Nghiên cứu đa dạng thành phần loài myxosporea (myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh quảng bình

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN NGỌC CHỈNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI MYXOSPOREA MYXOZOA KÝ SINH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH QUẢNG BÌNH... Cây phát sinh chủ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN NGỌC CHỈNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI MYXOSPOREA (MYXOZOA) KÝ SINH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ Ở VÙNG BIỂN VEN BỜ TỈNH QUẢNG BÌNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi Tất cả các

số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực

Tôi xin cam đoan các thông tin và số liệu được trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, Ngày 09 tháng 09 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Ngọc Chỉnh

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sỹ, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho chúng tôi trong khóa học 2015-2017

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Ngọc Doanh và thầy Nguyễn Hữu Đức đã tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Duy Ngọ và TS Nguyễn Văn Hà chủ nhiệm Dự án 47 (VAST.DA47.12/16-19) và đề tài Điều tra cơ bản đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn quỹ học bổng Nagao đã hỗ trợ một phần kinh phí trong 2 năm học để tôi hoàn thành khóa học này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS Christopher M Whipps, người đã giúp đỡ tôi trong phân tích di truyền

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè trong lớp CNSH CH24C, các đồng nghiệp trong phòng Ký sinh trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này

Hà Nội, Ngày 09 tháng 09 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Ngọc Chỉnh

MỤC LỤC

Lời cam đoan 1

Lời cảm ơn ii

Mục lục ii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Danh mục chữ viết tắt vi

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái quát chung về myxozoa 3

2.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học và vòng đời của myxozoa 4

2.2 Phân loại myxosporea 6

2.2.1 Phân loại hình thái học 6

2.2.2 Mối quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa 8

2.3 Vai trò của myxosporea 10

2.4 Tình hình nghiên cứu myxozoa 11

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở việt nam 11

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

3.1 Địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Thời gian nghiên cứu 13

3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 13

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.3.2 Các loài cá nghiên cứu 13

3.4 Nội dung nghiên cứu 16

3.5 Phương pháp nghiên cứu 16

3.5.1 Thu mẫu vật chủ ngoài thực địa 16

3.5.2 Phương pháp thu thập mẫu ký sinh trùng 17

3.5.3 Nhuộm hematoxylin - eosin 17

3.5.4 Phân tích hình thái học 18

3.5.5 Phương pháp phân tích dna 20

Phần 4 Kết quả và thảo luận 22

4.1 Kết quả 22

4.1.1 Thành phần loài trùng bào tử sợi myxosporea ở cá biển tại địa điểm nghiên cứu 22

4.1.2 Mô tả các loài myxosporea ký sinh trên cá biển vùng biển ven bờ tỉnh quảng bình 23

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm và vị trí nhiễm các loài myxosporea 57

4.1.4 Tình hình nhiễm myxosporea theo bộ vật chủ 58

4.2 Thảo luận 59

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 62

Tài liệu tham khảo 63

Danh sách công trình công bố liên quan đến nội dung nghiên cứu 70

Phụ lục 91

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần các loài vật chủ nghiên cứu 13

Bảng 3.2 Quy trình nhuộn Hematoxylin - Eosin 18

Bảng 4.1 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa 25

Bảng 4.2 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa 28

Bảng 4.3 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong giống Sphaeromyxa 29

Bảng 4.4 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Myxidium 31

Bảng 4.5 Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Myxidium 32

Bảng 4.6 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Auerbachia 40

Bảng 4.7 Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Auerbachia 42

Bảng 4.8 Bảng so sánh đặc điểm của Unicapsula andersenae thu ở Úc và Việt Nam 45

Bảng 4.9 Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Unicapsula 46

Bảng 4.10 Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa monodactyli 47

Bảng 4.11 So sánh kích thước của loài K scomberomori và K grammatorcyni 50

Bảng 4.12 Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa megacapsula 52

Bảng 4.13 Bảng so sánh kích thước của loài Kudoa kenti ở Việt Nam và Úc 55

Bảng 4.14 Khoảng cách di truyền giữa các loài khác nhau của giống Kudoa 56

Bảng 4.15 Tỷ lệ nhiễm và vị trí nhiễm của các loài myxosporea 57

Bảng 4.16 Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng myxosporea theo bộ vật chủ 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vòng đời của trùng bào tử sợi 5

Hình 2.2 Quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa 10

Hình 3.1 Các số đo cần thiết để định loại ký sinh trùng myxosporea 19

Hình 4.1 Loài Sphaeromyxa n.sp.1 24

Hình 4.2 Loài Sphaeromyxa n.sp.2 26

Hình 4.3 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Sphaeromyxa 29

Hình 4.4 Loài Myxidium n.sp 30

Hình 4.5 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Sphaeromyxa 33

Hình 4.6 Loài Ceratomyxa sp.1 34

Hình 4.7 Loài Ceratomyxa sp.2 35

Hình 4.8 Loài Ceratomyxa sp.3 36

Hình 4.9 Loài Ceratomyxa sp.4 37

Hình 4.10 Loài Auerbachia chakravartyi Narasimhamurti, Kalavati, Anuradha, Padma, 1990 39

Hình 4.11 Loài Auerbachia n.sp 41

Hình 4.12 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Auerbachia 42

Hình 4.13 Loài Unicapsula andersenae Miller and Adlard, 2013 44

Hình 4.14 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Unicapsula 45

Hình 4.15 Loài Kudoa monodactyli Gunter, Cribb, Whipps and Adlard, 2006 48

Hình 4.16 Loài Kudoa scomberomori Adlard et al., 2005 49

Hình 4.17 Loài Kudoa megacapsula Yokoyama and Itoh, 2005 51

Hình 4.18 Loài Kudoa kenti Burger and Adlard, 2009 54

Hình 4.19 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Kudoa 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

GENBANK  Ngân hàng gen quốc tế

ITS  Internal transcribed spacer

LSU rDNA  Large subunit ribosomal DNA

MEGA  Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử

NCBI  Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

 (National Center for Biotechnology Information)

SSU rDNA  Small subunit ribosomal DNA

PCR  Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

QĐ-UBND  Quyết định - Ủy ban Nhân dân

rpm  Số vòng quay trên phút (Revolutions Per Minute)

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Ngọc Chỉnh

Tên luận văn: Nghiên cứu thành phần loài myxosporea (Myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

- Hiểu biết được đa dạng thành phần loài myxosporea ký sinh trên các loài cá

- Biết được một số đặc điểm khu hệ myxosporea ký sinh trên cá

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thu mẫu vật chủ bằng cách thu mua tại các cảng cá Vật chủ sau đó được chụp ảnh, ghi lại các thông tin và định loại Vật chủ được mổ khám tìm kiễm ký sinh trùng myxosporea trên mang, cơ da mật, ruột não

Mẫu ký sinh trùng myxosporea được định loại bằng phương pháp hình thái học theo khóa phân loại của Lom and Diková (1992) và của Fiala et al., (2015) kết hợp với phân tích di truyền

Kết quả chính và kết luận

- Trong số 740 cá thể thuộc 37 họ, 8 bộ cá tại Quảng Bình được nghiên cứu có

116 (15,6%) cá thể thuộc 14 loài bị nhiễm trùng bảo tử sợi myxosporea, tỷ lệ nhiễm ở các loài cá dao động từ 26,6-92,0%

- Kết hợp phương pháp định loại hình thái và phân tử đã định loại mô tả được

14 loài myxosporea Trong đó có 4 loài được ghi nhận là loài mới cho khoa học, 5 loài là ghi nhận mới cho Việt Nam và có 4 loài thuộc giống Ceratomyxa mới xác định đến giống

- Các loài trùng bào tử sợi có tính thích nghi vật chủ hẹp, mỗi loài myxosporea ký sinh trên các loài vật chủ cá khác nhau, riêng loài cá Bò Paramonacanthus japonicus bị nhiễm 2 loài ở hai vị trí khác nhau Riêng loài U andersenae được ghi nhận ký sinh trên

3 loài vật chủ: Cá Bò Paramonacanthus japonicus, Cá Móm gai ngắn Gerres limbatus,

Cá Nạng bạc Otolithes ruber

- Trong số 8 bộ cá nghiên cứu, chỉ có bộ cá Nhói Beloniformes chưa phát hiện nhiễm trùng bào tử sợi

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Ngoc Chinh

Thesis title: Study on the diversity of the composition of myxosporea (Myxozoa) from some coastal marine fishes in Quang Binh province

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

- Understanding the diversity of the composition of myxosporean infecting in some marine fishes

- Know the features of the Myxosporean parasites on fish

Materials and Methods

- The fresh fishes were bought on the market port in the morning Then, these fishes was taken photo and identified It was opened by cut for collecting myxosporean

in muscle, gallbladder, skin, kidney, gill, brain,…

- The myxosporean was identified by the morphological and molecular methods Main findings and conclusions

- Out of 740 fishes in 37 families, 8 oder of marine fishes in Quang Binh were studied One hundred and sixteen of fishes (15.6%) in 14 species was infected by myxosporean with the intensity of infection was from 26.6% to 92%

- The study described 14 species of myxosporean with 4 new species and 5 species were new records for Vietnam

- Each species of myxosporea parasitizes on different host species However, the species Hairfinned leatherjacket (Paramonacanthus japonicus) was infected by 2 species of myxosporea in muscle and gallbladder And the species U andersenae was found in three species of fishes: Paramonacanthus japonicus, Gerres limbatus, Otolithes ruber

- In this study, the myxosprea was not found on order of Beloniformes

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, ngành thủy sản đã không ngừng phát triển, sản lượng thủy sản luôn đạt trên 4%/năm, mang lại nhiều sản phẩm, hàng hóa xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Kinh ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 7.836 triệu USD, tăng 16,74% so với năm 2013, bình quân tăng 14,27%/năm kể từ 1995 đến 2014 (Nguyễn Tiến Hưng, 2015) Sự phát triển trên đã góp phần quan trọng vào việc xóa đói giảm nghèo, cải thiện đời sống cho người dân vùng ven biển, an ninh lương thực được đảm bảo

Hải sản là nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghệ thực phẩm Các loài thủy sản được chế biến thành nhiều món ăn và các dạng đồ hộp khác nhau Ngoài ra, thủy sản còn được sử dụng để sản xuất một số loại thuốc chữa bệnh, thức ăn dùng trong chăn nuôi và các các sản phẩm dùng trong ngành công nghiệp khác như các loại keo, các chế phẩm enzyme, các hoạt chất chống oxy hóa (Nguyễn Thị Hoài, 2014) Trong những năm qua, việc sử dụng tràn lan các chất bảo quản, chất kháng sinh, chất tăng trưởng trong chăn nuôi động vật trên cạn đã làm cho xu hướng chuyển dịch cơ cấu sử dụng dinh dưỡng từ thức ăn động vật nuôi trên cạn sang các dạng thức ăn có nguồn gốc hải sản khai thác tự nhiên, đặc biệt là cá biển Do vậy việc phát triển nuôi trồng và khai thác thủy sản đang được quan tâm phát triển phục vụ nhu cầu của thị trường

Quảng Bình là tỉnh thuộc vùng duyên hải miền Trung, đường bờ biển dài

116 km và có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho khai thác thủy sản Theo thống kê của tổng cục thống kê thì năm 2014 sản lượng thủy sản khai thác của tỉnh đạt 53.323 tấn trong đó sản lượng cá biển khai thác đạt 42.400 tấn Trong quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển ngành thủy sản đến năm 2020, Quảng Bình đã phấn đấu tốc độ tăng trưởng về giá trị sản xuất thủy sản bình quân hàng năm đạt 6,0% (trong đó khai thác tăng 4,3%; nuôi trồng tăng 7,3%, dịch vụ tăng 19,1%) Cơ cấu giá trị sản xuất thủy sản đến năm 2020: khai thác chiếm 52,3%; nuôi trồng chiếm 43,0% và dịch vụ chiếm 4,7% Với mục tiêu từng bước đưa ngành Thủy sản tỉnh Quảng Bình phát triển thành một ngành kinh tế mạnh của tỉnh; công nghiệp hóa, hiện đại hóa trên cơ sở hiệu quả, bền vững, hòa nhập với

sự phát triển thủy sản cả nước, góp phần xóa đói giảm nghèo, tăng thu nhập cho người lao động và giữ gìn an ninh Tổ quốc (932/QĐ-UBND)

Song song với sự phát triển của ngành khai thác và nuôi trồng hải sản, vấn

đề bệnh do ký sinh trùng gây ra trên hải sản cần được quan tâm nghiên cứu Đặc biệt là các loài ký sinh trùng thuộc lớp trùng bào tử sợi (Myxosporea) ký sinh trên cá làm ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị kinh tế của cá khai thác Bên cạnh đó một số sản phẩm cá nhiễm trùng bào tử sợi có thể gây ngộ độc thực phẩm (Iwashita et al., 2013) Do vậy, việc nghiên cứu ký sinh trùng myxosporea

ở cá biển có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, cho phép chúng ta biết được đa dạng thành phần loài và tình hình nhiễm ký sinh trùng, từ đó nghiên cứu các biện pháp nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực của ký sinh trùng myxosporea đến ngành khai thác thủy sản Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng thành phần loài myxosporea (Myxozoa) ký sinh trên một số loài cá ở vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Hiểu biết được đa dạng thành phần loài trùng bào tử sợi myxosporea ký sinh trên một số loài cá biển

- Biết được một số đặc điểm khu hệ myxosporea ký sinh trên cá

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ MYXOZOA

2.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu

Myxozoa là một nhóm ký sinh trùng, được đề xuất là phân ngành, thuộc ngành Cnidaria (Canning and Okamura, 2004) ký sinh trên cả cá biển và cá nước ngọt, phân bố rộng trên thế giới (Lom and Dyková, 1992; Kent et al., 2001; Feist and Longshaw, 2006) Myxozoa gồm 2 lớp, Malacosporea và Myxosporea Lớp Malacosporea có số lượng loài ít, trong khi Myxosporea là lớp lớn với khoảng 2.200 loài (Lom and Dyková 2006) Trước đây, myxozoa được xếp vào nhóm động vật đơn bào (Protozoa), mặc dù cấu trúc đa bào và chức năng chuyên môn hóa của các bào tử vượt mức tổ chức của sinh vật đơn bào (Lom and Dyková, 1992)

Myxozoa lần đầu tiên được phát hiện bởi Jrine năm 1825 ở cơ của của cá Hồi Coregounus fera tại hồ Geneva Trong những năm 1840, Müller đã mô tả những đặc điểm đầu tiên về bào tử myxosporea và gọi chúng là các “psorosperms

= túi bào tử” Năm 1880, Bütschli đã tiến hành nhiều nghiên cứu sâu hơn mô tả các giai đoạn hợp bào như nguyên bào tử đa nhân, sự phát triển của bào tử, sự phóng thích của các sợi cực và vai trò của chúng trong quá trình truyền nhiễm Trong những năm 1890, Thélohan xếp các loài myxozoa thành bộ Myxosporidia đồng thời thành lập nhiều giống trong bộ này Tác giả cũng nghiên cứu cách bào

tử thực hiện việc lan truyền, phát triển trong các giai đoạn khác nhau trong vật chủ cá Năm 1919, Kudo xuất bản sách chuyên khảo cung cấp thông tin của tất

cả các loài đã được biết

Những nghiên cứu siêu cấu trúc đã đem lại cái nhìn mới về đặc điểm tế bào học và sinh học chức năng của myxozoa Những tiến bộ của công nghệ chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét đã cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc bào tử, nang cực, các nợi nang cực, sự tạo thoi trùng và sự hình thành nang cực (dẫn theo Okamura et al., 2015) Đặc tính đa bào của các bào tử làm cơ sở để xếp myxozoa vào nhóm động vật đa bào (Štolc, 1899) và đã được khẳng định bằng phân tích phân tử (Smothers et al., 1994; Schlegel et al., 1996) và siêu cấu trúc (Desser et al., 1983) Các bằng chứng này ủng hộ đề xuất của Weill (1938) xếp myxozoa thuộc ngành Cnidaria (Siddall et al.,1995)

2.1.2 Đặc điểm sinh học và vòng đời của myxozoa

Việc xác định con đường lây truyền của myxozoa là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát sự lây lan của chúng Myxozoa là nội ký sinh trùng đặc trưng bởi vòng đời 2 vật chủ, bao gồm động vật không xương sống và động vật có xương sống là vật chủ chính và vật chủ trung gian tương ứng Vật chủ của 2 lớp Malacosporea và Myxosporea khác nhau Malacosporea sử dụng vật chủ chính là động vật không xương sống thuộc ngành Bryozoa, vật chủ trung gian là cá, trong khi Myxosporea sử dụng vật chủ chính là giun đốt ngành Annelida, vật chủ trung gian là cá, lưỡng cư, chim và chuột chù

Tất cả các loài myxozoa đều lây truyền cho vật chủ mới bằng các bào tử

đa bào, bao gồm các tế bào van bên ngoài kèm theo các tế bào chân giả (sporoplasma) và các tế bào có nang cực Tế bào nang cực có cấu trúc nội bào với các sợi có khả năng bám vào bề mặt vật chủ Các nang cực tương đồng với các nang được sử dụng để bắt mồi và bảo vệ myxozoa sống tự do Sau sự bám của các bào tử, các tế bào thứ cấp (sporoplasm) xâm nhập vật chủ để nhiễm cho vật chủ Lớp Malacosporea có bào tử đơn giản và bị phá hủy tương đối nhanh Trái lại, bào tử của lớp Myxosporea được sản sinh trong cơ cá có vỏ dày có thể duy trì lây nhiễm cho giun đốt annelids trong nhiều tháng đến nhiều năm

Các giai đoạn sản sinh bào tử của lớp Malacosporea phát triển như cơ thể giun hoặc các túi đa bào ở động vật không xương sống nước ngọt bryozoa và như một nang giả đơn bào ở cá Các giai đoạn sản sinh bào tử của lớp Myxosporea phát triển thành một nang có thành tế bào bên ngoài ở giun đốt annelids và thành cấu trúc có màng bao quanh đơn giản như nang giả ở cá Ở cả 2 lớp, giai đoạn tiền sinh bào tử có thể tăng sinh như những tế bào đơn trước khi đến vị trí nơi mà giai đoạn sinh sản bào tử phát triển

Nhiều myxozoa là vô hại và ít tác động đến vật chủ cá (Shul'man 1990, Lom and Dyková, 1992) Tuy nhiên, một số myxozoa gây ra bệnh có tác động đối với ngành khai thác và nuôi trồng thủy sản (Pote et al., 2000; Diamant et al., 1994) Myxozoa nhiễm cho hầu như tất cả mô cá và thể hiện một mức độ thích nghi với vật chủ và mô cá Sự nhiễm bệnh ở động vật không xương sống còn ít được biết đến vì chưa được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ngoại trừ những loài liên quan đến các bệnh nghiêm trọng ở các loài cá kinh tế, các tương tác giữa động vật không xương sống

Hình thức lây truyền gián tiếp giữa động vật không xương và có xương sống: Đây là vòng đời chủ yếu của các loài myxospora Trong cơ thể vật chủ động vật có xương sống, các myxospora có thể phát triển thành dạng histozoic (thường ký sinh trong mang, thận, cơ) và dạng coelozoic (ký sinh trong ống mật, túi mật, bàng quang tiết niệu) (Lom and Dyková, 2006) Bào tử phát tán vào môi trường nước thông qua nước tiểu, u nang vỡ hoặc giải phóng sau khi vật chủ chết Các bào tử xâm nhập vào trong vật chủ không xương sống khác và thường

là một số loài giun đốt sống dưới tầng đáy của thủy vực Các động vật không xương sống là vật chủ chính của trùng bào tử sợi (Uspenskaya, 2008; Meaders and Hendrikson, 2009) Hầu hết các chu kỳ sống của myxosporea đã được biết đến đều sống trong môi trường nước ngọt (Kent et al., 2001)

Hình 2.1 Vòng đời của trùng bào tử sợi

Nguồn: Atkinson (2011)

Hình thức lây nhiễm trực tiếp từ cá sang cá: phương thức lây truyền này không cần qua giai đoạn bào tử Các bào tử sinh dưỡng myxosporea có thể nhiễm trực tiếp vào cá (Yasuda et al., 2002) Loài Enteromyxum spp là ví dụ điển hình cho sự lây truyền từ cá sang cá (Redondo et al., 2002) E leei phát triển bên trong ruột cá biển, khi chúng được giải phóng ra ngoài môi trường nước được nuốt vào trong ruột của các loài cá khác (Sitjà-Bobadilla et al., 2007) Hình thức

này chỉ xảy ra trong hệ thống nuôi thâm canh với mật độ cao nơi mà có mật độ lây lan nhanh chóng của ký sinh trùng

Phương thức lan truyền trực tiếp giữa động vật không xương sống với động vật không xương sống: Sự lan truyền này thông qua sự phân mảnh của các vật chủ là bryozoan (Topps et al., 2004) hoặc trong quá trình phân hạch của các myxosporea trong các loài giun nhiều tơ Hình thức lan truyền này cũng không cần qua các vật chủ trung gian là cá mà chúng vẫn có thể phát triển nhanh trong

hệ sinh thái (Morran et al., 2011)

2.2 PHÂN LOẠI MYXOSPOREA

2.2.1 Phân loại hình thái học

Phân ngành Myxozoa gồm 2 lớp Myxosporea và Malacosporea Lớp Myxosporea có các bào tử có các mảnh van cứng và xếp liền kề vào nhau và lây truyền từ giun nhiều tơ sang cá; lớp Malacosporea là các bào tử có mảnh van mềm có vòng đời lây truyền từ Bryozoa sang cá (Kent et al., 2001) Căn cứ vào

số lượng nang cực thì lớp Myxosporea được chia thành hai bộ: Bộ Bivalvulida với các bào tử chứa 1-2 nang cực và bộ Multivalvulida với các bào tử có nhiều hơn 2 nang cực

Phân loại Myxozoa chủ yếu dựa vào hình thái bào tử Trong lớp Myxosporea, hình thái bào tử là tiêu chí chính để phân loại các loài từ các hệ thống đầu tiên được thiết lập (Kudo, 1933; Tripathi, 1948; Shul'man, 1966) Bào

tử là cấu trúc đặc trưng sở hữu nhiều đặc điểm quan trọng để phân loại Các bào

tử gồm mảnh van vỏ nối với nhau kèm một hoặc nhiều bào tử và một hoặc nhiều nang cực (Lom and Dyková, 1992) Số lượng và cấu tạo của van vỏ, số lượng và

sự sắp xếp các nang cực được sử dụng để mô tả đặc điểm của các bộ Các đặc điểm khác như sợi cực, có hay không phần phụ đuôi, hình dạng của các đường nối các van là những đặc điểm quan trọng để phân loại bậc họ và giống Phân loại cấp độ loài Myxosporea dựa trên kích thước bào tử và nang cực cũng như cấu trúc chi tiết của bào tử (Lom and Arthur, 1989), chẳng hạn như số lượng vòng quấn của các sợi nang cực, sự hiện diện của sườn, rìa và vân trên các mảnh van bào tử, có hay không lớp niêm mạc, số lượng bào tử và nhân của chúng

Các đặc điểm khác bao gồm vật chủ, thông tin về môi trường sống của vật chủ, các giai đoạn sinh dưỡng (ví dụ: vị trí nhiễm và hình dạng, kích thước và

cấu trúc của giai đoạn sinh dưỡng), đặc điểm của cả hai giai đoạn bên ngoài và giai đoạn sản sinh bào tử (plasmodia và pseudoplasmodia)

Căn cứ vào hình thái của các dạng bào tử, phân ngành Myxozoa được hệ thống như sau:

Họ Sphaeromyxidae Lom and Noble, 1984 Phân bộ Variisporina Lom and Noble, 1984

Họ Alatosporidae Shulman et al., 1979

Bộ MALACOVALVULIDA Canning,2000

Họ Saccosporidae Canning, Okamura and Curry, 1996

2.2.2 Mối quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa

Phân loại myxozoa truyền thống gặp khó khăn bởi sự giống nhau về cấu trúc bào tử Các đặc điểm như thích nghi vật chủ, thích nghi mô, đặc điểm các giai đoạn phát triển và dữ liệu trình tự DNA có thể kết hợp để định loại chính xác hơn Fiala et al (2015) giới thiệu hệ thống phân loại myxozoa đã được cập nhật Các tác giả đề nghị kết hợp các số liệu hình thái, sinh học và phân tử để mô tả myxozoa ở các cấp bậc phân loại khác nhau và để phát triển phân loại tiến hóa

Các vùng gen mã hóa RNA ribosome tiểu phần nhỏ SSU rDNA tiến hóa nhanh có ích cho việc phân biệt các loài và có thể cung cấp thông tin ở bậc phân loại cao hơn Một vài chỉ thị phân tử khác cung cấp một số thông tin độc lập với SSU rDNA, nhưng thường là ít thông tin hơn và cần có các chỉ thị khác Xem xét mối quan hệ tiến hóa phân tử trong các nhánh chính của myxozoa (dựa trên dữ liệu SSU rDNA) cho phép Fiala et al., (2015) xác định các mẫu cần thiết để cải thiện sự hiểu biết của chúng ta về tiến hóa của myxozoa và đề xuất các trường hợp sát nhập hoặc tách các bậc phân loại

Dựa trên phân tích SSU và trên các đặc điểm hình thái nguyên thủy, Myxozoa chia thành các dòng chính sau: Malacosporea và Myxosporea (chia thành các dòng Myxosporea biển, Myxosporea nước ngọt và Sphaerosporid) (hình 2.2)

Dòng Malacosporea gồm các loài có vòng đời ở vật chủ cá và động vật không xương sống ngành Bryozoa, có hình thái giống giun hoặc cái túi ở động vật không xương sống Toàn bộ dòng này được coi là chị em với myxosporea và được cho là myxozoa nguyên thủy

Dòng Myxosporea biển gồm các loài có vòng đời trong môi trường biển,

sử dụng vật chủ chính là giun nhiều tơ Dòng Myxosporea biển chia thành 7 nhánh (hình 2.2)

Dòng myxosporea nước ngọt bao gồm các loài sử dụng giun ít tơ là vật chủ chính và phát triển chủ yếu ở môi trường nước ngọt Tuy nhiên, có một số ngoại lệ, không tách biệt rõ ràng nước ngọt và nước biển Một số dòng có tổ tiên xâm chiếm môi trường biển hiện nay xuất hiện trong nước ngọt Dòng myxosporea nước ngọt được chia thành 5 nhánh (hình 2.2)

Dòng Sphaerospora chủ yếu là các loài ký sinh ở đường tiết niệu ở lưỡng

cư, cá nước ngọt và cá biển (hình 2.2)

Myxozoa đại diện cho một dòng cnidaria cổ bắt nguồn từ tổ tiên chung trong thời kỳ đầu tiến hóa Gen mã hóa RNA ribosome tiểu phần nhỏ là một gen chung được tìm thấy ở tất cả các sinh vật trên trái đất và đã được sử dụng thành công để phân tích tiến hóa ở bậc phân loại cao hơn ở nhiều loài sinh vật nhân chuẩn Trình tự SSU đầu tiên của myxosporea đã được sử dụng để xác định vị trí của myxozoa trong cây sinh vật nhân chuẩn (Smothers et al., 1994) Kể từ đó, trình tự SSU đã được sử dụng thường xuyên để làm rõ mối quan hệ giữa các loài myxozoa Mặc dù không phải không có hạn chế, chỉ thị này chứng tỏ có thông tin

đủ để ước tính mối quan tiến hóa trong số các loài myxozoa

Ngoài việc là một chỉ thị di truyền chung, SSU rất hữu ích cho nghiên cứu quan hệ tiến hóa của myxozoa vì tính không đồng nhất của nó (các vùng bảo tồn

và thay đổi) tạo điều kiện cho phân loại ở các bậc khác nhau Vùng bảo tồn cho phép thiết kế mồi chung và so sánh các trình tự DNA, trong khi các vùng biến đổi cho biết sự phân hóa Tỷ lệ thay thế cao của trình tự SSU myxosporea, đặc biệt là trong các vùng biến đổi của chúng, chỉ ra sự tiến triển nhanh chóng của gen SSU myxozoa Sự thay đổi trình tự SSU của myxosporea được phản ánh về chiều dài trình tự SSU giữa các loài dòng nước biển và nước ngọt (1.500-1.800

bp so với > 2000 bp) và các vùng biến đổi dài với nhiều nucleotide chèn ở myxosporea, nhánh Sphaerospora là một trong những đại diện có SSUs dài nhất (> 3,7 kb) trong số các loài sinh vật nhân chuẩn Sự khác nhau về chiều dài cũng quan sát thấy ở tiểu phần lớn ribosomal RNA (LSU) giữa các dòng myxosporea LSU được chứng minh là có nhiều thông tin hơn so với SSU Tuy nhiên, với số lượng lớn các trình tự SSU trong cơ sở dữ liệu NCBI vẫn làm cho SSU là chỉ thị được lựa chọn đầu tiên khi phân tích tiến hóa của myxozoa

Sự phổ biến của SSU làm cho chỉ thị này hữu ích để phân tích mối quan

hệ giữa các loài có quan hệ gần Tuy nhiên, SSU thường không đủ để phân biệt

sự khác biệt ở cấp độ trong loài Để khắc phục hạn chế này, vùng chèn (the internal transcribed spacer region 1 (ITS1) đã được sử dụng ITS1 là chỉ thị tiến hóa nhanh hơn so với SSU, bởi vì nó nằm liền kề với SSU, thiết kế mồi để nhân bản trình tự ITS1 không phải là quá khó Xác định ITS1 giữa Myxobolus cerebralis từ Mỹ và Châu Âu tiết lộ sự di nhập gần đây của ký sinh trùng này, tiếp theo là phân tán thông qua tác nhân con người ITS1 cũng là một chỉ thị để phân tích quan hệ tiến hóa của nhiều loài myxozoa ở các vùng địa lý khác nhau, tuy nhiên, đôi khi có thể gặp phải vấn đề để mô tả các chủng khác nhau do sự

biến đổi Ở cấp độ loài, ITS1 đã được nghiên cứu trong quần thể ở các vật chủ khác nhau của Ceratonova shasta Ngoài ra, ITS1 và ITS2 được sử dụng để làm sáng tỏ những loài myxosporea bí ẩn ký sinh trên các loài lưỡng cư

Hình 2.2 Quan hệ tiến hóa phân tử của myxozoa

Nguồn: Fiala et al (2015)

2.3 VAI TRÒ CỦA MYXOSPOREA

Đa số các loài myxosporea là vô hại, một số ít loài gây bệnh nghiêm trọng hoặc tử vong cho vật chủ, làm cho ngành sản xuất thủy sản ảnh hưởng nghiêm trọng về giá trị kinh tế

Tetracapsuloides bryosalmine là một ký sinh trùng thuộc nhóm Malacosporea gây bệnh trên cá Hồi, chúng gây bệnh tăng sinh ở thận Đây là một trong các bệnh ký sinh trùng gây tử vong cao ở các quần thể cá hồi ở khu vực châu Âu và Bắc Mỹ (Hedrick et al., 1993) Myxosporea bao gồm nhiều loài gây bệnh và thường gây ra thiệt hại về kinh tế do làm cá chết, chậm tăng trưởng về trọng lượng, kích thước, hoặc làm giảm chất lượng thịt cá như ở loài Henneguya exilis, Myxobolus cerebralis, ký sinh trên cá biển Một ví dụ điển hình là bệnh đốm trắng trên cá Hồi do M cerebralis đã làm ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh của cá

Mặc dù thực thế cho thấy không có loài myxosporea nào gây bệnh trên người ăn các thịt cá nhiễm các bào tử của loài này, nhưng loài Kudoa septempunctata được xác định là nguyên nhân gây ra hiện tượng ngộ độc thực phẩm ở trên một số người đã sử dụng cá có nhiễm loài này làm thức ăn (Kawai et al., 2012)

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MYXOZOA

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ký sinh trùng myxosporea được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1825 bởi Jurine Kể từ đó các loài thuộc phân ngành này được quan tâm và nghiên cứu Năm 1992, Lom và Diková đã tổng kết có khoảng 2.300 loài đã được mô tả, trong đó có hơn 1.330 loài thuộc lớp Myxosporea (Lom and Diková, 1992) Lom

et al., 2006, đã thống kê được 2.180 loài trong lớp Myxosporea thuộc 62 giống (Lom and Dyková, 2006) Ứng dụng kỹ thuật phân tử đã phát hiện nhiều loài mới, đồng thời tu chỉnh lại hệ thống phân loại của bộ Multivalvulida (Whipps et al., 2004); đổi tên giống Davisia thành giống Myxodavisia (Zhao et al, 2008); chuyển giống Leptotheca Thélohan, 1895 vào giống Ceratomyxa (Gunter and Adlard, 2010); thành lập lại hai họ Coccomyxidae (Heiniger et al., 2011) và Myxobilatidae (Whipps, 2011) Bên cạnh đó 3 giống mới cũng được thành lập là Ellipsomyxa (Køie, 2003), Latyspora (Bartošová et al., 2011) và Sigmomyxa (Karlsbakk and Køie, 2012)

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nghiên cứu về trùng bào tử sợi ký sinh ở cá đầu tiên là của Hà Ký (1968)

đã phát hiện 120 loài ký sinh ở 16 loài cá nước ngọt ở miền Bắc, trong đó có 41

loài mới, 1 họ phụ, 1 giống mới đối với khoa học Năm 1971, tác giả cũng công

bố 9 loài thuộc giống Myxobolus (Eiras et al., 2005) và 3 loài thuộc giống Thelohanellus Kudo, 1933 (Zhang et al., 2013)

Bùi Quang Tề và Hà Ký (2007) đã mổ khám 3.217 cá thể của 41 loài cá nước ngọt ở đồng bằng sông Cửu Long đã thu được 17 loài ký sinh thuộc lớp Myxosporea Các loài myxosporea được phát hiện chủ yếu ký sinh trên da, mang, thận và mật củavật chủ

Vũ Thị Ngọc (2008) đã nghiên cứu bệnh ký sinh trên cá Chẽm nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa - Nha Trang, phát hiện 3 bệnh đó là bệnh do trùng bánh xe, bệnh do Henneguya sp và bệnh do trùng loa kèn

Võ Thế Dũng và cs (2012) đã mô tả 6 loài thuộc giống Ceratomyxa, 1 loài Meglitschia insolita và 1 loài Myxobolus sp ký sinh trên túi mật, bóng khí và thận của cá Chẽm ở Việt Nam

Nguyễn Ngọc Chỉnh và cs (2015) cũng đã mô tả loài Kudoa monodactyli Gunter, 2006 ký sinh trên loài cá Chim khoang Monodactylus argenteus thu tại Quảng Bình

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thu mẫu ngoài thực địa: Vùng biển ven bờ thuộc Thành phố Đồng Hới, tỉnh Quảng Bình

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:

Phòng Ký sinh trùng - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Động vật - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Tháng 10 năm 2016 – tháng 10 năm 2017

3.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Trùng bào tử sợi thuộc lớp Myxosporea ký sinh trên cá biển

3.3.2 Các loài cá nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mổ khám 740 cá thể thuộc 37 họ, 8 bộ

cá biển khác nhau (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Thành phần các loài vật chủ nghiên cứu

Tên vật chủ nghiên cứu (tên khoa học, tên Việt Nam) SLMK

Bộ ANGUILLIFORMES

Họ MURAENESOCIDAE

Họ SYNODONTIDAE

7 Cypselurus naresii Cá Chuồn 17

Bộ PERCIFORMES

Họ CORYPHAENIDAE

Họ CHAETODONTIDAE

34 Pinjalo pinjalo Cá Hồng vây xiên 4

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định tình hình nhiễm myxosporea ở một số loài cá trong khu vực nghiên cứu

- Xác định thành phần loài myxosporea

- Mô tả các loài myxosporea

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Thu mẫu vật chủ ngoài thực địa

Vật chủ cá được mua khi còn sống tại các chợ cá ở cảng biển khu vực nghiên cứu Vật chủ được ghi tên thường gọi, tách riêng từng loài, bảo quản lạnh trong các thùng xốp và chuyển về phòng thí nghiệm Thông tin của vật chủ được ghi lại theo phụ lục 2 Vật chủ được chụp ảnh, ghi kích thước sau đó được định loại bằng cách tham khảo ý kiến chuyên gia về cá tại Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật hoặc so sánh đối chiếu trên trang web: www.fishbase.org và sách Động vật chí phần cá biển

3.5.2 Phương pháp thu thập mẫu ký sinh trùng

Các mẫu cơ cá được cắt thành các lát mỏng và ép trên lam kính Quan sát phát hiện myxosporea dưới kính hiển vi Các mẫu có nhiễm myxosporea được bảo quản trong cồn 70%

Mật được tách riêng từ gan, sau đó chúng được đặt lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi Các mẫu có nhiễm myxosporea được cố định làm tiêu bản

và phần còn lại được bảo quản trong cồn 70%

Các mẫu được đặt lên lam kính có phủ lamen rồi quan sát dưới kính hiển

vi Đối với các mẫu mật thì nhỏ giọt dung dịch mật lên lam kính sau đó phủ lamen rồi quan sát dưới kính hiển vi Đối với các mẫu cơ thì đặt một lát cơ nhỏ lên lam kính, sau đó ép thành một lớp mỏng, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi

3.5.3 Nhuộm Hematoxylin - Eosin

Dung dịch nhuộm Hematoxylin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:

- Hematoxylin crystals (C16H14O6.6H2O) 4 g

- Potassium aluminum sulfate (Kal(SO4)2) 100g

Dung dịch nhuộm Eosin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:

- Eosin Y.Cl 45380 (C20H6Br4Na2O5) 10g

- Glacial acetic acid (CH3COOH) 5ml

Cách pha: Hòa tan Eosin trong nước cất có thể sử dụng máy gia nhiệt để chúng tan hoàn toàn trong nước Sau đó thêm Glacial acetic acid vào

Các bước thực hiện: phiến mô đã được sấy khô đặt vào giá thủy tinh và lần lượt nhúng vào các dung dịch theo bảng 3.2

Bảng 3.2 Quy trình nhuộn Hematoxylin - Eosin

Phương pháp định loại dựa theo khóa phân loại của Lom and Diková (1992) và theo khóa định loại của Fiala et al (2015a)

Kích thước myxosporea được đo theo phương pháp của Lom and Diková (1992) (hình 3.1)

Hình 3.1 Các số đo cần thiết để định loại ký sinh trùng myxosporea

Nguồn: Lom and Diková (1992)

A và B: Myxobolus ở phía trước và ở phía bên; C và D: Henneguya ở phía trước và phía bên; E

và F: Myxidium ở phía trước và phía bên; G và H: Chloromyxum ở mặt bên hoặc từ phía đường nối (G) và phía trước (H); I: Kudoa từ phía đỉnh; J: Kudoa ở một trong những điểm phụ có thể là một đường chéo L: chiều dài của các bào tử, W: độ rộng của các bào tử, T: độ dày của các bào tử; AL: chiều dài của phụ

đuôi, TL: tổng chiều dài của bào tử

3.5.5 Phương pháp phân tích DNA

3.5.5.1 Phương pháp tách chiết DNA

Mẫu myxosporea được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tisue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất:

1 Cho 200mg mẫu có chứa các bào tử myxosporea vào trong ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL

2 Cho thêm 180 µl buffer ATL, 20 µl Proteinase K vào ống có chứa mẫu mô tách chiết ở bước 1 và đậy nắp Trộn đều bằng Vortex trong 15 giây

3 Ủ mẫu ở 56ºC trong 3 tiếng hoặc qua đêm

4 Lấy mẫu ra khỏi máy ủ, vortex nhẹ; thêm 200 µl buffer Al và vortex

5 Ủ mẫu ở 70ºC trong 10 phút

6 Thêm 200 µl cồn tuyệt đối và chuyển toàn bộ dung dụng này lên cột spin

7 Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ chạy qua

8 Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua

9 Thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm ở 13000 rpm trong 3 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua

10 Đặt cột spin lên ống ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL, thêm 200 µl đệm AE Để trong 1 phút và ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút Dung dịch thu được có chứa DNA tổng số

3.5.5.2 Phương pháp PCR

Nhân bản trình tự DNA của đoạn SSU rDNA (Small subunit ribosomal DNA - 18S) của các mẫu myxosporea bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi 18e (5’-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3’)-Kud6R (5’-TCCAGTAGCTACTCATCG-3’) và Kud6F (5’-TCACTATCGGAATGAACG-3’) - 18g (5´-GGTAGTAGCGACGGGCGGCGTG-3´) (Hillis and Dixon, 1991; Whipps et al., 2003) Thành phần phản ứng PCR gồm: H2O = 37,5 µl, Buffer = 5 µl, dNTP

= 2 µl, Primer xuôi và ngược = 2 µl , Template = 1,5 µl, Enzyme = 2 µl Chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: giai đoạn khởi đầu 95oC biến tính trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu trình nhiệt 95oC/30 giây, 51oC/40 giây, 72oC/1 phút, giai đoạn cuối kéo dài 72oC trong 3 phút

Chuẩn bị gel: cân thạch agarose hòa vào dung dịch TAE 1x Đun trong lò

vi sóng đến lúc agarose tan hoàn toàn Để nguội đến 60oC, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã được cài sẵn lược Sau khoảng 30 - 45 phút, khi gel đã đông cứng, tháo bỏ lược ra khỏi gel và đặt bản gel vào trong bể điện di có chứa dung dịch TAE 1X sao cho bản gel ngập trong dung dịch

Tra mẫu: trộn sản phẩm PCR với loading buffer 6x theo tỷ lệ 4:1 rồi tra vào giếng điện di

Điện di: điện thế dùng điện di thường từ 100 - 120V DNA chuyển từ cực

âm sang cực dương Quan sát sự di chuyển màu của loading buffer để lựa chọn thời gian điện di cho phù hợp để tránh cho mẫu DNA bị chạy ra ngoài

Nhuộm gel: bản gen chạy xong được nhuộm trong ethidium bromide 0,5µg/ml trong 15 phút có lắc nhẹ Sau đó chúng sẽ được rửa dưới vòi nước chảy Soi gel trên đèn UV để đánh giá sản phẩm PCR và chụp ảnh bằng máy ảnh Canon 750D

3.5.5.3 Phương pháp phân tích số liệu

Sản phẩm PCR rõ băng vạch được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc) Dùng chương trình BLAST để so sánh mức độ tương đồng của trình tự thu được với các trình tự trên Genbank Phân tích mối quan hệ tiến hóa phân tử của các trình tự thu được với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng phần mềm MEGA 6 theo phương pháp Neighbor Joining (Tamura et al., 2013)

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thành phần loài myxosporea ký sinh được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:

Ngành CNIDARIA Hatschek, 1888

Phân ngành MYXOZOA Grassé, 1970

Lớp MYXOSPOREA Bütschli, 1881

Bộ BIVALVULIDA Shulman, 1959

Họ SPHAEROMYXIDAE Lom and Noble, 1984

Giống Sphaeromyxa Thélohan, 1892

Giống Auerbachia Meglitsch, 1968

Giống Unicapsula Davis, 1924

10 Unicapsula andersenae Miller and Adlard, 2013

Họ KUDOIDAE Meglitsch, 1960

Giống Kudoa Meglitsch, 1947

11 Kudoa monodactyli Gunter, Cribb, Whipps and Adlard, 2006

12 Kudoa scomberomori Adlard, Bryant, Whipps and Kent, 2005

13 Kudoa megacapsula Yokoyama and Itoh, 2005

14 Kudoa kenti Burger and Adlard, 2009

4.1.2 Mô tả các loài myxosporea ký sinh trên cá biển vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình

Ngành CNIDARIA Hatschek, 1888

Phân ngành MYXOZOA Grassé, 1970

Lớp MYXOSPOREA Bütschli, 1881

Bộ BIVALVULIDA Shulman, 1959

Họ SPHAEROMYXIDAE Lom and Noble, 1984

Giống Sphaeromyxa Thélohan, 1892

4.1.2.1 Loài Sphaeromyxa n.sp.1

Vật chủ: Cá Bò Paramonacanthus japonicus

Nơi ký sinh: Túi mật

Nơi phát hiện: Quảng Bình, Việt Nam

Tỷ lệ nhiễm: 6/15

Mô tả:

Plasmodia: Các bào tử trôi nổi tự do trong mật Bào tử trưởng thành có thể

dễ dàng được quan sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 40x Bào tử chưa trưởng

thành thường đi sóng đôi với nhau và được bao bọc bởi màng mỏng Chúng thường bám vào nhau tạo thành một khối lớn chiếm một phần đáng kể trong túi mật của vật chủ

Bào tử: Bào tử trưởng thành có hình thoi, dạng thẳng, hai đầu của bào

tử thẳng, phía bên của bào tử cong Bào tử có các đường vân chạy dọc và song song với bào tử Bên trong bào tử có 2 nang cực to nằm ở hai đầu đối diện của bào tử Nang cực có hình bầu dục và có kích thước bằng nhau Bên trong mỗi nang cực có chứa sợi nang cực ngắn, cuộn gấp lại trong nang cực khoảng 2 đến 3 nếp gấp Chất nguyên sinh nằm tập trung ở giữa khoang bào tử giữa hai nang cực (hình 4.1)

Kích thước của bào tử và nang cực được xác định dựa trên kích thước của

25 bào tử khác nhau Bào tử dài 14,8 ± 0,4 (14,3 - 15,5) µm, rộng 4,4 ± 0,2 (4,2 - 4,7) µm, nang cực dài 4,3 ± 0,2 (3,9 - 4,7) µm, rộng 2,7 ± 0,1 (2,4 - 3) µm So sánh với các loài khác thuộc giống Sphaeromyxa, mẫu chúng tôi thu được có đặc điểm hình thái gần với loài S zaharoni thu từ cá Pterois miles ở Israel (bảng 4.1)

Hình 4.1 Loài Sphaeromyxa n.sp.1

A: Bào tử vẽ bằng phần mềm Illustration CS2; B: Bào tử tươi chụp dưới kính hiển vi

Bảng 4.1 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa (Đơn vị đo: µm)

tử

Chiều rộng bào tử

Độ dày bào tử

Chiều dài nang cực

Chiều rộng nang cực

quan nhiễm

Nơi phát hiện

(4,65-5,98)

Đại Tây Dương

(13,7–15,1)

4,8 (4,2–5,5)

4,8 (3,3–5,6)

3,4 (2,5–4,0)

4.1.2.2 Loài Sphaeromyxa n.sp.2

Vật chủ: Cá Chai Platycephalus indicus

Nơi ký sinh: Túi mật

Nơi phát hiện: Quảng Bình, Việt Nam

Tỷ lệ nhiễm: 2/3

Mô tả:

