Sản phẩm lên men khác

Acid lacticSản xuất bằng pp hóa học - Dựa trên lactonitril: • Hydrogen cyanide được thêm vào acetaldehyde có sự có mặt của kiềm • Pư xảy ra ở dạng lỏng, áp suất cao - Tinh chế lactonitr

SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM

LÊN MEN KHÁC

Mục tiêu:

Trình bày được

- Qui trình sản xuất acid hữu cơ

- Qui trình sản xuất acid amin bằng con đường lênmen

- Qui trình sản xuất vitamin

SẢN XUẤT ACID HỮU CƠ

CH3

C H OH

COOH

CH3D-lactic acid L- lactic acid

Acid lactic

Vai trò

bảo quản, điều chỉnh hương vị, phomat,…

Acid lactic

Sản xuất công nghiệp

- Được sản xuất lần đầu tiên do Charles E Avery (Littleton, Massachusetts, USA), năm1881

- Có 02 phương pháp:

1 Tổng hợp hóa học

2 Lên men carbohydrate

Acid lactic

Sản xuất bằng pp hóa học

- Dựa trên lactonitril:

• Hydrogen cyanide được thêm vào acetaldehyde có sự

có mặt của kiềm

• Pư xảy ra ở dạng lỏng, áp suất cao

- Tinh chế lactonitril thô bằng pp chưng cất

- Thủy phân lactonitril thành acid lactic bằng acid HCl đậm

đặc hoặc H2SO4

- Ester hóa acid lactic bằng MeOH, tạo methyl lactate

- Tinh chế methyl acetate bằng pp chưng cất

- Thủy phân methyl lactate bằng acid, tạo acid lactic

Sản phẩm là hỗn hợp racemic (+), (-) acid lactic

CH3CHO + HCN catalyst CH3CHOHCN

acetaldehyde hydrogen cyanide lactonitrile

Acid lactic

Sản xuất bằng pp hóa học: 1 số qui trình khác

- Oxy hóa propylene glycol

- Thủy phân acid chloropropionic

- Oxy hóa propylene

- Pư giữa acetaldehyde, carbon monoxide và nước ởnhiệt độ và áp suất cao

Acid lactic

Sản xuất bằng pp lên men:

- Lên men carbohydrate

- Có thể tạo dạng L(+) hay D (-) tùy theo chủng vi khuẩn sử dụng

- Gồm các bước chính:

• Lên men carbohydrate tạo calcium lactate

• Thủy phân calcium lactate

• Tinh chế acid lactic

Acid lactic

Gđ lên men carbohydrate và trung hòa acid

C6H12O6 + Ca (OH)2 (2CH3CHOHCOO- ) Ca2+ 2H2O

Thủy phân calcium lactate

2(CH3CHOHCOO-) Ca2 + H2SO4 2 CH3CHOHCOOH + Ca SO4

Calcium lactate Lactic acid

Tinh chế acid lactic: giống pp hóa học

- Ester hóa bằng MeOH

- Thủy phân methyl lactate, thu acid lactic

Acid lactic

Tóm tắt các giai đoạn sản xuất bằng pp lên men:

- Lên men carbohydrate

- Lọc dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào

- Calcium sulfate không hòa tan được lọc bỏ

- Tinh chế acid lactic bằng thủy phân, ester hóa, chưngcất

Acid lactic

Quá trình lên men

sx acid lactic

Acid lactic

Cơ chế lên men: 02 cơ chế

• Phân giải đường theo con đường EM, sử dụng

enzyme aldolase Æ acid pyruvic

• Acid pyruvic Æ acid lactic

hợp sản phẩm gồm acid acetic, acid formic, CO2

• Phân giải đường theo con đường

hexosomonophosphate (HMP), sử dụng enzyme phosphoketolase

Acid lactic

Cơ chế lên men lactic đồng hình:

đường phân Embden - Mayerhoff (EM)

- Trong điều kiện kỵ khí, acid pyruvic Æ acid lactic do enzyme lactate dehydrogenase (LDH) xúc tác

- LDH qui định sản phẩm lên men là L(+) hay D(-) acid

lactic (do gen ldhL hay ldhD, tùy theo chủng vi khuẩn)

• Gen mã hóa enzyme L(+) LDH được nghiên cứu ở

L plantarum

• Gen mã hóa enzyme D(-) LDH được nghiên cứu ở

L johnsonii

Acid lactic

Nguyên liệu

- Lên men nhanh chóng và hoàn toàn từ các nguyênliệu rẻ tiền

- Sản xuất dạng đồng phân cần thiết với hiệu suất cao

- Ít sản phẩm phụ

Lactose Sucrose

Acid lactic

Nguyên liệu:

nấm men (5-15 g/l), mầm lúa mạch, peptone, thịt bò,

casein thủy phân

Acid lactic

Qui trình lên men: 02 qui trình chính cho hiệu suất cao

- Lên men liên tục

- Lên men từng lô mẻ

Acid lactic

Lên men liên tục

- Năng suất cao 117 g/l/h

- Cung cấp tế bào liên tục Æ gia tăng nồng độ acid lactic L(+) tinh khiết

- Nồng độ acid lactic thấp

- Mật độ tế bào cao Æ khuấy trộn môi trường khôngđều

Acid lactic

Thu hoạch acid lactic

- Dung dịch lên men có thể chứa acid lactic tinh khiết, hay dạng muối hoặc cả hai dạng

- 1 số phương pháp tách chiết acid lactic:

• Dùng dung môi

• Sắc ký trao đổi ion

• Sắc ký hấp phụ

• Chưng cất chân không

• Trao đổi qua màng

- Giảm pH 1,6 và chạy cột sắc ký với nhựa trao đổi

cation, rửa cột bằng H2SO4 loãng

Acid gluconic

Đại cương

- Năm 1870, Hlasiwetz và Habermann phát hiện

- Năm 1880, Boutroux tìm thấy các vi khuẩn sinh acid acetic có thể sản xuất acid gluconic

- Năm 1922, Molliard tìm thấy acid gluconic từ A niger

- Hiện nay, acid gluconic có thể sản xuất từ nhiều chủng

như Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter và

nhiều chủng nấm

• Dạng muối sắt: điều trị thiếu máu

• Dạng muối calci: điều trị thiếu calci

• Dạng muối kẽm: điều trị chứng lạnh run, lành vếtthương

-Ngành công nghiệp giấy, vải sợi, thức ăn gia súc,

Acid gluconic

Nhu cầu

- ~ 60.000 tấn/năm

- Dạng chủ yếu là muối Na, Ca

Sản xuất: có nhiều pp sản xuất acid gluconic

- PP hóa học

- PP điện hóa

- PP sinh hóa

- PP lên men

Acid gluconic

Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men

- A niger được sử dụng nhiều

- Hiện nay đang nghiên cứu Gluconobacter oxydans

- Vi khuẩn Pseudomonas cũng được dùng tuy nhiên có

nhiều sản phẩm phụ như 2-ketogluconat hay

2,5-diketogluconic acid

Acid gluconic

Tùy theo sản phẩm là Na hay Ca gluconat, qui trình lênmen sẽ khác nhau (nồng độ glucose, pH)

4% ở 30 o C 39,6% ở 30 o C

Độ hòa tan

> 15% Æ quá bão hòa Æ muối calci kết tủa Æ ngăn cản vận chuyển oxy

350 g/l Nồng độ glucose

CaCO3, vô khuẩn NaOH

Điều chỉnh pH

Calci gluconate Natri gluconate

Acid gluconic

Con đường lên men tạo acid gluconic từ glucose ở A

niger

Acid gluconic

A niger có khả năng sản xuất tất cả enzyme cần thiết

cho quá trình chuyển glucose Æ acid gluconic

catalase phân hủy H2O2 thành oxy và nước

Acid gluconic

Sản xuất acid gluconic bằng pp lên men

- Quá trình sản xuất acid gluconic ảnh hưởng trực tiếpbởi hoạt tính của enzyme glucose oxidase

Acid gluconic

Nguyên liệu lên men:

đường, dịch thủy phân tinh bột,…

Acid gluconic

Thu hoạch acid gluconic

- Lọc để loại bỏ sinh khối

- Trung hòa bằng Ca(OH)2 Æ Ca gluconate

- Tủa Ca gluconate bằng NaCl ở nhiệt độ lạnh

- Thêm H2SO4 Æ tạo tủa CaSO4

- Dịch còn lại chạy qua cột trao đổi cation để hấp phụ Ca

2+ còn sót lại

- Kết tinh acid gluconic ở -10 oC, có hoặc không có cồn

Acid citric

Đại cương

- Do nhà hóa học Thụy điển Carl Wihelm Scheele phânlập lần đầu tiên năm 1874

- Năm 1893, C Wehmer phát hiện nấm mốc Penicillium

có khả năng sản xuất acid citric

- Năm 1917, James Currie phát hiện A niger có thể sản

xuất acid citric hiệu quả

HOOC CH2 C CH2 COOH

OH COOH

Acid citric

Vai trò

chỉnh pH, chất điều vị, bảo quản; dạng muối Na, K, Ca dùng làm phẩm màu thực phẩm

