma là 0,7248

Giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán ML với độ lặp lại 1000 lần Cây phân loại được hiển thị và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView (Page, 1996)

Bảng 2.3 Thông tin 12 loài KST sử dụng gen 28S rRNA trong NCHT và 10 loài trên GenBank

Sán lá song chủ (Digenea)

1 Haplorchis pumilio Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

2 Posthodiplostomum minimum Cá trê (Clarias fuscus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

3 Posthodiplostomum sp VT-2013 Cá lóc (Channa punctatus) Ấn Độ Tandon và cs (2013) KF738450

4 Allocreadium markewitschi Cá trê (Clarias fuscus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

6 Procerovum cheni Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

7 Procerovum varium Cá rô Anabas testudineus Thai Lan Thaenkham và cs (2010) HM004182

8 Haplorchis taichui Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

9 Haplorchis yokogawai Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

Sán lá đơn chủ (Monogenea)

13 Cornudiscoides longicirrus Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

14 Cornudiscoides agarwali Cá chốt sọc (Mystus vittatus) Ấn Độ Verma và cs (2015) KU208071

15 Bychowskyella tchangi Cá trê đen (Clarias fuscus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

17 Gyrodactylus sp Cá trê đen (Clarias fuscus) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

19 Thaparocleidus campylopterocirrus Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

20 Mizelleus siamensis Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

21 Thaparocleidus sp Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

Bảng 2.3 Thông tin của 12 loài KST sử dụng gen 18S rRNA trong NCHT và 6 loài trên GenBank

Sán lá song chủ (Digenea)

1 Haplorchis pumilio Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

2 Posthodiplostomum minimum Cá trê (Clarias fuscus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

3 Posthodiplostomum sp Cá lóc Channa punctatus Ấn Độ Tandon và cs (2013) KF738455

4 Allocreadium markewitschi Cá trê (Clarias fuscus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

5 Allocreadium neotenicum Bọ cánh cứng Hydroporus rufifrons Anh Bray và cs (2010) JX983204

6 Procerovum cheni Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

7 Procerovum varium Cá rô Anabas testudineus Thái Lan Thaenkham và cs (2010) HM004199

8 Haplorchis taichui Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

9 Haplorchis yokogawai Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt Nam Nghiên cứu hiện tại

Sán lá đơn chủ (Monogenea)

10 Cornudiscoides longicirrus Cá lăng (Hemibagrus spilopterus) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

11 Bychowskyella tchangi Cá trê (Clarias fuscus) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

13 Gyrodactylus sp Cá trê (Clarias fuscus) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

14 Gyrodactylus rhodei Cá Rhodeus sericeus Cộng hòa Séc Matejusova và cs (2003) AJ567670

16 Mizelleus siamensis Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

17 Thaparocleidus sp Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

18 Thaparocleidus campylopterocirrus Cá sát sọc (Pangasius macronema) Việt nam Nghiên cứu hiện tại

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thành phần và đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trên các loài cá nghiên cứu

Tổng cộng 77 cá thể cá da trơn được thu tại 3 khu vực Tây Nguyên, Nam Bộ, Nam Trung Bộ Dựa vào các thông số hình thái và các đặc điểm phân loại, nghiên cứu

đã phát hiện được 18 loài ký sinh trùng Trong đó, sán lá song chủ 7 loài, sán lá đơn chủ 6 loài, giun tròn 2 loài, sán dây 1 loài, trùng bánh xe 1 loài và giun đầu gai 1 loài

Danh sách các loài ký sinh trùng được trình bày trong Bảng 3.1