Plasmodia: Các bào tử và plasmodia trôi nổi tự do trong mật Với số lượng lớn, chúng làm dung dịch mật trở nên mờ đục Các bào tử trưởng thành có kích thước lớn và hình dạng đặc trưng của giống Sphaeromyxa (phụ lục 1) Các plasmodia có cấu trúc bao gồm các bào tử chưa trưởng thành liên kết với nhau bởi các màng bao bọc chúng tạo thành các đám plasmodia có kích thước lớn trôi

lơ lửng trong dung dịch mật Các bào tử trưởng thành nằm riêng rẽ và phân bố tự

cực ngắn, cuộn gấp lại một cách lỏng lẻo bên trong nang cực Chất nguyên sinh nằm tập chung ở giữa khoang bào tử giữa hai nang cực (hình 4.2)

Kích thước của bào tử và nang cực được đo trên 40 bào tử khác nhau Bào

tử dài 20,7 ± 0,8 (19,4 - 22,1) µm, rộng 5,4 ± 0,3 (4,6 - 5,7) µm, độ dày 5,2 ± 0,3 (4,6 - 5,5) µm Nang cực dài 7,5 ± 0,6 (6,5 - 9) µm, rộng 2,9 ± 0,2 (2,4 - 3,2) µm

So sánh với các loài khác thuộc giống Sphaeromyxa, mẫu chúng tôi thu được có đặc điểm hình thái gần với loài S tuanfengensis thu từ cá Coilia nasus ở Trung Quốc (bảng 4.2)

Phân tích phân tử 2 loài thuộc giống Sphaeromyxa:

Chiều dài đoạn gen 18S của loài Sphaeromyxa n.sp1 và Sphaeromyxa n.sp2 lần lượt là 1956 bp và 1967 bp Kết quả Blast cho thấy trình tự của loài Sphaeromyxa n.sp1 tương đồng cao nhất (99%) với trình tự DQ377701 của loài Sphaeromyxa hellandi ký sinh trên loài cá Molva molva; trình tự của loài Sphaeromyxa n.sp2 tương đồng cao nhất (99%) với trình tự KF135225 của loài Sphaeromyxa balbianii ký sinh trên cá Gaidropsarus vulgaris

So sánh khoảng cách di truyền của loài Sphaeromyxa n.sp1 với trình tự của một số loài trong cùng giống cho thấy chúng có sai khác rất lớn, sai khác ở

138 vị trí nucleotide tương đương 7,1% với trình tự của loài Sphaeromyxa sp (KM201336), sai khác 163 vị trí nucleotide tương đương 8,2% với loàiSphaeromyxa lycodi (KC524734), sai khác 178 vị trí nucleotide tương đương 9,3% với trình tự của loài Sphaeromyxa kenti (JX443489) Tương tự như vậy, trình tự của loài Sphaeromyxa n.sp2 sai khác 110 vị trí nucleotide tương đương 5,8% với loài Sphaeromyxa zaharoni (AY538662), sai khác 132 vị trí nucleotide tương đương 7,8% với loài Sphaeromyxa longa (KM201344), sai khác 111 vị trí nucleotide tương đương với loài Sphaeromyxa artedielli (KF135220) và sai khác

207 vị trí nucleotide tương đương với 10,8% với trình tự của loài Sphaeromyxa kenti (JX443489) Khoảng cách di truyền giữa 2 loài Sphaeromyxa n.sp1 và Sphaeromyxa n.sp2 là 11% (bảng 4.3)

Phân tích phân tử cho thấy Sphaeromyxa n.sp1 và Sphaeromyxa n.sp2 có quan hệ gần với 2 loài Sphaeromyxa hellandi và Sphaeromyxa balbianii (bảng 4.3, hình 4.3).Tuy nhiên, chúng lại rất khác nhau về hình thái, vật chủ và phân

bố Vì vậy, chúng tôi xác định đây là hai dạng mới cho khoa học

Bảng 4.2 Bảng so sánh kích thước của một số loài trong giống Sphaeromyxa (Đơn vị đo: µm)

tử

Chiều rộng bào tử

Độ dày bào tử

Chiều dài nang cực

Chiều rộng nang cực

nhiễm

Nơi phát hiện

5,6 (4,0–6,4)

1,6 (1,6–1,8)

Terapon jarbua

(19,6–25,3)

5,7 (4,6–6,9)

5,7 (4,5–6,2)

8,32 (5,8–9,8)

3,3 (2,5–4,5)

Lycodes reticulatus

(20,5–23,7)

6,6 (6,3–7,9)

7,6 (6,8–7,9)

3,2 (3,1–3,3)

5 (4,8–5,2)

5,9 (5–6,5)

2,6 (2,5–2,7)

Heteroclinus whiteleggii

8,0 (6,9–8,84)

3,6 (3,0–3,9)

5,4 ± 0,3 (4,6 - 5,7)

5,2 ± 0,3 (4,6 - 5,5)

7,5 ± 0,6 (6,5 - 9)

2,9 ± 0,2 (2,4 - 3,2)

Platycephalus indicus

Bình, Việt Nam

Hình 4.3 Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của

một số loài thuộc giống Sphaeromyxa

Bảng 4.3 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong giống Sphaeromyxa

(dựa trên phân tích trình tự gen 18S)

10 Sphaeromyxa artedielli KF135220; 11 Ceratomyxa sp KU726594

Sphaeromyxa balbianii KF135225 Sphaeromyxa n.sp2 QB-VN Sphaeromyxa zaharoni AY538662 Sphaeromyxa longa KM201344 Sphaeromyxa artedielli KF135220 Sphaeromyxa kenti JX443489

Sphaeromyxa lycodi KC524734 Sphaeromyxa sp KM201336 Sphaeromyxa hellandi DQ377701 Sphaeromyxa n.sp1 QB-VN

Ceratomyxa sp KU726594 100

100

99 95

50

94 80 100

0.05

Họ MYXIDIIDAE Thélohan, 1892

Giống Myxidium Buetschli, 1882

4.1.2.3 Loài Myxidium n.sp

Vật chủ: Cá Dưa xám Muraenesox cinereus

Nơi ký sinh: Túi mật

Nơi phát hiện: Quảng Bình, Việt Nam

Tỷ lệ nhiễm: 10/15

Mô tả:

Plasmodia có kích thước nhỏ từ 3 - 13 µm Chúng nằm trong dung dịch mật và phân bố khắp túi mật Bào tử không làm cho dịch mật bị đục, tuy nhiên sự xuất hiện nhiều các plasmodia làm cho dịch mật trở nên vàng hơn

Bào tử trưởng thành có hình bầu dục và nhọn ở 2 đầu Bề mặt của bào tử

có các đường chạy dọc Mỗi bào tử chứa 2 nang cực hình tròn và có kích thước bằng nhau Phần nhọn của nang cực có xu hướng bám về 2 đầu nhọn của bào tử Bên trong mỗi nang cực có các sợi nang cực Quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000x, các sợi nang cực cuộn lại thành 4 đến 5 vòng dọc theo trục của nang cực (hình 4.4)

Hình 4.4 Loài Myxidium n.sp

A: Bào tử vẽ bằng phần mềm Illustration CS2; B: Bào tử tươi chụp dưới kính hiển vi