• Tác dụng chống oxy hóa khi dùng phối hợp với acid ascorbic

• Điều chỉnh pH đường tiêu hóa

• Tăng độ hòa tan của thuốc phiện

Acid citric

Nhu cầu

- Sản xuất ~ 1,6 triệu tấn/năm

• 50% dùng trong ngành nước giải khát

• 20% dùng trong ngành thực phẩm

• 20% dùng trong các chất tẩy rửa

• 10% dùng trong các ngành khác như mỹ phẩm, dược phẩm, công nghiệp hóa học

- Nhu cầu tăng 2 – 3%/năm

- 90% a citric được sản xuất bằng pp lên men

Acid citric

Sản xuất bằng phương pháp lên men: gồm 03 giai đoạn

- Nuôi cấy giống

- Lên men

- Tinh chế sản phẩmSản xuất bằng phương pháp lên men: có 03 cách chính

- Lên men chìm

- Lên men bán lỏng

- Lên men trên môi trường rắn

Acid citric

Sản xuất acid bằng phương pháp lên men

- Aspergillus niger, A clavatus, A wentii, Penicillium

luteum, Mucor periformis, A fumaricus, A japonicus, Botrytis cinerea được sử dụng để sản xuất a citric

- Chủng A niger

• Hiệu suất cao

• Dễ bảo quản

• Có thể lên men từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền

- Khi sử dụng nấm mốc sản xuất a citric:

• Nhược điểm: sản phẩm phụ acid iso-citric

72 Saccarose

71,5 Tinh bột

Hiệu suất % Nguồn carbon

Acid citric

- Nguồn phospho:

• Nồng độ thấp Æ tăng hiệu suất

¾ Tác động trên hoạt tính enzyme, không ảnhhưởng đến quá trình biểu hiện gen

• Nồng độ cao Æ tạo sản phẩm phụ như a gluconic

- Nguồn nitơ:

• Muối ammonium, peptone, cao mạch nha, ,

• Acid ammonium Æ giảm pH Æ tăng hiệu suất

• Nồng độ nitơ: 0,1 – 0,4 g/l Nồng độ nitơ cao Æ

VSV tăng trưởng nhanh, tiêu thụ nhiều đường nhưnglượng a citric tạo ra giảm

Acid citric

- Ion kim loại: Cu2+ :150 mg/l, Zn2+: 0,5 mg/l, Mn2+: 3 mg/l

- Rượu: EtOH, MeOH, n-propanol, isopropanol,

• Bổ sung vào nguyên liệu tinh khiết Æ ức chế

• Bổ sung vào carbohydrate thô Æ kích thích

• Nồng độ: 1 – 5%: tùy thuộc chủng VSV và thànhphần môi trường

Acid citric

Một số yếu tố hóa học ảnh hưởng đến lên men a citric

• Tăng nồng độ oxy Æ tăng hiệu suất

• Nồng độ: 25%

Acid citric

Lên men chìm

- 80% a citric được sản xuất bằng pp này

- Cho môi trường vào các thùng lên men, vô trùng ở 110 – 120 oC

- Làm nguội tới 32 – 34 oC, bổ sung giống bào tử hoặcdịch nhân giống

- Nuôi ở 32 oC, khuấy và thổi khí liên tục Thời gian lênmen 6 - 7 ngày

-Thêm CaCO3 vào môi trường để giảm độ acid

- Sau khi kết thúc lên men, dùng H2SO4 để chuyển calcicitrat thành acid citric

Acid citric

Lên men bề mặt

- Là pp sản xuất a citric đầu tiên

- Hiện nay áp dụng để sx qui mô nhỏ

• Dụng cụ lên men là khay nhôm hoặc thép không rỉ

• Buồng lên men được cung cấp khí lọc vô trùng đểđảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, tránh ngoại nhiễm (các

nấm men, vi khuẩn lactic, Penicillium)

Acid citric

Lên men bề mặt

- Môi trường pha xong được lọc và vô trùng, cấy giốngbào tử, cho lên men trên các khay có lớp môi trường

dày khoảng 2 - 8 cm và có thổi khí đã lọc trên bề mặt

khay, nhiệt độ buồng lên men giữ ở 28 – 32 oC

- Có thể thực hiện qua hai bước có bổ sung đường:

• Nuôi mốc khoảng 48 - 60 giờ trên lớp môi trường 2

- 3 cm tạo thành màng mốc

• Bổ sung vào phía dưới dịch đường 12 - 13% (không

có muối khoáng) nâng lớp môi trường dày tới 8 cm

• Tiếp tục lên men 8 ngày

Acid citric

Thu hoạch acid citric: có 03 cách

- Kết tủa: được sử dụng nhiều nhất

- Chiết tách

- Hấp phụ: dùng nhựa trao đổi ion

-Tinh sạch citric acid qua các cột tẩy màu, trao đổi

cation, trao đổi anion và tẩy màu lần cuối

- Kết tinh

SẢN XUẤT ACID AMIN

Đại cương

- Tất cả 20 acid amin đã được bán trên thị trường, nhiều

nhất là acid glutamic, methionin, lysin

• Gluctamic và lysin được sản xuất bằng pp lên men

• Methionin được sx bằng pp tổng hợp hóa học

- Vai trò của acid amin:

• Ngành chăn nuôi gia súc: dinh dưỡng bổ sung

(lysin, methionin, threonin,…)

• Ngành công nghiệp thực phẩm: điều vị

(monosodium glutamic, acid aspartic, …)

• Ngành dược phẩm: thuốc bổ

Đại cương

- Acid amin được sản xuất chủ yếu tại Nhật bản, Mỹ,

Trung quốc, châu Âu, Hàn quốc

• Có nguồn gốc từ Nhật bản

• Chiết xuất từ 1 loại tảo biển

• 1908, Kikunae Ikeda (ĐH Tokyo) đã chiết tách

Đại cương

¾ Vào năm 1957, Kinoshita và cs đã phân lập từ mẫu

đất vi khuẩn Corynebacterium glutamicum có khả

năng sản xuất một lượng lớn acid glutamic

Đại cương

- 03 phương pháp sản xuất acid amin:

1 Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủyphân protein (L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-

asparagin, L-tyrosin)

2 Phương pháp tổng hợp hóa học (glycin, alanin, methionin, tryptophan)

3 Phương pháp lên men vi sinh vật

¾ Phương pháp hóa học thường cho hỗn hợpdạng đồng phân L và D-acid amin

Sản xuất acid amin bằng phương pháp lên men

Glucose 31

Brevibacterium lactofermentum No 487

L-valin

Glucose 18

Corynebacterium glutamicum Ps 20

L-tyrozin

Glucose 12

Corynebacterium glutamicum Px 115-97

L-tryptophan

Glucose Acetat Đường ăn

18 27 55

Brevibacterium flavum

L-prolin

Glucose 26

Corynebacterium glutamicum

L-ornithin

Glucose 2

Corynebacterium glutamicum

L-methionin

Glucose Glucose Acetat

39 57 75

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum FA 1 - 30 Brevibacterium flavum

L-lysin

Glucose 28

Brevibacterium lactofermentum

L-leucin

Glucose 10

Brevibacterium flavum

L-histidin

Glucose Acetat n-alkans

>100 98 82

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

Arthrobacter paraffineus

L-glutamic acid

Glucose 9

Corynebacterium glutamicum

L-phenylalanin

Glucose 35

Brevibacterium flavum

L-arginin

Glucose 9

Streptomyces coelicolor 3 - 19

L-alanin

Glucose 60

Microbacterium ammoniphilum

Dl-alanin

Nguồn carbon

Năng suất (g/l) Chủng sử dụng

Loại acid amin

Chủng vi sinh vật sản xuất acid amin bằng con đường lên men

Acid L- glutamic

Nguyên liệu:

Brevibacterium flavum, B lactofermentum, B

thiogenitalis, và Microbacterium ammoniaphilum

- Đặc điểm chung của các chủng này:

• Rỉ đường phế thải cũng được sử dụng vì rẻ tiền

nhưng chứa một lượng lớn biotin Æ ngăn cản tổnghợp glutamate

acid amin, khoáng chất, vitamin

Acid L- glutamic

Quá trình lên men:

- Thường áp dụng qui trình nuôi cấy liên tục

• Qui trình nuôi cấy theo lô mẻ: tất cả nguyên liệu chovào từ đầu Æ nồng độ đường cao hơn ~ 20% Æ

oxy hóa không hoàn toàn đường Æ giảm hiệu suất

- Qui trình:

• Hoạt hóa giống C glutamicum

• Nhân giống: 200 – 1.000 l Æ 10.000 – 20.000 l Ælên men 50.000 – 500.000 l

• Sau 14h, nhiệt độ tăng từ 32 -33 oC lên 38 oC, thờigian lên men ~ 36h

• Cung cấp glucose với nồng độ ≥ 160 g/l

• Sản lượng 100 g/l

Acid L- glutamic

Qui trình sản xuất sodium glutamate của Ajinomoto

L- lysine

Đại cương:

- Lysine được dùng để bổ sung thức ăn gia súc

- Sản xuất ~ 400.000 tấn/năm

- Corynebacterium glutamicum đột biến tự dưỡng

homoserine có khả năng sản xuất L- lysine

Điều hòa sinh tổng hợp lysine

L- lysine

Qui trình lên men:

Tương tự quá trình lên men L- glutamate

- Nguồn carbon: mật đường, rỉ đường

- Biotin: nếu nồng độ biotin ban đầu thấp Æ bổ sung lượng 30 μg/l

- Được sản xuất từ chủng E coli tái tổ hợp, có khả năng

đề kháng chất tương tự L- threonin là

α-amino-β-hydroxyvaleic acid (AHV)

L- threonine

Điều hòa sinh tổng hợp threonine ở E coli

L- aspartic

- Được dùng trong dược phẩm, thực phẩm

- Từ 1973, L- aspartic đã được sản xuất bằng pp nuôi

cấy cố định tế bào E coli tái tổ hợp trên các giá mang

polyacrylamide, polyurethane

- Aspartic được sản xuất từ fumarate và amonia, do enzyme aspartase xúc tác, pH 8,5

L- alanine

- L-alanine được dùng trong dịch truyền dinh dưỡng,

chất phụ gia có vị ngọt và tác dụng kiềm khuẩn

- L-alanine được tạo ra từ L-aspartate bằng phương

pháp một giai đoạn sử dụng enzyme aspartate

β-decarboxylase

L-aspartate Aspartate β-decarboxylase L-alanine + CO2

L- alanine

- Vi khuẩn Pseudomonas dacunhae được chọn làm

chủng vi khuẩn sử dụng trong sản xuất L-alanine vì cóhoạt tính aspartate β-decarboxylase cao

• L-alanine được sản xuất bằng cách cố định P

dacunhae trên K-carageenan

• Các vi khuẩn sau khi cố định được nhồi vào cột

Quá trình được tiến hành ở áp suất cao, ngăn ngừakhí carbonic thoát ra

• Cột này được nối tiếp với hệ thống sản xuất

L-aspartate Æ sản xuất L-alanine trực tiếp từ

fumarate

- Tuy nhiên trong hệ thống này, phản ứng phụ gây ra

bởi fumarase và alanine racemase ở cả hai vi khuẩn E

coli và P dacunhae Æ tạo sản phẩm phụ malate và

D-alanine Æ giảm hiệu suất

Æ Các enzym này bị bất hoạt bằng cách xử lý riêng tế

bào hai vi khuẩn ở nhiệt độ cao và pH thấp

L- alanine

L-aspartate Aspartate β-decarboxylase L-alanine + CO2 Fumarate + NH3 aspartase

malate D-alanine

L- cystein

- L-cystein được dùng làm hóa chất, dưỡng tóc, chấtphụ gia thực phẩm

- L-cystein có thể sản xuất :

• Chiết xuất lông tóc

• Bằng enzyme từ L-cysteine từ thiazoline-4-carboxylate (DL-ATC)

DL-2-amino-Δ2-• Vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum

L- cystein

- Sản xuất cystein bằng enzyme DATC racemase,

L-ATC hydrolase, S-carabamoyl-L-cysteine (SCC)

- Thêm hydroxylamine (chất ức chế các enzyme phụ

thuộc vitamin B6) Æ ngăn cản sự thoái hóa L- cystein do

L- DOPA

- L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) là tiền chất

của chất trung gian dẫn truyền thần kinh dopamine

- Được dùng trong điều trị bệnh Parkinson, bệnh do sựthiếu hụt dopamin trong não

- L-DOPA được sản xuất khoảng 250 tấn/năm

- Phương pháp sản xuất:

• Phương pháp hóa học: gồm 8 giai đoạn phản ứng

• Phương pháp dùng enzym là phương pháp một giaiđoạn đơn giản và kinh tế nhất