Kỹ thuật tách chiết nucleic acid

Các bước cơ bản và phương pháp tách chiết nucleic acid. Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNA So sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNA So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật và vi khuẩ

Môn: SINH HỌC PHÂN TỬ

Đề tài: Kỹ Thuật Tách Chiết

LỚP : ĐHSH07LT

NHÓM : 10

GVHD : Trần Hồng Bảo Quyên

Các bước cơ bản và phương pháp tách chiết nucleic acid.

 Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNA

So sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNA

So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật

và vi khuẩn.

Các bước cơ bản – phương pháp tách

chiết ACID NUCLEIC.

Các bước tách chiết DNA.

Phương pháp tách chiết DNA cơ bản gồm 3 bước

BƯỚC 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:

− Nghiền tế bào và mô trong hỗn hợp tẩy : SDS, protease thủy phân protein, enzym lysozym, EDTA, Hỗn hợp này

sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA ra môi trường đồng thời protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy.

Phá vỡ màng tế bào và màng nhân

Phá vỡ màng tế bào và màng nhân

BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không không phải DNA,

chủ yếu là protein

 Gây tủa protein bằng dd chloroform: phenol và

enzym protein K Sau khi ly tâm ống nghiệm gồm 3 lớp dd: lớp phenol nằm dưới đáy ống nghiệm, giữa là protein, trên cùng là dịch lỏng chứa DNA

Các bước tách chiết DNA.

Các tách chiết DNA.

BƯỚC 3: Làm kết tủa acid nucleic 2 cách thông dụng:

− Dùng ethanol nồng độ cao (ethanol: mẫu là 2,5: 1) và ở nhiệt độ thấp, trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao).

− Dùng isopropanol (isopropanol:mẫu là 1:1), không cần sự hiện diện của muối các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, loại bỏ khỏi dịch chiết bằng cách này

Các bước tách chiết DNA.

 Tủa thu nhận bằng 2 cách trên được thu nhận bằng ly

tâm Sau đó, rửa kết tủa vài lần trong ethanol 70%

để loại bỏ các muối hoặc các vết isopropanol còn

dính trong mẫu, sau đó xử lý bằng RNase để loại bỏ RNA Thu được DNA

 Làm khô và hòa tan trong dd TE hoặc nước khử ion

để tiếp tục nghiên cứu

Sơ đồ tách chiết DNA tổng số

Hình ảnh minh họa sợi DNA trong ống nghiệm

Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.

 Các RNA đều là phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các RNase, RNase có ở khắp nơi.

 Chính vì vậy, phải có nhiều biện pháp để tránh các tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng; mọi dụng cụ, hóa

chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay được xử lý

với DEPC hầu tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng

tay trần.

Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.

Ly trích RNA toàn phần cũng gồm 3 bước như trích ly DNA:

Bước 1 : Nghiền tế bào mô trong dung dịch có một một chất tẩy mạnh (SDS) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính

protein mạnh (guamidium thiocyanate), một chất khử (2-

mercaptoethanol) Các chất có tác dụng ức chế hoạt động các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA.

.

Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.

Bước 2: Loại protein bằng xử lý phenol: chloroform và

ly tâm, RNA sẽ hòa tan trong pha nước.

Bước 3: Tủa RNA: làm tủa RNA bằng ethanol hoặc

isopropanol rồi ly tâm Dưới dạng kết tủa trong

ethanol hoặc đông lạnh ở -70 0 C trong nước có chứa chất ức chế Rnase là R-nasine và cuối cùng là bước tách RNA khỏi DNA bằng enzym Dnase Thu được RNA toàn phần

Các bước tách chiết mRNA.

 RNA tế bào gồm: rRNA (80-85%),

tRNA(15-20%), snRNA (<1%) mRNA chiếm khoảng 1- 5%

 mRNA có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA

- Ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa đặc tính liên kết bổ sung A - T của nucleic acid, sử dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT - cellulose

Các bước tách chiết mRNA.

Tuy nhiên, mRNA đối với eukaryote có điểm

chung là cấu trúc đuôi polyA Dựa vào cấu trúc này và đặc tính bổ sung A – T của nucleic acid,

ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên cột oligodT-cellulose

Thu hồi mRNA bằng sắc ký ái lực

Các bước tách chiết mRNA.

Hiện nay trên thị trường có những bộ kit sử dụng các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ

thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên

bi này được thu nhận lại qua ly tâm và mRNA sẽ được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại Kĩ

thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ

Các bước tách chiết mRNA.

Các bước tách chiết mRNA.

Kỹ thuật siêu ly tâm

Phương Pháp ly tâm đẳng tỷ trọng

Phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng

Phương pháp ly tâm

 Ly tâm phân đoạn

 Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi

những lượng rất nhỏ DNA

Sắc ký lỏng cao áp Phương pháp có độ phân giải cao này được dùng trong tinh sạch các

oligonucleotide tổng hợp (độ phân giải một

Phương pháp sắc ký

Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay trên oligodT-cellulose, dùng để tinh sạch mRNA

Sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatography) là kỹ thuật mới có độ phân giải cao dùng trong tinh sạch các oligonucleotide có độ phân gỉai 1 nucleotide, plasmid hay các đoạn DNA

So sánh tách chiết DNA, RNA và mRNA

Sự giống nhau:

So sánh tách chiết DNA, RNA và mRNA

2 Loại protein Phenol pH8

Chloroform:IAA Khác

Phenol pH4 : Chloroform:IAA Khác Phenol pH4

3 Thu hồi nucleic acid:

Ethanol tuyệt đối Isopropanol,

Hấp phụ trên silica Thu trên màng lọc

So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật và vi khuẩn

Giống nhau

Hầu hết tách chiết ở các loại tế bào động vật,

thực vật, vsv đều theo nguyên lý cơ bản là gồm

3 bước: phá vỡ màng tế bào, làm biến tính các

loại ngoài DNA (protein, RNA, ) để thu dịch có chứa DNA, kết tủa và thu nhận DNA

So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật và vi khuẩn

Trước khi tách chiết phải nghiền, thêm vào tác dụng của hóa chất để phá hủy thành tế bào

cellulose  

Trước khi tách chiết phải nghiền sơ,thêm vào tác dụng của hóa chất để phá hủy màng

tế bào

Chỉ cần dùng hóa chất

để phá vỡ màng tế bào Phải thêm công đoạn ly tâm ở đầu quá trình để thu nhận được tế bào vsv.

Thường cho thêm

Proteinase K để bất

hoạt DNase và RNase

Thường cho thêm

Proteinase K để bất

hoạt DNase và RNase

Tế bào vsv không cần cho thêm chất bất hoạt DNase và RNase

ở tế bào động vật rất giàu protein nên

thường cho thêm