1999[17], từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm
Trang 1ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
- -
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN
PHÂN CỰC CỦA CAO ACETONE THÔ
TỪ LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA TSAVOENSE
Trang 2Xác nhận của Hội đồng phản biện:
KÍ TÊN VÀ DUYỆT
(Kí và ghi rõ họ tên)
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế để đạt được thành công, ngoài sự nổ lực, phấn đấu của bản thân, luôn luôn cần có sự giúp đỡ, hỗ trợ dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp của những người xung quanh Để hoàn thành bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Hóa Học – Trường Đại học Sư Phạm TP.HCM đã cũng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường Đặc biệt,
em xin chân thành cảm ơn Thầy TS Dương Thúc Huy, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài, hơn nữa thầy còn là người giúp em có thêm niềm say
mê nghiên cứu khoa học Nếu không có sự hướng dẫn, giúp đỡ của Thầy thì bài báo cáo khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa xin chân thành cảm ơn Thầy
Ngoài ra, không thể không nhắc đến các anh chị khóa trên, các bạn sinh viên bộ môn hóa Hữu Cơ ở khoa Hóa học, những người đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài
Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình, những người thân, đã là chổ dựa vững chắc về tinh thần trong suốt quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đề tài
Do bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian khá ngắn nên không thể tránh khỏi sự sai sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô
để em có thêm kinh nghiệm ở các bài báo cáo sau được hoàn thiện hơn
Sau cùng, xin chúc quý Thầy Cô và các bạn thật dồi dào sức khỏe!
Trang 4DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
br Mũi dãn rộng (Broad)
AcOH Acetic acid
DMSO Dimethyl sulfoxide
d Mũi đôi (Doublet)
EA Ethyl acetate
HMBC Tương quan 1
H-13C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC Tương quan 1
H-13C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation)
IC50 Nồng độ ức chế sự phát triển của 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal
Inhibitory Concentration)
J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin)
m Mũi đa (Multiplet)
MIC Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của tế bào (Minimum Inhibitory
Concentration) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) N.D Không xác định (Not determined)
pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography)
s Mũi đơn (Singlet)
SKC Sắc ký cột
δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học)
Trang 5DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y
Hình 1.2 Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema
Hình 2.1 Sơ đồ sắc ký cột trên cao acetone
Hình 3.1 Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của T3
Hình 3.2 Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của N3
Hình 4.1 Cấu trúc của hai hợp chất đã cô lập
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao
Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y
Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y
Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y
Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất parmosidone F, T3, parmosidone G
và N3
DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Phổ 1H và 13H-NMR của hợp chất T3
Phụ lục 2 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất T3
Phụ lục 3 Phổ 1H và 13C -NMR của hợp chất N3
Phụ lục 4 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất N3
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH iii
DANH MỤC BẢNG iii
DANH MỤC PHỤ LỤC iii
MỤC LỤC iv
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2
1.1. Định nghĩa và phân loại địa y 2
1.2. Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y 2
1.3. Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y 3
1.4. Nghiên cứu hoá học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema 3
1.5. Nghiên cứu hóa trên loài địa y Parmotrema tsavoense 6
1.6. Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y 9
1.6.1. Hoạt tính đối với động vật 10
1.6.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 10
1.6.3. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y 11
1.6.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y 11
1.6.5. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y 12
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 15
2.1. Máy móc, thiết bị, hóa chất 15
2.2. Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất 15
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
Trang 73.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất T3 17
3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất N3 18
CHƯƠNG 4 KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 21
4.1. KẾT LUẬN 21
4.2. ĐỀ XUẤT 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
PHỤ LỤC 25
Trang 8LỜI MỞ ĐẦU
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm Địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều kiện khắc nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy
sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng
Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh Y học cổ truyền Trung Quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9 họ) với
mục đích làm thuốc chữa bệnh Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae
được sử dụng nhiều hơn hết Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị các
bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Xanthoria parientina chữa bệnh vàng da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Ireland moss)
chữa nhiễm khuẩn và tiêu chảy.Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa
Theo các tác giả Boustie et al (2005)[1], Muller et al (2001)[22], Huneck et al (1999)[17], từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme…
Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về
chi Parmotrema trong nước cũng như nghiên cứu hóa học trên loài địa y Parmotrema
tsavoense (Huynh BLC, Duong et al)[4], chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên loài địa y
Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow nhằm cô lập các hợp các
hợp chất phenolic có nhiều hoạt tính sinh học
Trang 9CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Định nghĩa và phân loại địa y
Địa y là một dạng thực vật bậc thấp, đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm
(mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi
khuẩn lam (cyanobacterium) Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy
Thông thường địa y chia làm 3 dạng (Choi et al., 2008)[30]:
Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ
độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi et al., 2008)[30]
Ðể hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nấm Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn
1.2 Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y
Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao
Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại
Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi et al., 2008)[30]
Trang 10 Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng
1.3 Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y
Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata et al đề nghị (Huneck 1997)[12]:
Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2)
Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic
Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid
Nguồn gốc acetate-malonate: các acid dây dài và các acid phenol
1.4 Nghiên cứu hoá học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema
Parmotrema praesorediosum
(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập bởi David F et al (1990)[6] Lecanoric acid (14) và stictic acid (18) được cô lập bởi Ramesh P et al (1994)[29].
Huynh B L Chi et al đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và
Trang 118-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one (41), gyrophoric acid (13), lecanoric acid (14), orsellinic acid (4),
methyl orsellinate (5), methyl β-orsellinate (8), methyl haematomate (9) và ba hợp chất
bicyclo mới Sancti A-C (43-45)
Parmotrema conformatum
Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid (40)
được cô lập bởi Keogh M F (1977)[17]
Parmotrema dilatum
Depside atranorin (11), các depsidone salazinic acid (16), norstictic acid (19),
hypostictic acid (20) và protocetraric acid (21) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi
Honda N K et al (2010)[11]
Pamotrema lichexanthonicum
Depside atranorin (11), depsidone salazinic acid (16) và xanthone lichexanthone
(40) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi
2′′′-O-methyl-α-dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30), parmosidone B (31), parmosidone C
(32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34), β-alectoronic acid (36),
2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và
skyrin (41) được cô lập từ loài địa y Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi
Lê Hoàng Duy (2012)[20]
Parmotrema nilgherrense
Trang 12α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29) được
cô lập bởi Kharel M K et al (2000)[18]
Depside atranorin (11) được cô lập bởi Neeraj V et al (2011)[24]
Parmotrema planatilobatum
Năm 2011, Dương T Huy et al đã cô lập được 7 hợp chất gồm có methyl
β-orsellinate (8), methyl β-orsellinate (5), orsellinic acid (4), methyl haematommate (9),
atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39)[7]
Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21),
9’-O-methylprotocetraric acid (22), methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương T
2-[3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6-Huy et al.[8]
Parmotrema reticulatum
Atranorin (11), chloroatranorin (12), salazinic acid (16) và consalazinic acid (17)
được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A T et al (2009)[9]
Parmotrema saccatilobum
Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao n-hexane của loài địa y
Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T S et al (2009)[5]
Parmotrema stuppeum
Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14) được
cô lập bởi Jayaprakasha G K et al (2000)[16]
Parmotrema subisidiosum
Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid (17)
được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D G et al (1980)[25]
Parmotrema tinctorum
Isolecanoric acid (15) được cô lập bởi Sakurai A et al (1987)[26]
Ethyl orsellinate (6) được cô lập bởi Santos L C et al (2004)[28]
Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N K et al (2013)[3]
Trang 131.5 Nghiên cứu hóa trên loài địa y Parmotrema tsavoense
Các acid béo
Hợp chất phenolic đơn vòng
Hình 2.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema
Trang 14Depside
Depsidone
Hình 2.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)
Trang 15Diphenylethers
Hình 2.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)
Trang 161.6 Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y
Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên.Lê Hoàng Duy(2012)[19] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10% trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên
Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy
Hình 2.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)
Trang 17đủ của Boustie (2010)[2], Huneck (1999)[13], Muller (2001)[22] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …
1.6.1 Hoạt tính đối với động vật
Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và
Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia
Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis
Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromic acid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid và usnic acid làm giảm sự tăng trưởng
của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của
chúng
1.6.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao
Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao như sau Bảng 1.1
Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao
Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính
4-O-demethylbarbatic, acid diffractaic, acid
evernic, acid lecanoric, acid
β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic
Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp
Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật
Acid evernic Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau
bina
Allium cepa
Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật
Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium
cepa
Lepidium sativum
Trang 181.6.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chất địa y
Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hypericin
có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc (Muller 2001)[22] Depside và depsidone có hoạt tính ức chế sự sao chép của virus HIV (do enzyme gọi là intergrase) (Boustie 2005) [1] Neamati et al đề nghị hoạt
tính này xuất phát từ đặc điểm cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one của
depsidone Depside có hoạt tính khá yếu trong khi những β-depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cùng cho những khả năng tương đương, cụ thể với giá trị IC50 khoảng 3 µM Các β-depsidone khác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt tính với giá trị IC50 khoảng vài µM Acid béo loại γ-butyrolactone cũng có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV với giá trị IC50 khoảng 24 µM (Bảng 1.2) (Muller 2001)[22]
1.6.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y
Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả
Protolichesterinic acid được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid
này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[22] Một số lượng lớn các hợp chât địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic acid, leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn xuất, usnic acid và dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[22] Khả năng kháng nấm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [2] Trong các hợp chất địa y, usnic acid và dẫn xuất của
nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn
