Tổng quan về phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc ngoài da dựa trên kỹ thuật tách micro

LƯƠNG THỊ THU HẰNG TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA DỰA TRÊN KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2

LƯƠNG THỊ THU HẰNG

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA DỰA TRÊN

KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

LƯƠNG THỊ THU HẰNG

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA DỰA TRÊN

1 Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

2 Bộ môn Dược lâm sàng Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập dưới mái trường này

Cuối cùng, tôi xin gửi những tình cảm thân thương nhất tới gia đình, bạn bè, tập thể lớp A7K64 và N1K64 đã luôn ở bên quan tâm, chia sẻ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lương Thị Thu Hằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VAI TRÒ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC 3

1.1 KHÁI NIỆM SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 3

1.2 VAI TRÕ CỦA SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC TRONG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG THUỐC TRÊN THỊ TRƯỜNG 5

1.3 THỬ NGHIỆM TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 6

1.4 MỘT SỐ QUY ĐỊNH TẠI CÁC QUỐC GIA VỀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 7

Chương 2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO TRÊN DA VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT 14

2.1 TÓM TẮT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO 14

2.2 NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO 16

2.2.1 Nguyên lý 16

2.2.2 Kim thăm dò 18

2.2.3 Dịch truyền vào 21

2.2.4 Định lượng các phân tử thuốc 22

2.2.4.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22

2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 25

2.2.5 Hiệu chỉnh kết quả thu được 25

2.2.5.1 Phương pháp No- net - flux (NNF) 27

2.3 QUY TRÌNH CHUNG CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO TRONG

NGHIÊN CỨU Y DƯỢC HỌC 30

2.4 ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO 30

2.4.1 Ưu điểm 30

2.4.2 Nhược điểm 31

Chương 3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA 33

3.1 SỰ CẦN THIẾT PHẢI ĐO NỒNG ĐỘ THUỐC TỰ DO TẠI DỊCH KẼ MÔ DA 33

3.2 TRIỂN KHAI ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA VỚI KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO 34

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

3.2.2 Các thuốc được sử dụng trong nghiên cứu 35

3.2.3 Thiết kế nghiên cứu 37

3.2.4 Chuẩn bị kim thăm dò 38

3.2.5 Cấy kim thăm dò trên da 39

3.2.6 Định lượng bằng phương pháp thích hợp 40

3.2.7 Thống kê, tính toán và báo cáo kết quả thu được 41

3.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC NGOÀI DA DỰA VÀO KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO 42

3.3.1 Xác định sinh khả dụng của clobetasol propionat 42

3.3.2 Đánh giá tương đương sinh học 44

3.3.2.1 Đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm lidocain tại chỗ 44

3.3.2.2 Đánh giá tương đương sinh học tại chỗ của các loại kem acyclovir 46

3.3.2.3 Đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm oxytetracyclin HCl và so sánh với phương pháp băng tước 50

2 KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Khoảng tin cậy (Confidence Interval) Nồng độ đỉnh

Dalton

Hiệu suất in vivo của màng bán thấm trên kim thăm dò

(extraction fraction) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

Kilo Dalton Khối lượng Sắc ký khối phổ (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) Thẩm tách micro (Microdialysis)

Thẩm tách micro ở da (Dermal Microdilysis) Khối phổ (Mass Spectrometry)

Dược lực học (Pharmacodynamic) No-net-flux

Dược động học (Pharmacokinetic) Thẩm tách ngược (Retrodialysis) Hiệu suất tương đối (Relative Recovery)

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Tốc độ dòng chảy rất chậm (Very Slow Flow Rate) Tài liệu tham khảo

Thời gian đạt nồng độ đỉnh

Thể tích

Bảng 3.1 Các nhóm thuốc ngoài da đã được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro 36 Bảng 3.2 Thành phần các dung dịch truyền ngoại vi 37 Bảng 3.3 Vùng cấy và độ sâu kim thăm dò 39 Bảng 3.4 Thành phần các công thức ACV và độ sâu cấy kim thăm dò tương ứng… 46 Bảng 3.5 Các thông số dược động học của các loại kem Acyclovir dùng tại chỗ… 48 Bảng 3.6 Tổng hợp một số nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của thuốc ngoài da dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro 49

hàm lượng của hai hãng sản xuất được coi là tương đương sinh học 4

Hình 1.2 Nồng độ ciclosporin trong máu theo thời gian ở những người tham gia dùng CicloMulsion hoặc Sandimmune (n = 52) 11

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc Cefuroxim trung bình theo thời gian của thuốc thử và thuốc chứng 12

Hình 2.1 Các mô đích tác dụng của thuốc trên người đã được thực hiện nghiên cứu lâm sàng dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro 15

Hình 2.2 Kết quả tìm kiếm trên medline với các từ khóa liên quan đến microdialysis 15

Hình 2.3 Nguyên tắc của kỹ thuật thẩm tách micro với một kim thăm dò dạng đồng tâm 16

Hình 2.4 Sơ đồ nguyên tắc thẩm tách micro thuốc ngoài da 17

Hình 2.5 Ba kim thăm dò đặt song song trong mỗi khu vực thử nghiệm (3 khu vực, mỗi khu cho một thuốc thử) trên mặt ngửa của cánh tay trái 17

Hình 2.6 Kim thăm dò thẩm tách micro dạng đường thẳng 18

Hình 2.7 Các dạng kim thăm dò A: đường thẳng, B: vòng móc, C: sóng đôi, D: đồng tâm 19

Hình 2.8 Cắm ống dẫn sau đó sẽ luồn kim thăm dò qua ống dẫn này 20

Hình 2.9 Sơ đồ hệ thống HPLC 24

Hình 2.10 Mô hình đánh giá hiệu suất màng bán thấm kim thăm dò in vitro 26

Hình 2.11 Phương pháp zero - net - flux trong hiệu chỉnh in vivo 28

Hình 2.12 Cấy kim thăm dò ở não (trái) và ở bả vai (phải) 31

Hình 3.1 Mô tả kim thăm dò dạng đường thẳng 38

Hình 3.2 Cấy kim thăm dò vào da 39

Hình 3.3 Cấy kim thăm dò với 2, 3, 4 cặp điểm 40

Hình 3.4 Hệ thống sắc ký HPLC (trái) và LC-MS (phải) 41

Hình 3.6 Khoang chứa PVC gắn vào các vị trí phía mặt trong cẳng tay của các đối

tượng để tạo thành thùng chứa cho công thức CP 4% (kl/tt) 43

Hình 3.7 Các thủ tục cấy kim thăm dò MD trên da trong một nghiên cứu lâm sàng có đối chứng 45

Hình 3.8 Các vị trí sử dụng của ba công thức ACV đề trên lưng lợn 47

Hình 3.9 Biểu đồ giải phóng ACV (3%) in vitro từ 3 công thức dùng ngoài da 47

Hình 3.10 Mô tả kỹ thuật băng tước 50

Hình 3.11 Cấy kim thăm dò thẩm tách micro vào lớp hạ bì mặt trong cánh tay của tình nguyện viên khỏe mạnh 52

Hình 3.12 Hiệu chuẩn in vitro kim thăm dò thẩm tách micro cho oxytetracyclin HCl 52

Hình 3.13 Nồng độ oxytetracyclin HCl trong lớp hạ bì cho thuốc thử và thuốc chứng ở 10 tình nguyện viên khỏe mạnh (kết quả MD) 53

Hình 3.14 Lượng oxytetracyclin HCl trung bình trong lớp sừng của 12 tình nguyện viên khỏe mạnh (kết quả băng tước) 53

tàng thuốc quý báu của nhân loại

Tuy nhiên, da có cấu tạo và chức năng riêng nên việc sử dụng thuốc trên da có nhiều khác biệt so với những đường dùng khác Hơn nữa, có nhiều dạng thuốc được dùng trên da (dung dịch, kem, mỡ…), mỗi dạng dùng được sử dụng tùy vào loại da, mức độ cấp tính và vị trí của tổn thương Cùng với sự phát triển của kỹ thuật bào chế, hiện nay thuốc dùng ngoài không chỉ dừng lại ở tác động ngay tại bề mặt da mà ngấm qua lớp sừng, vào các khe gian bào, các nang lông, vượt qua lớp đáy (lớp sâu nhất của thượng bì) ngấm vào tận trung bì hoặc sâu hơn, nơi có nhiều đầu dây thần kinh và mạch máu nhỏ rồi vào hệ tuần hoàn chung Việc xác định sinh khả dụng cũng như tương đương sinh học giữa các công thức bào chế để biết được hiệu quả tác dụng của thuốc là hết sức cần thiết Trước kia, nghiên cứu dược động học bị hạn chế trong việc đo nồng độ thuốc từ các tổ chức sinh học như các mô tác dụng, nước tiểu, nước bọt hoặc các chất dịch từ các chỗ phồng rộp da Gần đây, một phương pháp ứng dụng mới có thể áp dụng để đánh giá tương đương sinh học và sinh khả dụng của các thuốc ngoài da, đó là kỹ thuật thẩm tách micro (Microdialysis - MD)

Kỹ thuật thẩm tách micro là một công cụ lấy mẫu rất hữu ích có thể được sử

dụng trên in vivo để biết được sự thay đổi nồng độ của các phân tử tự do nằm trong

khoảng kẽ hoặc ngoại bào dựa trên sự khuếch tán thụ động các chất qua màng thẩm

tách theo gradient nồng độ Kỹ thuật này có thể được sử dụng trên in vivo để đo

nồng độ thuốc tự do trong dịch kẽ mô, rồi sau đó tính toán các thông số dược động

học (PK) kết hợp với những quan sát dược lực học (PD) để dự đoán hiệu quả lâm sàng Khả năng đo nồng độ tự do tại vị trí tác dụng của thuốc theo thời gian làm cho

kỹ thuật thẩm tách micro trở thành một công cụ rất có giá trị trong việc đánh giá

sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc Phương pháp này đã được công nhận bởi các nhà sản xuất Dược phẩm và các cơ quan quản lý như Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) [92]

Với những ưu điểm vượt trội của kỹ thuật thẩm tách micro trong việc nghiên cứu dược học nói chung và thuốc ngoài da nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài “Tổng quan về phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh

học của thuốc ngoài da dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro” với 3 mục tiêu:

1 Tổng quan về vai trò đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc

2 Tổng quan về kỹ thuật thẩm tách micro trên da và ưu nhược điểm của kỹ thuật

3 Tổng quan về phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc ngoài da dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro

Trên cơ sở kết quả thu được của đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ giúp ích cho các nhà nghiên cứu Dược có thể tiến hành triển khai việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc ngoài da tại Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VAI TRÒ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG

VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC

1.1 KHÁI NIỆMSINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

Trong dược học, sinh khả dụng (bioavailability - BA) là thông số biểu thị tỷ lệ thuốc vào được tuần hoàn chung (tuần hoàn máu) ở dạng còn hoạt tính so với liều

đã dùng (F%), tốc độ (Tmax) và mức độ (Cmax) thuốc hấp thu vào vòng tuần hoàn chung [1, 3] Từ định nghĩa này, thuốc theo đường tiêm tĩnh mạch có sinh khả dụng

là 100% Tuy vậy, khi thuốc được dùng bằng các cách thức khác nhau (như đường ngoài da) thì sinh khả dụng của thuốc thường giảm (do hấp thu không hoàn toàn) Sinh khả dụng được xem là một công cụ thiết yếu trong sinh dược học, đây là đại lượng quan trọng để xác định và tính toán liều dùng cho các dạng bào chế không theo đường tĩnh mạch

Sinh khả dụng tuyệt đối (F abs ): Để xác định được sinh khả dụng tuyệt đối của

một loại thuốc người ta cần xác định được mối liên hệ giữa thời gian và nồng độ của thuốc lưu hành trong huyết tuơng Để biết được mối tương quan trên trước hết phải biết được liều dùng theo đường tiêm tĩnh mạch (Div) và cả đường ngoài tĩnh mạch (Dpo) Sinh khả dụng tuyệt đối (Fabs) là tỷ lệ giữa diện tích dưới đường cong thu được khi đưa thuốc ngoài đường tĩnh mạch (AUCpo) và diện tích dưới đường cong đưa qua đường tĩnh mạch (AUCiv) của cùng một thuốc

Như vậy nếu thuốc được đưa theo đường tĩnh mạch (I.V) thì F = 1 Còn nếu thuốc đưa ngoài đường tĩnh mạch F sẽ luôn nhỏ hơn 1 do luôn có một lượng nhất định bị tổn hao trong quá trình hấp thu vào máu hoặc bị chuyển hóa khi đi qua gan

Sinh khả dụng tương đối (F A/B ): Sinh khả dụng tương đối là tỷ lệ giữa 2 giá

trị sinh khả dụng của cùng một hoạt chất, cùng một đường đưa thuốc, cùng một mức liều nhưng của 2 nhà sản xuất khác nhau hoặc của 2 dạng bào chế khác nhau

Sinh khả cdụng tương đối thường được sử dụng để so sánh thuốc của một nhà sản xuất nào đó với một thuốc đang lưu hành có uy tín trên thị trường [1] Trong đề tài này, chúng tôi đánh giá về sinh khả dụng của các thuốc ngoài da là dùng khái niệm về sinh khả dụng tương đối

Tương đương sinh học (Bioequivalence - BE): Hai chế phẩm của cùng một

hoạt chất, cùng liều dùng, cùng đường đưa thuốc được coi là tương đương sinh học khi 3 đại lượng: F%, Tmax (tốc độ) và Cmax (cường độ) dao động ở mức độ cho phép (thường trong khoảng từ 80 đến 125%); tuy nhiên, quy định thường chỉ đối với AUC còn 2 đại lượng Tmax, Cmax không bắt buộc, trừ những thuốc có phạm vi điều trị hẹp, yêu cầu này là bắt buộc đối với cả 3 đại lượng [2] Tương đương sinh học còn được định nghĩa nếu 2 thuốc là tương đương bào chế (chứa cùng loại dược chất với cùng hàm lượng trong cùng dạng bào chế, có cùng đường dùng và đạt cùng một mức tiêu chuẩn chất lượng [3]) hay là thế phẩm bào chế (cùng loại dược chất nhưng khác nhau về dạng hoá học của dược chất như base, muối hay ester hay khác nhau

về hàm lượng hoặc dạng bào chế [3]) và sinh khả dụng của chúng sau khi dùng cùng một mức liều trong cùng điều kiện thử nghiệm là tương tự nhau dẫn đến hiệu quả điều trị của chúng về cơ bản được coi là sẽ tương đương nhau [3]

Hình 1.1 Đồ thị biểu diễn nồng độ của hai chế phẩm A, B có cùng hoạt chất, cùng hàm lượng của hai hãng sản xuất được coi là tương đương sinh học [29]

1.2 VAI TRÕ CỦA SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC TRONG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG THUỐC TRÊN THỊ TRƯỜNG

Thị trường dược phẩm trên thế giới hiện nay có hàng trăm mẫu mã thuốc mới và biệt dược khác nhau Các nhà điều trị sử dụng thì thấy có một số thuốc

không cho tác dụng điều trị và hiệu quả lâm sàng giống như biệt dược gốc (tức là

thuốc được phát minh đầu tiên và được cấp phép lưu hành trên thế giới) Một thuốc

generic có thể tương đương bào chế (có cùng công thức, hàm lượng dược chất,

cùng dạng bào chế, cùng cách dùng, liều lượng) với biệt dược gốc nhưng lại không đạt được hiệu quả điều trị như thuốc biệt dược gốc thể hiện Để đạt độ tin cậy cần thiết trong thị trường dược phẩm, một thuốc generic cần phải được chứng minh tính

hiệu quả và an toàn trong điều trị của nó bằng thử nghiệm chứng minh tương đương

sinh học (bioequivalence - BE) với thuốc biệt dược gốc

Với sự phát triển của công nghiệp dược phẩm trên thế giới hiện nay, nhất là các quốc gia phát triển đã cho ra đời hàng ngày lên đến hàng trăm mẫu mã thuốc mới và hàng chục loại biệt dược khác nhau Tuy nhiên, khó có thể biết hoặc chưa đánh giá hết liệu các thuốc do nhà sáng chế sản xuất ban đầu với thuốc generic có hiệu quả như nhau về điều trị hay không, nghĩa là đặc tính sinh khả dụng và tương đương sinh học giữa các thuốc đó có như nhau hay không, đó là chưa kể đến hiệu lực và tính an toàn của thuốc Hơn nữa, hàng ngày trên các trang tin trong và ngoài nước đưa những tin về loại thuốc A hay thuốc B không đủ tiêu chuẩn, trong đó cũng

đề cập đến tương đương sinh học

Do vậy, vai trò đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học vừa có ý nghĩa khoa học, vừa là hành lang pháp lý cho nhà chuyên môn và quản lý Dược phẩm thực hiện chăm sóc sức khỏe con người Điều đó cũng đòi hỏi các nhà sản xuất, phân phối, quản lý bắt buộc phải hội nhập càng sớm càng tốt để bệnh nhân an tâm, việc quản lý và kê đơn thuốc hợp lý hơn vì đã có thước đo chung là tương đương sinh học

Hiện nay trên thị trường toàn cầu, thuốc ngày càng đa dạng và phong phú Rất nhiều thuốc của nước ngoài đưa vào Việt Nam với giá rẻ từ Ấn Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Thái Lan thậm chí rẻ hơn thuốc trong nước sản xuất, trong khi đó một số loại thuốc nhập từ châu Âu và châu Mỹ hoặc liên doanh với các quốc gia như Ý, Pháp, Canada lại có giá rất đắt Vấn đề đặt ra là người bệnh sẽ chọn dùng thuốc giá

rẻ hay giá đắt và đặc biệt là có thể dùng thuốc an toàn-hiệu quả mà còn “kinh tế” nữa Điều này có thể lý giải và đưa lời khuyên hợp lý nhất chỉ khi có kết quả hoặc bằng chứng chứng minh được vấn đề sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc

Về khía cạnh sinh khả dụng của thuốc còn phải có 2 đại lượng là tốc độ (Tmax)

và mức độ (Cmax) cần phải đạt được của một thành phần hoạt chất được giải phóng

từ một dạng bào chế, được xác định bằng đồ thị “nồng độ - thời gian” của hoạt chất trong hệ tuần hoàn hoặc sự bài tiết hoạt chất trong nước tiểu Sinh khả dụng của thuốc sẽ khác nhau trong các trường hợp là cùng một dược chất nhưng đường sử dụng khác nhau, cùng đường sử dụng nhưng dạng thuốc khác nhau, cùng dạng thuốc, cùng đường sử dụng nhưng công thức khác nhau

1.3 THỬ NGHIỆM TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

Các thử nghiệm tương đương sinh học giữa thuốc có bằng sáng chế và thuốc gốc thường được nghiên cứu trên đối tượng là những người tình nguyện khỏe mạnh (trên 12 người), nhưng đôi khi có thể được thử nghiệm trên cả những bệnh nhân Sau đó, tiến hành so sánh về các thông số dược động học được trích xuất từ bảng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian như diện tích dưới đường cong (AUC: area under the curve), nồng độ đỉnh (Cmax), thời gian đạt được nồng độ đỉnh (Tmax) Thử nghiệm nên tiến hành trên nhiều mức nồng độ khác nhau, đặc biệt khi thuốc cho kết quả về dược lực học không theo đường tuyến tính

Thử tương đương sinh học (TĐSH) là nghiên cứu tốn kém vì cần phải thực hiện trên số lượng đủ người tình nguyện (trên 12 người khoẻ mạnh), phải tiến hành việc đo nồng độ thuốc trong máu (phải có thiết bị hiện đại như máy đo HPLC được

thẩm định trước khi đo) Nồng độ trong máu của 2 thuốc: thuốc generic và thuốc biệt dược gốc được so sánh để chứng minh tính hiệu quả của hai thuốc là tương đương

Một thử nghiệm TĐSH bao gồm nhiều bước:

- Thiết kế nghiên cứu (study design): chọn mô hình nghiên cứu phù hợp như dùng đơn liều, ngẫu nhiên, chéo đôi, nhãn mở, mù đơn, mù đôi…

Có 2 giai đoạn nghiên cứu: giai đoạn 1 dùng thuốc generic, giai đoạn 2 dùng thuốc đối chứng, giữa 2 giai đoạn là thời gian nghỉ không dùng thuốc gọi là thời gian làm sạch thuốc thường là 7 ngày

- Chọn lọc người tình nguyện tham gia nghiên cứu: phải chọn, sàng lọc như từ 30-40 người chọn ra tối thiểu 12 người tình nguyện khỏe mạnh, tuổi từ 18 đến 40-45, đạt tiêu chuẩn của FDA về khám lâm sàng (như đo huyết áp, nhịp tim, thân nhiệt, chỉ số BMI…) và các xét nghiệm hóa sinh (như đo công thức máu… )

- Tiến hành thử sinh khả dụng in vivo với hai thuốc thử nghiệm (generic)

và thuốc đối chứng: để có được các thông số dược động học Cmax, Tmax, AUC Trong thời gian nghiên cứu, người tình nguyện còn được theo dõi tác dụng phụ, độ an toàn của thuốc

- Xử lý thống kê các trị số Cmax, Tmax, AUC: các trị số đo được có sự sai lệch sẽ được phân tích bằng phương pháp ANOVA hoặc các phương pháp khác để tính toán khoảng tin cậy 90% và kiểm tra giới hạn sai lệch

là 80-125% nhằm xem hai thuốc thử nghiệm và đối chứng có tương đương sinh học hay không

Về đội ngũ tham gia nghiên cứu gồm bác sĩ lâm sàng, với vai trò liên tục giám sát y khoa và không được bỏ qua bất kỳ tác dụng phụ nào, dù nhỏ nhất Một nhà dược động lực học chuyên xác định thời gian lấy mẫu máu và một nhà hóa học phân tích lượng thuốc trong mẫu Nghiên cứu phải được tiến hành tại bệnh viện để kịp

thời xử lý các tình huống cấp cứu có thể xảy ra Các mẫu được phân tích bằng thiết

bị chuẩn hóa Sau hàng loạt các nghiên cứu đã thực hiện, hồ sơ báo cáo của chế phẩm sẽ được trình lên Cục quản lý dược phẩm quốc gia để quyết định xem thuốc generic vừa qua thực nghiệm có được xem là tương đương sinh học hay không Chế phẩm phải đạt yêu cầu về tương đương sinh học, mới được đưa ra thị trường

1.4 MỘT SỐ QUY ĐỊNH TẠI CÁC QUỐC GIA VỀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

Tại Australia:

Theo cơ quan quản lý về điều trị của Australia (Therapeutics Goods Administration - TGA), các chế phẩm dược được xem là tương đương sinh học nếu với khoảng tin cậy CI 90% sự chuyển dạng sinh học tự nhiên tương đương giữa 2 chế phẩm, nồng độ thuốc tối đa (Cmax) và diện tích dưới đường cong (AUC) nằm trong khoảng 0,80-1,25 Thời gian đạt nồng độ đỉnh (Tmax) cũng cần tương đương giữa các sản phẩm

Tại châu Âu:

Theo quy định chuẩn của cộng đồng châu Âu EMEA-CPMP về hướng dẫn sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc (London, tháng 7.2001): 2 chế phẩm được xem là có tương đương sinh học nếu sinh khả dụng và hiệu quả tác dụng của chúng sau khi dùng cùng liều phân tử gam là như nhau, cả về hiệu lực của thuốc

và tính an toàn Khoảng tin cậy 90% sự chuyển dạng sinh học tự nhiên tương đương giữa 2 chế phẩm, nồng độ thuốc tối đa (Cmax) và vùng dưới đường cong (AUC) nằm trong khoảng 0,80-1,25

 Tại Mỹ:

Cơ quan FDA của Mỹ xem 2 chế phẩm tương đương về mặt sinh học nếu khoảng tin cậy 90% của Cmax, AUC(0-t) và AUC(0-∞) của thuốc thử và thuốc chứng nên dao động trong khoảng 80% - 125% [99] khi tình trạng bệnh nhân đói

 Tại Việt Nam:

Thông tin tại hội thảo "Thuốc chất lượng = tương đương sinh học" tổ chức tại

Hà Nội 2006, tại Việt Nam khoảng hơn 80% thuốc đang lưu hành là thuốc generic (thuốc thương mại, có cùng gốc hóa học với các thuốc đã hết thời gian được bảo hộ độc quyền) Các thuốc này có giá thành thấp hơn so với các thuốc phát minh, giúp giảm chi phí điều trị Tuy nhiên, số thuốc generic được thử tương đương sinh học còn rất ít, phần lớn chưa được thực hiện vì Việt Nam chưa có quy định này Tại hội thảo, các chuyên gia cho rằng, thuốc generic giúp giảm chi phí 40-60% so với thuốc phát minh, vì vậy người bệnh có thêm cơ hội tiếp cận thuốc điều trị Tuy nhiên, để khẳng định được chất lượng của các thuốc generic, cơ quan quản lý cần có các quy định thử nghiệm tương đương sinh học Thử nghiệm này cho biết mức độ tương tự giữa thuốc generic và thuốc phát minh về dược học, hiệu quả, an toàn Việc cấp

số đăng ký cho thành phẩm thuốc mới dừng lại ở việc kiểm tra tương đương dược học (tương đương bào chế): cùng dạng thuốc, cùng loại thuốc và lượng dược chất, cùng đường sử dụng, cùng đạt các tiêu chuẩn chất lượng quy định, có thể khác nhau

về tá dược, màu, mùi, vị, tuổi thọ, nhãn nhưng trị liệu có thể giống hoặc không giống nhau Cần tiến tới lộ trình của việc cấp số đăng ký sẽ phải có kết quả kiểm tra tương đương sinh học, chỉ có như vậy chúng ta mới thực sự biết được hiệu lực của thuốc (tương đương trị liệu) Tương đương trị liệu bao gồm các dược phẩm được đăng ký lưu hành, các dược phẩm là tương đương dược học, các dược phẩm là tương đương sinh học, có nhãn đủ và đúng, sản xuất tuân theo quy định về thực hành sản xuất tốt Đáp ứng yêu cầu của thực tiễn, ngày 26/04/2010 Bộ Y tế đã ban hành Thông tư 08/2010/TT-BYT hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh học trong đăng ký thuốc Theo Thông tư này nguyên tắc lựa chọn các dược chất đưa vào Danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu tương đương sinh học khi đăng ký thuốc phải đáp ứng một hoặc một số các nguyên tắc ưu tiên sau [3]:

1) Có trong các thuốc thuộc Danh mục thuốc chữa bệnh chủ yếu sử dụng tại các cơ

sở khám chữa bệnh do Bộ Y tế ban hành kèm theo Quyết định số 05/2008/QĐ-BYT ngày 01/02/2008 và thuộc một trong các nhóm tác dụng dược lý được ưu tiên sau:

- Các thuốc tim mạch- huyết áp

- Các thuốc chống co giật, chống động kinh

- Các thuốc hạ đường huyết

- Các thuốc kháng sinh

- Các thuốc tác dụng trên đường tiêu hoá làm giảm tiết acid dịch vị

- Các thuốc chống rối loạn tâm thần

- Các thuốc kháng viêm (không steroid và steroid)

3) Có khoảng điều trị hẹp và/ hoặc có vấn đề về sinh khả dụng

 Theo một số nghiên cứu khoa học:

Nghiên cứu của Ehinger KH và các cộng sự (2013, Clinical Drug Investigation) đã tiến hành đánh giá tương đương sinh học của 2 chế phẩm tiêm truyền tĩnh mạch là CicloMulsion (NeuroVive, Thụy Điển) và Sandimmune (Novartis, USP) cùng có hoạt chất chính là Ciclosporin-một chất ức chế miễn dịch Nghiên cứu được thực hiện trên 52 tình nguyện viên khỏe mạnh, theo phương pháp

mù đôi, đơn liều, ngẫu nhiên, nghiên cứu chéo, 2 giai đoạn Kết quả thu được cho thấy khoảng tin cậy 90% của AUC(0-∞) là 0,90 (0,88-0,92) và của Cmax là 0,95 (0,92-0,97) nằm trong khoảng 0,80-1,25, được chấp nhận là tương đương sinh học [93]

Hình 1.2 Nồng độ ciclosporin trong máu theo thời gian ở những người tham gia

dùng CicloMulsion hoặc Sandimmune (n = 52) [93]

Nhiều nghiên cứu và điều tra, các bộ phận đăng ký ở các nước phát triển lớn như Mỹ, Australia hoặc châu Âu nhận thấy rằng tương đương sinh học là cách thích hợp nhất để chứng tỏ sự tương thích trị liệu giữa thuốc generic và thuốc sáng chế Một thuốc generic có chất lượng là một thuốc được chứng minh tương đương sinh học so với thuốc sáng chế Trong thực tế sản xuất, các tiêu chuẩn thực hành sản xuất thuốc tốt của trang thiết bị sản xuất cho thuốc generic và thuốc sáng chế phải hoàn toàn giống nhau

Thực tế trên thị trường có quá nhiều biệt dược, để đánh giá thuốc nào tốt, người ta cần phải xem xét tới sinh khả dụng và tương đương sinh học Với việc áp dụng dược động học, dược lực học, quan sát và thử nghiệm lâm sàng, kể cả các thử

nghiệm in vitro: đo nồng độ huyết tương, đo lượng thuốc trong các dịch bài tiết

(nước tiểu), đo phản ứng dược lực cấp, đánh giá lâm sàng, độ hòa tan, độ phóng

thích thuốc (tính tan, tính thấm) để khẳng định thuốc nào là tốt

Ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về tương đương sinh học trước và sau khi Thông tư 08/2010 ra đời ở cả những doanh nghiệp dược phẩm lớn đến các cơ sở sản xuất dược phẩm cấp tỉnh, các xí nghiệp dược phẩm quân đội Một nghiên cứu

gần đây tại Việt Nam [4] đã đánh giá tương đương sinh học viên nén bao phim Cefuroxime 500 mg do Xí nghiệp Dược phẩm 150 sản xuất Nghiên cứu tiến hành trên 12 người trưởng thành khỏe mạnh tình nguyện theo phương pháp nghiên cứu chéo, đơn liều, ngẫu nhiên, 2 thuốc, 2 giai đoạn nhằm đánh giá tương đương sinh học giữa thuốc thử là viên nén bao phim Cefuroxime 500 mg (Xí nghiệp Dược phẩm 150, ARMEPHACO) và thuốc đối chứng là viên nén bao phim Zinnat® 500

mg (Glaxo, UK)

Kết quả cho thấy thuốc thử so với thuốc đối chứng có khoảng tin cậy 90% của AUC0-t đạt từ 95,76-106,53%; của AUC0-∞ đạt từ 93,71-105,75%; của Cmax đạt từ 93,76-112,94%; phân tích ANOVA các thông số AUC0-t, AUC0-∞ và Cmax về sự khác nhau giữa 2 trình tự, 2 thuốc, 2 giai đoạn không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05); giá trị Tmax khác nhau không có ý nghĩa thống kê theo phương pháp thống kê phi tham số Viên nén bao phim Cefuroxim 500 mg được kết luận tương đương sinh học in vivo với viên nén bao phim Zinnat® 500 mg [4]

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc Cefuroxim trung bình theo thời

gian của thuốc thử và thuốc chứng [4]

Dược phẩm là hàng hóa đặc biệt dùng để phòng, chữa bệnh, thay đổi chức năng sinh lý của con người Chính vì ảnh hưởng trực tiếp tới cơ thể như vậy nên các nhà khoa học và các nhà quản lý cần giải quyết và điều chỉnh mối quan hệ giữa giá

cả và hiệu lực điều trị sao cho hợp lý, an toàn, hiệu quả, kinh tế Tương đương sinh

học sẽ là công cụ sắc bén để giải quyết tốt mối quan hệ này, việc thực hiện thử nghiệm tương đương sinh học giúp cho việc sử dụng thuốc theo cách tốt nhất vừa

an toàn - hợp lý - hiệu quả - kinh tế Tuy nhiên những nghiên cứu đã có mới chỉ tập trung đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các thuốc đường tiêm và đường uống mà ít đề cập đến việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các thuốc dùng ngoài da, đặc biệt tại Việt Nam, trong khi những thuốc này ngày càng được sử dụng phổ biến với các tác dụng nhanh tại chỗ mà ít tác dụng phụ toàn thân Việc tìm được một phương pháp giúp hỗ trợ đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các thuốc dùng ngoài da này là hết sức cần thiết Kỹ thuật thẩm tách micro được giới thiệu dưới đây sẽ là một công cụ đắc lực để giúp giải quyết vấn đề này

Chương 2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO

TRÊN DA VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT

2.1 TÓM TẮT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO

Xuất hiện từ những năm 60 của thế kỷ XX, kỹ thuật thẩm tách micro (microdialysis) dựa trên sự khuếch tán thụ động các chất qua màng thẩm tách theo gradient nồng độ Ban đầu, thiết bị thẩm tách micro sử dụng một túi thẩm tách có kích thước lỗ màng rất lớn để thu được các phân tử acid amin trong các tổ chức mô trên động vật thực nghiệm [15, 21] Đến năm 1974, Ungerstedt và cộng sự nhờ sự

hỗ trợ của các phương pháp định lượng mới đã cải tiến lại kỹ thuật dưới dạng kim thăm dò có đầu là một màng bán thấm và đưa ra công trình nghiên cứu đầu tiên về định lượng nồng độ dopamin trong não chuột thực nghiệm [94]

Cuối những năm 80, kỹ thuật này bắt đầu được dùng trong các nghiên cứu trên người [64] Đầu tiên, kỹ thuật này được áp dụng nghiên cứu định lượng phân tử glucose trong dịch kẽ tế bào của người tình nguyện Tuy nhiên, phải đến năm 1991, những báo cáo đầu tiên về thẩm tách micro trong nghiên cứu dược động học của thuốc trên lâm sàng mới được công bố [84] Năm 1994, Palsmeier và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật này để xác định sự phân bố của thuốc trong mô ung thư [69] và rất nhiều các nghiên cứu khác được thực hiện ở hầu hết các mô trong cơ thể người cho kết quả rất khả quan như mô não, mô tim, mô phổi, mô gan, mô vú, mô dưới da [5,

21, 55, 64] (Hình 2.1) Ngoài ra, thẩm tách micro còn là công cụ tốt nhất để đánh giá sinh khả dụng (bioavailability – BA) và tương đương sinh học (bioequivalence -BE) của thuốc tại mô đích [17, 68, 77, 78, 90], đặc biệt là các thuốc ngoài da khi việc đo nồng độ thuốc ở dịch kẽ mô da sẽ phản ánh đúng hơn mức độ phân bố thuốc tại mô da

Hình 2.1 Các mô đích tác dụng của thuốc trên người đã được thực hiện

nghiên cứu lâm sàng dựa trên kỹ thuật thẩm tách micro

Qua những thập kỷ sử dụng, kỹ thuật thẩm tách micro ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi, đặc biệt cho nghiên cứu dƣợc phẩm và y học lâm sàng Từ khóa

“Microdialysis” xuất hiện trên các công cụ tra cứu medline với hơn 15000 kết quả, trong đó có gần 1500 kết quả liên quan đến việc sử dụng kỹ thuật này trên da với các chế phẩm dùng tại chỗ Ứng dụng chính của kỹ thuật này trong giai đoạn đầu phát triển thuốc nhằm lựa chọn những thuốc mới có hiệu quả tốt và xác định liều lƣợng tối ƣu an toàn và hiệu quả

Hình 2.2 Kết quả tìm kiếm trên medline với các từ khóa liên quan đến

microdialysis

2.2 NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO

2.2.1 Nguyên lý

Kỹ thuật thẩm tách micro dựa trên sự khuếch tán thụ động các chất qua màng thẩm tách theo gradient nồng độ [24, 84, 87, 93] Sau khi một kim thăm dò được cấy ghép vào các vị trí đích để lấy mẫu [20, 107] (thường là một mạch máu hoặc mô), dịch truyền bao gồm các dung dịch đệm sinh lý chảy chậm qua màng bán thấm để thu lại các phân tử nhỏ từ khoang ngoại bào phía bên kia màng thẩm tách [42, 51, 82] Dịch thẩm tách thu được có thể được phân tích để xác định các phân

tử thuốc hoặc chất cần phân tích trong mẫu thẩm tách micro bằng sắc ký lỏng hoặc các kỹ thuật phân tích phù hợp khác [53, 54, 70, 98]

Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thể được áp dụng để truyền một chất vào

khoang ngoại bào bởi kim thăm dò thẩm tách micro, kỹ thuật này được gọi thẩm

tách ngược [23, 26, 34, 92] Bằng cách này, việc dùng thuốc tại chỗ và lấy mẫu

đồng thời các hợp chất nội sinh trong các khoang ngoại bào có thể cùng một lúc được thực hiện

Hình 2.3 Nguyên tắc của kỹ thuật thẩm tách micro với một kim thăm dò

dạng đồng tâm

Sau khi cấy kim thăm dò, dung môi thẩm tách đi vào kim thăm dò thông qua

dây truyền dịch vào (ống bên trong), đi xuống mũi kim thăm dò, chảy lên trên khoảng không gian giữa ống bên trong và bên ngoài màng lọc, và rời kim thăm dò thông qua ống ra cạnh sườn, từ đó được lấy vào một lọ đựng mẫu [92]

Đối với phương pháp thẩm tách micro của thuốc ngoài da trong các mẫu sinh học, nguyên tắc thẩm tách micro là kim thăm dò được đưa vào lớp hạ bì và được truyền thông qua máy bơm truyền với tốc độ rất chậm (Hình 2.4) Thuốc từ nơi sử dụng sẽ thấm vào qua lớp biểu bì và cuối cùng khuếch tán thụ động qua màng bán thấm [6] Các chất thẩm tách được lấy mẫu tại các khoảng thời gian cố định [16,

38, 101]

Hình 2.4 Sơ đồ nguyên tắc thẩm tách micro thuốc ngoài da [101]

Hình 2.5 Ba kim thăm dò đặt song song trong mỗi khu vực thử nghiệm (3 khu vực,

mỗi khu cho một thuốc thử) trên mặt ngửa của cánh tay trái [32]

Kim thăm dò được cấu tạo gồm 3 bộ phận: (1) một dây truyền dịch vào, (2) màng bán thấm và (3) một dây để lấy dịch ra (Hình 2.6)

Hình 2.6 Kim thăm dò thẩm tách micro dạng đường thẳng [16]

Kim thăm dò dùng để lấy mẫu các dịch sinh học hiện nay được chia làm 4 loại

cơ bản [20, 93]: đường thẳng (linear), vòng móc (loop), sóng đôi (side - by - side)

và đồng tâm (concentric) (Hình 2.7), khác nhau về kích thước, hình dạng và chất liệu, phụ thuộc vào vị trí tổ chức mô đích cần nghiên cứu [93] Trong nghiên cứu thẩm tách micro ở da, kim thăm dò dạng đường thẳng (linear probe) được dùng phổ biến nhất [13, 39, 101]

Hình 2.7 Các dạng kim thăm dò A: đường thẳng, B: vòng móc, C: sóng đôi, D: đồng tâm [39]

(1) Dây truyền dịch vào

Dây dịch truyền vào (inlet tube) được nối với bơm thẩm tách để truyền vào

cơ thể dịch truyền với tốc độ định sẵn [77, 101]

Dịch truyền vào phần lớn được truyền với tốc độ chậm 0,1-5 μl/phút [60]

qua máy truyền tốc độ chậm (CMA100, Thụy Điển) [6] Thành phần của dịch truyền vào sẽ được mô tả chi tiết ở bảng 2.1

(2) Màng bán thấm

Màng bán thấm (semi-permeable membrane) chính là bộ phận có vai trò

thẩm tách, chỉ cho phép các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ màng

đi qua màng theo sự chênh lệch gradient nồng độ nên đặc điểm quan trọng nhất

là kích thước lỗ màng [60, 74, 92] Trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 100kDa [9, 107], do đó có thể thẩm tách nhiều chất khác nhau bẳng kỹ thuật thẩm tách micro [18, 39, 76, 80]

5-Màng bán thấm thường có đường kính ngoài từ 0,2-0,5 mm [60], chiều dài

từ 0,7-3 cm tùy thuộc vị trí cấy kim [74] Màng bán thấm đều được làm bằng vật liệu có độ tương hợp sinh học cao như cellulose acetat, polyether sulfonat, polycarbonat - ether, polyamid, polyacrylonitril (PAN) [9, 74] có khả năng hút nước và không có tính chọn lọc hóa học

(3) Dây truyền dịch ra

Dây dịch truyền ra (outlet tube) được nối với bộ phận chứa mẫu Dịch thu

được chứa các chất cần phân tích ở dạng tự do được thẩm tách từ dịch ngoại bào ở khoảng kẽ theo cơ chế khuếch tán thụ động đi qua màng bán thấm, tức theo gradient nồng độ từ mô đích có nồng độ chất cần thẩm tách cao vào dịch truyền

Dịch thu được sẽ được chuyển vào các ống nghiệm trong khay chứa ống, sau đó đem định lượng ngay (thẩm tách micro online) [22, 73] hoặc bảo quản lạnh chờ định lượng từng mẫu (thẩm tách micro offline) [75, 105]

Kim thăm dò thường được luồn qua một kim dẫn (guide cannula) để tiện cho việc cấy kim do kim thăm dò mảnh, dễ gãy [27, 37, 39] (Hình 2.8)

Hình 2.8 Cắm ống dẫn sau đó sẽ luồn kim thăm dò qua ống dẫn này [39]

Kim thăm dò phải được cấy trong điều kiện vô khuẩn vì việc cấy kim thăm dò trong điều kiện không vô khuẩn có thể gây nhiễm khuẩn tại vị trí cấy và tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển Mặt khác, nó còn làm ảnh hưởng đến kết quả hiệu chỉnh của màng bán thấm trên kim thăm dò Trong các nghiên cứu tiến hành trên người tình nguyện, yêu cầu vô khuẩn đối với kim thăm dò và dịch truyền vào là bắt buộc

2.2.3 Dịch truyền vào

Dịch truyền vào khi sử dụng kỹ thuật thẩm tách micro phải vô khuẩn, có thành phần, áp suất thẩm thấu và pH tương tự như dịch tại mô cấy kim thăm dò [83, 85] Thành phần của các dung dịch hay dùng cho kỹ thuật thẩm tách micro được ghi trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các dung dịch truyền sử dụng trong kỹ thuật thẩm tách micro

MgCl2 0,85 mmol/l CaCl2 1,2 mmol/l NaCl 147 mmol/l KCl 2,7 mmol/l Hãng CMA, Thụy

Điển

Dịch truyền cho mô ngoại vi

(mô da và các mô tổ chức của

Nhũ tương vô trùng Intralipid (IL) [10]

Dầu đậu nành 200 g Phospholipid trứng 12 g Glycerol anhydrid 22 g NaOH và H2O (lượng vừa đủ để điều chỉnh pH=8)

Fresenius Kabi, Midrand, Nam Mỹ

2.2.4 Định lượng các phân tử thuốc

Sau khi lấy mẫu, việc định lượng mẫu là không thể thiếu, trong kỹ thuật thẩm tách micro, lượng mẫu thu được rất nhỏ (cỡ vài chục microlit) nên đòi hỏi các phương pháp định lượng phải có độ nhạy cao như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC - MS)…

2.2.4.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên một pha tĩnh được cố định trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [2] Các thuốc được nghiên cứu bằng kỹ thuật thẩm tách micro hầu hết có bản chất thân nước nên sắc ký phân bố pha đảo thườngđược dùng, ngoài ra có thể sử dụng cột trao đổi ion Các thông số khác của cột sắc ký (chiều dài cột, kích thước hạt, đường kính trong) được xác định dựa theo khoảng cách lấy mẫu mong muốn và yêu cầu về độ nhạy

Phần lớn các máy sắc ký lỏng cần lượng mẫu phân tích tối thiểu là 10μl Nếu tốc độ truyền dịch vào là 1μl/phút thì sau khoảng thời gian phân tích khoảng 15 –

30 phút, chúng ta sẽ thu được một lượng dịch từ 15 đến 30μl, lượng này đủ để phân tích bằng các máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Tốc độ truyền dịch càng chậm thì hiệu suất kim thăm dò càng cao, tuy nhiên thời gian phân tích sẽ kéo dài Cột mao dẫn được sử dụng để tăng độ nhạy và rút ngắn thời gian phân tích [70]

Mẫu sau khi lấy có thể bảo quản đông lạnh với nhiệt độ thích hợp trong khi chờ định lượng (offline microdialysis) [75, 105] Ngày nay, với những tiến bộ trong phân tích hóa học cho phép thiết kế một hệ thống lấy mẫu và định lượng trực tiếp (online microdialysis) [22, 73] nồng độ thuốc trong dịch kẽ mô một cách nhanh chóng, giúp cho việc giám sát nồng độ thuốc tại mô, tạo ra khả năng điều chỉnh tức thời liều dùng của thuốc trên từng bệnh nhân cụ thể [22]

Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật tách khác nhau [2] Tuy vậy, một máy sắc ký lỏng luôn được cấu tạo gồm các

bộ phận cơ bản sau:

1 Hệ thống cấp pha động

Pha động thường là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Cần phải có bộ phận khử khí để đuổi khí hòa tan trong pha động bằng các cách như lọc (màng lọc 0,45μm), chạy siêu âm, sục khí trơ…do khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền

Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh Có 2 kiểu thực hiện chương trình dung môi: trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc ở áp suất cao

2 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cẩn đáp ứng các yêu cầu:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

- Đảm bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 2-3μl/phút đến 20 mL/phút

- Cẩn chế tạo từ vật liệu thích hợp để đảm bảo chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)

3 Hệ tiêm mẫu

Hệ tiêm mẫu là một van tiêm có vòng chứa mẫu dung tích từ 0,5-20μl, dể dàng

tự động hóa, được điều khiển và kiểm soát bằng phần mềm máy tính

4 Cột và pha tĩnh

Cột được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài

10-30 cm, đường kính 4-10mm, bao gồm cột nhồi, cột bảo vệ và điều nhiệt cột

5 Detector

Phát hiện chất phân tích dựa trên tính chất của chất phân tích như hấp thụ bức

xạ UV, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện… Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu:

- Đáp ứng nhanh và lặp lại,

- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp,

- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng,

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng,

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Có nhiều loại detector như detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn…

6 Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu

Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển

hệ thống; máy in…

Hình 2.9 Sơ đồ hệ thống HPLC

đó xác định các đồng vị hóa học mà không dùng bức xạ điện từ như các kỹ thuật quang phổ Tỷ số m/z được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của Carbon 12C) hoặc bằng Dalton (1 dalton bằng khối lượng của nguyên tử Hydro) [2] Khối phổ cung cấp cho ta những thông tin về khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học của hợp chất, số lượng hợp chất

và độ tinh khiết của mẫu phân tích Những dữ liệu này làm tăng thêm độ tin cậy của các kết quả định tính và định lượng [2]

Sắc ký lỏng kết nối khối phổ hay khối phổ ghép (tandem mass spectrometry) làm tăng đáng kể tính chọn lọc và độ nhạy của phương pháp phân tích Giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam [2] Nồng độ các chất trong mẫu thẩm tách micro rất nhỏ, thành phần tương đối phức tạp, bao gồm cả thuốc, các chất chuyển hóa của thuốc và các chất khác có trong dịch ngoại bào Sử dụng LC – MS giúp cho kết quả thu được chính xác hơn và có giá trị hơn [48] Vì vậy rất nhiều nghiên cứu về thẩm tách micro đã sử dụng phương pháp này để định lượng [53, 59, 71, 72]

2.2.5 Hiệu chỉnh kết quả thu được

Kỹ thuật thẩm tách micro dựa vào sự khuếch tán các phân tử thuốc theo gradient nồng độ qua màng bán thấm, chịu ảnh hưởng bởi khả năng thẩm tách của

màng kim thăm dò, nên nồng độ thuốc trong dịch thu được chưa phản ánh được nồng độ thuốc thực chất tại mô đích Trong đa số các trường hợp, nồng độ đo được thấp hơn nồng độ thực tế tại dịch kẽ mô Vì thế, ngoài việc chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật thẩm tách micro trong nghiên cứu thuốc, các nghiên cứu còn đề cập đến sự cần thiết phải có phương pháp hiệu chỉnh lại lượng thuốc thu được tại

Hình 2.10 Mô hình đánh giá hiệu suất màng bán thấm kim thăm dò in vitro

Hiệu suất tương đối in vitro được xác định một cách đơn giản bằng cách cố

định giá trị nồng độ dịch xung quanh màng bán thấm trên kim thăm dò và đo giá trị nồng độ thu được [22] Tỷ lệ giữa nồng độ thuốc trong dịch thu được lấy ra từ đầu thu của kim thăm dò (Cout) và nồng độ thuốc đã biết khi đặt kim thăm dò vào dung dịch này (Cin) chính là hiệu suất tương đối in vitro (Hình 2.10)

Tính hiệu suất kim thăm dò in vivo phức tạp hơn và gặp phải nhiều khó khăn

do ảnh hưởng của nhiều yếu tố dược động học, dược lực học như đặc điểm sinh lý của mô và tương tác giữa mô đích với phân tử thuốc [22] Hiện nay, các phương

pháp tính hiệu suất in vivo thường được sử dụng gồm có: No - net - flux (NNF)[39], ngoại suy tốc độ dòng chảy (ZFR, extrapolation to zero-flow rate) [20], thẩm tách ngược (RD, retrodialysis) [91], tốc độ dòng chảy rất chậm (SFR, very slow flow rate) [12]… Tuy phức tạp và gặp nhiều khó khăn trong quá trình tính toán, kết quả

thu được từ phương pháp in vivo lại đáng tin cậy hơn và giúp xác định nồng độ thực

của thuốc trong dịch kẽ mô một cách chính xác

2.2.5.1 Phương pháp No- net - flux (NNF)

Hay còn gọi là Zero-net-flux, phương pháp này sử dụng thuốc ở dịch kẽ mô, dựa trên nguyên lý các chất khuếch tán thẩm tách ngược (RD, retrodialysis) qua màng bán thấm theo gradient nồng độ [50, 57] Truyền vào các dịch truyền có nồng

độ phân tử thuốc khác nhau đã biết qua kim thăm dò (Cin), sau đó sẽ đo nồng độ mẫu thu được Cout Dịch được truyền với tốc độ ổn định sao cho nồng độ thuốc

trong dịch kẽ mô là một hằng số Khi đó, hiệu suất in vivo của kim thăm dò (EF,

extraction fraction) tại dịch kẽ mô được tính theo công thức [21, 57, 106]:

trong đó:

C in là nồng độ của dịch truyền vào

C out là nồng độ của dịch thu được

C m là nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò

Trường hợp đặc biệt khi C in= 0, EF chính bằng hiệu suất tương đối (RR, relativerecovery)

Hình 2.11 Phương pháp no - net - flux trong hiệu chỉnh in vivo

Đồ thị trên thể hiện quan hệ tuyến tính giữa Δ = C out – C in và C in Độ dốc của

đồ thị chính là hiệu suất tương đối (Hình 2.11) [39, 66]

2.2.5.2 Phương pháp ngoại suy tốc độ dòng chảy (ZFR)

Hiệu suất tương đối phụ thuộc vào tốc dòng chảy, sự thay đổi của tốc độ truyền dịch dẫn tới sự thay đổi của hiệu suất tương đối, phương pháp này dựa trên

nguyên tắc: tốc độ truyền dịch vào thay đổi, trong khi nồng độ dịch truyền vào C in

bằng 0, còn nồng độ chất phân tích trong dịch kẽ mô là hằng định Lúc này, hiệu suất của kim thăm dò phụ thuộc vào tốc độ truyền dịch và được tính theo công thức [20, 40]:

A là diện tích màng bán thấm

F là tốc độ truyền dịch

Người ta giả định rằng tính thấm và diện tích của màng bán thấm là không đổi trong suốt quá trình thử nghiệm Nồng độ thực của chất phân tích trong dịch kẽ mô bao quanh kim thăm dò được xác định bằng cách dùng phép ngoại suy trên đồ thị khi tốc độ truyền dịch F = 0 và hệ thống đạt cân bằng, lúc đó Cout = C m

Phương pháp này có nhược điểm chính là tốn nhiều thời gian do tốc độ dòng

chảy nhỏ, có trường hợp cần đến 12h để lấy đủ lượng mẫu cần thiết [20]

2.2.5.3 Phương pháp thẩm tách ngược (RD)

Phương pháp thẩm tách ngược (RD, retrodialysis) hiện là phương pháp được

sử dụng được nhiều nhất [3, 21], là trường hợp đặc biệt của phương pháp No - net – flux, sử dụng chính chất được nghiên cứu hoặc dùng một chất chuẩn nội thêm vào dịch truyền vào kim thăm dò [95, 97] Chất chuẩn nội lý tưởng phải giống thuốc không những về tính chất vật lý (khả năng khuếch tán qua màng, độ tan ) mà còn

cả về đặc tính sinh học (chuyển hóa, liên kết protein ) [20, 49] Giả định rằng hệ số khuếch tán qua màng bán thấm theo cả hai chiều là như nhau, nồng độ dịch kẽ mô

Cm = 0, thì hiệu suất của thuốc chính là hiệu suất của chất chuẩn nội Hiệu suất này được tính bằng tỷ lệ giữa nồng độ bị mất đi (Δ = Cin – Cout) và nồng độ ban đầu Cin

của chất chuẩn nội theo công thức [99, 106]:

Chất chuẩn nội cần phải có độ phân tán, độ dẫn truyền… tương tự như chất phân tích, vì thế người ta thường chọn chất chuẩn nội là đồng phân phóng xạ hoặc đồng phân deuteri (2H) với chất phân tích

Các phương pháp hiệu chỉnh đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng Tùy vào từng nghiên cứu cụ thể, việc lựa chọn phương pháp cần được cân nhắc sao cho

có thể tính được chính xác hiệu suất của kim thăm dò

2.3 QUY TRÌNH CHUNG CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO TRONG NGHIÊN CỨU Y DƯỢC HỌC

Kỹ thuật thẩm tách micro trong nghiên cứu y dược học được tiến hành theo một quy trình chung gồm 5 bước [7]:

Bước 1: Chuẩn bị các kim thăm dò, dung dịch truyền có thành phần và nồng

độ tương ứng với dịch tại mô đích cần nghiên cứu và các đối tượng nghiên cứu (người, chuột, thỏ, lợn, khỉ, mèo…)

Bước 2: Cấy kim thăm dò vào mô đích tác dụng của thuốc (não, cánh tay, bắp

đùi, lưng….)

Bước 3: Truyền dịch có thành phần và nồng độ tương ứng với dịch tại mô đích

với tốc độ rất chậm (từ 0,1 - 5 μl/phút), dịch thẩm tách thu được sẽ có chứa các phân tử thuốc/chất chuyển hóa

Bước 4: Định lượng nồng độ phân tử thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh

trong dịch thẩm tách thu được bằng phương pháp phân tích thích hợp (HPLC, UPLC [89, 91, 102], LC – MS…)

Bước 5: Hiệu chỉnh lại nồng độ thuốc/chất chuyển hóa/chất nội sinh thông qua

hiệu suất in vitro hoặc in vivo của màng bán thấm

2.4 ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT THẨM TÁCH MICRO

2.4.1 Ưu điểm

 Cho phép xác định nồng độ của phân tử thuốc ở dạng tự do [7, 9], ở dạng này thuốc mới có tác dụng và có mối tương quan thuận với hiệu quả điều trị, từ

đó cung cấp những thông tin về dược động học của thuốc [7, 21]

 Kỹ thuật thẩm tách micro có thể dùng để lấy mẫu nhiều chất khác nhau (dao động từ 5 - 100 kDa), chủ yếu là các phân tử có trọng lượng thấp (thường từ

10 – 30 kDa) [106]

 Kỹ thuật này ít xâm lấn [94], dùng được trên người, ngay cả trong trường hợp cấp cứu hoặc chăm sóc tích cực [21]