hóa sinh thực phẩm emzyme protease

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số nghànhsản xuất như: chế biến thực phẩm đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm tron

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẻ của Công nghệ sinh học các chếphẩm của enzym được sản xuất ngày càng nhiều và đươc sử dụng hầu hết trong cáclĩnh vực như: chế phẩm thưc phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi , y tế, Hàng nămlượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300.000 tấn với trên 500 triệuUSD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzym được sản xuất ở quy mô công nghiệp điều thuộc loại enzymđơn cấu tử, xúc tác cho các phản ứng phân huỷ Khoảng 75% chế phẩm enzym làthuỷ phân được sử dụng cho việc tuỷ phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số nghànhsản xuất như: chế biến thực phẩm( đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung

để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chếbiến thực phẩm )

Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như một nguồn cung cấpprotease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiềuhơn

I. TỔNG QUAN VỀ EMZYME PROTEASE

1.Giới thiệu chung:

Protease cần thiết cho các vi sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào,cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi từ vi sinh vật( vi khuẩn,virut, nấm ) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) và động vật ( gan, dạ dày bê, ) So vớiprotease ở động vật và thực vật thì protease ở vi sinh vật có những đặt điểm khácbiệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiềuenzyme giống nhau về cấu trúc , khối lượng và hình dạng phân tử trên rất khó tách

1.2 Phân loại protease

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3

Protease được phân loại làm 2 loại: endopeptidase và exdopeptidase

Sơ đồ phân loại protease

(E.C.3.4)

Endopeptidase (E.C.3.4.21-99)

Exopeptidase

(E.C.3.4.11-17)

Aspartic proteidase

Metallo proteidase

Protease được chia thành 2 loại : Endopeptidase và Exopeptidase

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗipolypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốnnhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serinetrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúctác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisinCarlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùngkiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinasethường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động vàthường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase

thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng củaEDTA.

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

II NGUỒN CUNG CẤP

Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi vềkinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme vớihiệu suất cao

Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhậnprotease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

- Động vật : Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc

dạ dày, niêm mạc ruột non, tuyến tụy…)

Vd: Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao Chymosin

“rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi

Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, protease động vật ít thuậnlợi do sản xuất chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớnlắm

- Thực vật : Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chếphẩm enzyme quan trọng

Vd : + Papain thu từ mủ đu đủ xanh

+ Bromelin từ than cây dứa

+ Ficin tách từ dịch ép thân cây sung

Lượng enzyme thu được từ các nguyên liệu thực vật không lớn lắm so vớilượng nhiên liệu tiêu hao

Hình 2.1 Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật

- Vi sinh vật :Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng dùng nguyên liệutrong sản xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và côngnghệ Vì vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế trên

+ Nguồn nguyên liệu vô hạn

+ Hệ enzyme phong phú

+ Hoạt tính mạnh

+ Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống

+ Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh

+ Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền

Các protease từ vi sinh vật được ứng dụng nhiều :

Thường sử dụng protease của vi khuẩn và nấm sợi

– Protease kiềm (EC.3.4.21.14) : Còn có tên thương mại là SUBTILISIN

Có khoảng pH hoạt động là 7 – 11 Trong trung tâm hoạt động có serine Chế phẩmdạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1 – 6 đơn vị Anson/gram Dạng kết tinh có hoạt

tính khoảng 25-30 đơn vị Anson/ Gram Ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩyrửa.

– Protease trung tính ( EC.3.4.24.4) : Protease trung tính là metalloenzym

có pH hoạt động từ 6-9 Được sản xuất từ Bacillus subtilic, B thermoproteolycus

và Streptomycesgriceus Chế phẩm thương mại là dạng bột có hoạt tính 0.5-2 đơn

vị anson/1gam Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bia, da và protein thuỷ ngân

- Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thuộc protease acid, kiềm vàcảtrung tính Ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo và thuộc da

• Cấu trúc trung tâm hoạt động(TTHĐ) của protease

Trong trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật

(VSV) ngoài gốc acid amin(a.a) đặc trưng cho từng nhóm còn có một số a.akhác các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vậtcho phép rút ra một số nhận xét như sau:

- TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc a.a và trong một sốtrường hợp còn có cả các cofactơ kim loại

+Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn khoảng 21A°, có thể phân biệtthành 6 phần dưới TTHĐ(subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt độngtương ứng mỗi gốc a.a trong phân tử cơ chất

+Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ củacác tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấyphân tử của các phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hỡ vàokhoảng 20A° Khe hỡ này là phần xúc tác của các enzyme các gốc asp-35

và asp- 215 xếp đối diện nhau trong khe ấy

- Đối với các protease không chứa cysteine , TTHĐ của chúng có tìnhmềm dẽo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bỡicác cấu disulphide

- Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzymenàyđều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptid theo cung 1 cơchế chung như sau

E+S emzyme- S emzyme- S +P1 emzyme +P2

Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Tách và làm sạch chế phẩm enzimMôi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzim

Trong đó :E: emzyme

S : cơ chất emzyme- S: phức chất enzyme- cơ chất P1, P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 của phản ứng

III THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT

3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạnchủ yếu

Hình 3.1 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme

3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.

Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta

có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biếntác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành cácbiến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, caohơn hẳn chủng gốc ban đầu

3.1.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đãđược kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu

ý đến điều kiện bảo quản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thờigian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấychuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu

• Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trênmôi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy

và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốtcần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại Khi cấychuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng

để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thểgây biến đổi bất lợi không thể lường hết được) Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảoquản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng

Hình 3.2 Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

• Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cảđều được khử trùng cẩn thận) Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triểntiếp tục của giống khi bảo quản Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảoquản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống

có thể được 1 năm

Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền.Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đốingắn

• Phương pháp đông khô

Hình 3.3 Đông khô vi sinh vật.

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ởtrạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp

và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước vàcuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môitrường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao chobảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn vàmột số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vậtnguyên sinh và tế bào động vật

• Phương pháp bảo quản lạnh sâu:

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trongmôi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt

ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C)

Hình 3.4 Bảo quản lạnh sâu

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh vàlàm tan mẫu Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở cácthang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C Nóichung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muốicao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiềunhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương phápvạn năng hơn cả

Hình 3.5 Bảo quản trong nitơ lỏng.

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease.

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnhhưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trongthành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bìnhthường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôithường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,

Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

3.1.4 Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme.

Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên

 Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xácđịnh (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột,xenluloza, đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Loại môi trường nàyđược sử dụng cho mục đích nghiên cứu

 Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa cácnguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng Mặt khác, cácnguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệpsản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Các nguyên liệu để chuẩn bị làmmôi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoaquả, rau, khô dầu, bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõingô Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điềuhoà sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấythông thường từ 25 - 300C Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môitrường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme,nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi visinh vật

3.1.5 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia làtrấu Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không cónhững chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệ các chất phụgia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được

thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO),photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô,nước lọc bã rượu.

 Quy trình công nghệ:

Nguyên liệu  Trộn  Làm ẩm  Thanh trùng bằng nhiệt  Lam nguội, tơi Gieo giống vsv  Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy  Nuôi cấy, theo dõi, xử lý

• Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong

đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất cacbon

là đường glucoza, saccharoza Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá sơ bộtinh bột trước khi thanh trùng Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảmứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn vàsục khí

Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ởcác khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy,không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môitrường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất

3.1.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi

là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vậttiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular) Enzyme visinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng củacác cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên