KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA

Nguồn thông tin di truyền đó được ổn định nhờ hoat động tự sao chép của DNA theo nguyên tắc “bán bảo tồn”. Thông qua hoạt động của các bộ máy tế bào , nguồn thông tin này được chuyển :

KỸ THUẬT

TÁCH CHIẾT

DNA

đơn phân là nucleotid

P1: Giới thiệu về kỹ thuật, nguyên tắc tiến hành

Nguồn thông tin di truyền đó được ổn định nhờ hoat động tự sao chép của DNA theo nguyên tắc “bán bảo tồn”.

 Thông qua hoạt động của các bộ máy tế bào , nguồn thông tin này được chuyển :

DNA mRNA Protein

Trong cơ thể , tất cả các tế bào

có nhân đều chứa phân tử

DNA Phân tử này này mang

toàn bộ thông tin di truyền của

cá thể

Sinh học phân tử đã phát triển các kĩ thuật di truyền trên DNA vào nghiên cứu và chẩn đoán một số bệnh Để thực hiện kĩ

thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu DNA đảm bảo cả

về chất và lượng

Tách chiết DNA là khâu đầu tiên , cơ bản và rất quan trọng trong các qui trình

thao tác DNA.

MỤC ĐÍCH

Tìm ra một số kĩ thuật phù hợp nhất với các tiêu chuẩn về: chất lượng DNA , hàm lượng DNA, thời gian tiến hành, chi phí thực hiện và mức độ độc hại đói với người

thực hiện.

2 Nguyên lý của kĩ thuật tách chiết

DNA

Tách chiết DNA là kĩ thuật cơ bản trong hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di truyền và sinh học nói chung.

 Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo được số lượng và chất lượng để đáp ứng được các phân thức sau đó.

Hiện nay trên thị trường có sẵn rất nhiều

bộ kít tách chiết DNA

khá tiện dụng:

- Việc nắm rõ nguyên lí tách chiết DNA là khá qua trọng để giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cách thưc hoạt động của bộ kit, giải quyết vấn đề khi có việc xảy ra.

- Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết DNA được đưa ra và báo cáo thành công bởi các nhà nghiên cứu Đới với mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết sẽ có thể khác nhau

Nguyên lí tách chiết DNA từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:

• Bước 1: phá vỡ nguyên liệu ban đầu( tề bào, mô) để mở tế bào và giải phóng acid

nucleic ( DNA và RNA ) ( nghiền trong nito lỏng và hòa trong đêm chiết)

• Bước 2: bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme ADNase và làm biến tính

các phân tử protein, dịch hữu cơ,

• Bước 3: tách DNA khỏi các tạp chất khác bằng máy ly tâm.

• Bước 4: kết tủa, rửa và hòa tan DNA (rửa bằng dung dịch cồn, hòa tan trong TE hoặc nước cất).

 Nguyên liệu tách chiết DNA:

những tế bào có nhân ( tế bào ở dạng tươi sống hoặc đã chết )

 Phá vỡ màng tế bào bằng biện pháp cơ học hoặc hóa học.

 DNA tách ra thường bị gãy có chiều dài khoảng 20Kb đến

200Kb.

 Do DNA gãy nhiều chỗ nên vẫn còn đại diện đầy đủ gen của bộ gen Tuy thế nếu DNA bị gãy

nhiều quá, quá ngắn có thể, hạn chế kết quả nghiên cứu tiếp

theo.

1 Dụng cụ và hóa chất

Phần 2: Các bước tiến hành

Máy ủ nhiệt Tủ hút khí độc

-70℃)

Máy đo

Máy li tâm

Nguyên tắc:

- Các phân tử khác nhau sẽ lắng với vận tốc khác nhau khi chịu lực tác động của lực ly

tâm.

- Tùy thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của

các phân tử vật chất mà người ta chia hai loại li tâm:

 Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách các

phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối

lượng của chúng.

 Ly tâm đắng tỉ trọng: dùng phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỉ trọng của

chúng.

Các hóa chất thường dùng:

2.TRIS: để điều

chỉnh độ pH

3 CTAB: là hóa chất dùng trong chiết suất acid nucleic có hiệu quả cao và được sử dụng phổ biến.

Ethanol và Isopropanol

+ Ethanol: thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion , hay

nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy acid nuleid dễ dàng bị kết tủa , sự kết tủa của acid nucleid sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu được xử lí trong môi

trường lạnh.

+ Isopropanol: được dùng để kết tủa acid nucleid trong môi trường không

cần có muối , tỉ lệ lượng isopropanol mãu theo thể tích là 1:1

Nước cất và TE:Acid nucleic:

+ có thể hòa tan trong nước cất khử trung hoặc dung dịch TE Acid Nucleic

sẽ được bảo quản tốt hơn , nếu nó được hòa tan trong dung dịch TE,vì dung dịch này chứa Tris và EDTA.

2/ Các phương pháp tách chiết

2.1/ Quy trình tách chiết DNA bằng máu ngoại vi

- Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống đã có sẵn EDTA 0,4M, trộn đều để máu không đông Mẫu máu được bảo quản ở 4℃ cho tới lúc tiến hành kỹ thuật.-Cho 5ml dúng dịch đệm phá hồng cầu vào ống máu trộn nhiều lần, ly

tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút Bỏ dịch nỗi, giữ lại cặn tủa tế bào

màu trắng Mục đích chủ yếu là để phá hủy hồng cầu, tách riêng bạch

cầu Có thể làm nhiều lần cho đến khi cặn tế bào có màu trắng sạch

-Làm tan cặn tủa bằng cách dùng máy lắc

-Cho tiếp vào ống chứa cặn tủa tế bào 900 µl đệm phá bạch cầu, phá vỡ

tế bào bằng máy lắc trong 5 phút Sản phẩm có thể dùng tách chiết tiếp DNA hoặc bảo quản ở 4℃ trong vài tuần

-Cho thêm vào ống 0,1mg proteinase K lắc đề bằng máy lắc trong 5 phút

- Ủ 50 µl trong 2 giờ, 15 phút lắc một lần

- Cho thêm 300 µl NaCl bão hòa 6M, lắc đều bằng máy lắc trong 5-10

phút

- Nghiên ống nhẹ nhàng cho đến khi xuất hiện tủa DNA.

- Chuyển tủa sang ống Eppendorf đã có sẵn 200 µl TE, lắc

nhẹ.

- Để sản phẩm ở 37℃ trong 2-3 giờ cho đến khi tủa DNA tan hoàn toàn.

- Kiểm tra chất lượng DNA bằng cách chạy điện di.

- Bảo quản DNA ở nhiệt độ 4℃, -20℃ hoặc -80℃ tùy thời

gian cần giữ DNA ngắn hay dài.

2.2/ Quy trình tách chiết truyền thống

Nguyên lý tách chiết DNA

Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân.

Nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường

đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

- Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng

- Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn

Bước 2: Loại protein

Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của

tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào Để thực hiện bước này người

ta chủ yếu sử dụng hỗn hợp Phenol/ Chloroform Phenol-Cloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein Do đó, protein

sẽ bị tủa khi gặp Phenol Trong khi đó DNA thì không bị tủa bởi phenol

nên vẫn tan trong nước Khi ly tâm phenol/chloroform nặng sẽ lắng xuống dưới, protein tủa sẽ nằm tại ranh giới của nước và phenol, còn DNA thì

nằm lại trong pha nước ở phía trên Thu pha nước chứa DNA này để thực hiện các bước tiếp theo

Bước 3: Tủa nucleic acid.

Sau bước tủa protein, DNA thu được nằm trong dung dịch với dung môi là nước Sử dụng ethanol hoặc isopropanol

để tủa DNA trong dung dịch Sau đó ly tâm để thu cặn

DNA Cặn DNA này có thể rửa trong ethnol 70 % một hoặc hai lần đểlàm sạch mẫu Tiếp theo để cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cận DNA thu được trong đệm.

• Mẫu được điện ly trong gel agarose(0,8%).

• Sau đó nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide và

soi qua ta cực tím để phát hiện các băng DNA

• Mẫu được xem là có độ nguyên vẹn cao khi các băng DNA gọn, tập trung và rõ nét

• Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA cũng xác định được DNA còn lẫn RNA hay không

PHẦN 3: ỨNG

DỤNG TRONG Y HỌC

• Hoàn chỉnh kỹ thuật

chiết tách DNA từ tế bào ối và ứng dụng trong chẩn đoán

trước sinh.

*Nghiên cứu tiến hành chiết tách DNA từ 3 loại dịch ối: dịch ối

nguyên không nuôi cấy ( tế bào ối nguyên),dịch ối gồm các tế

bào ối và thành phần tế bào bong trong quá trình nuôi cấy ( tế bào ối bong), dịch ối gồm các tế bào ối nuôi cấy( tế bào ối bám)

Sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen FMR1

*Đã chiết tách được DNA từ các loại tế bào ối nguyên, tế bào ối bong, tế bào ối bám DNA sạch và nguyên nhiều khi được chiết tách ở tất cả các loại tế bào ối Để tiết kiệm tế bào ối hay dich ối, chỉ cần chiết tách DNA từ tế bào ối và thành phần của tế bào ối bong trong quá trình nuôi cấy Ứng dụng thành công trong việc nhân gen FMR1 đối với DNA của thai nhi chiết tách từ tế bào ối

Gen FMR1 là gì?

• FMR1 là một gen rất quan trọng, khi xảy ra một khiếm khuyết trong gen FMR1, hiện diện trên NST X là nguên nhân gây ra hội chứng Fragile X Có hai loại NST giới tính là X và Y Khiếm khuyết của gen FMR1 được biết đến là thiểu năng trí tuệ fragile X1

protein gây cản trở gen sản xuất protein đúng cách Protein này đóng một vai trò quan trọng chức năng hệ thần kinh.

• Chẩn đoán hội chứng fragile X bằng việc xét nghiệm có thể thực hiện ở trẻ có biểu hiện chậm phát triển hoặc có triệu chứng khác của hội chứng này như vòng đầu lớn hoặc một số khác biệt ở

mặt Kiểm tra ADN \FMR1 là một xét nghiệm máu được thực hiện

để chẩn đoán Xét nghiệm này nhằm tìm kiếm sự thay đổi của gen FMR1 liên quan đến hội chứng fragile X.

=> Tách chiết DNA là khâu đầu tiên cơ bản quan trọng để thực hiện các phương pháp tiếp theo nhằm chuẩn đoán

bệnh và phát hiện bệnh một cách sớm nhất có thể

THANKS

FOR LISTENING