Enzym cắt giới hạn Restriction enzyme

• Năm 60’s, enzyme methylase được phát hiện trong vi khuẩn.. Enzyme cắt giới hạn • DNA được methyl hóa sẽ được bảo vệ khỏi sự cắt nhỏ bởi các enzyme của vi khuẩn.. – Endonuclease enzyme

Enzyme cắt giới hạn

Lab 5 – Khoa Y SHPT

Nguồn gốc

• Lần đầu được phát hiện khi bacteriophage λ có thể xâm nhiễm một vài dòng khuẩn mới nhưng vô hại ở trong dòng khuẩn đầu tiên (1)

• Sự khác biệt có liên quan đến sự methyl hóa trên một số base của DNA virus

• Năm 60’s, enzyme methylase được phát hiện

trong vi khuẩn

– Methyl hóa trên A hay C của một vài đoạn DNA cụ thể

• Sự methyl hóa là cơ chế giải thích cho (1)

Enzyme cắt giới hạn

• DNA được methyl hóa sẽ được bảo vệ khỏi sự cắt nhỏ bởi các enzyme của vi khuẩn

– Endonuclease enzyme – enzyme nội bào

• Vì sự hoạt động của enzyme endonuclease

làm giới hạn số lượng vi khuẩn mà phage λ có thể tấn công nên chúng có tên là “Enzyme giới hạn”

Vị trí nhận biết của RE

• Khoảng từ 4 – 12 bp

• Thường là palindromic

• Ở một vài trường hợp RE, các base có thể khác biệt

Palindromic

Phân loại RE

Loại I Loại II Loại III Cấu trúc

protein

3 sub-unit khác nhau HsdR,S,M

2 sub-unit giống nhau

2 sub-unit khác nhau Mod vs Res

Vị trí cắt Cách VTNB

>100 bp

Trong VTNB Cách VTNB

20-30 bp

Methyl

hóa

Co-factor ATP, SAM,

Mg 2+

Mg 2+ hoặc

Mn 2+

ATP (không thủy phân), SAM, Mg 2+

SAM

Tên gọi của RE

Enzyme EcoRI

Viết tắt Ý nghĩa Ghi chú

E Escherichia Giống (genus)

co coli Loài (specific epithet)

I Được phát hiện đầu

tiên

Thứ tự được phát hiện

trong

Bài thực hành

Công cụ:

• Găng tay

• Micropipette loại 1-10 μl và 10-100 μl

• Ống microcentrifuge 0.5 ml (hoặc 1.5 ml)

• Tủ ấm 37 o C

• Cốc/flask loại 500 ml

• Lò vi song

• Máy điện di:

– Buồng đệm (buồng điện di)

– Khuôn gel

– Lược

– Điện cực và dây điện có phân loại dành cho Anode/Cathode – Máy đọc gel

Nguyên liệu:

• Sản phẩm PCR của nhóm

• Enzyme cắt giới hạn EcoRI

• Double-distilled H2O (ddH2O)

• Agarose

• Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

• Dung dịch tải mẫu (6x)

• Dung dịch Ethidium bromide (EtBr) 10 mg/ml

• Marker và các chứng

Tiến hành thí nghiệm

1 Làm 150 ml, 1.2% agarose gel Để ở nhiệt độ phòng cho đông lại

<Nội dung thực hành lab 4>

2 Thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn với tổng thể tích là 25 μl

trong tube quay ly tâm 0.5 ml:

- 20 μl sản phẩm PCR đã được tinh sạch với nồng độ khoảng 30 ng

- 0.5-1 μl Enzyme EcoRI (tùy vào NSX, tùy vào Unit của Enzyme)

- 2.5 µl dung dịch đệm cho enzyme EcoRI 10x

- Pipette ddH2O cho đúng volume (25 µl)

3 Đậy nắp tube và ủ tube ở nhiệt 37 o C trong 5 phút

4 Pipette 5 µl dung dịch tải mẫu (6x) vào trong mẫu cắt giới hạn

5 Chuẩn bị điện di sử dụng Agarose gel ở bước (1)

6 Tải mẫu vào giếng và chạy điện di

7 Phân tích kết quả

Bài trên lớp

Q1:

BamHI cắt

BclI

1 Dự đoán kết quả nếu đoạn DNA sau được cắt bởi BamHI, BclI và BamHI & BclI

2 Hãy viết ra kết quả DNA nếu dùng enzyme ligase để nối sản phẩm cắt của BamHI và BclI

3 Có thể cắt sản phẩm DNA của (2) bằng

enzyme BamHI hay BclI không? Tại sao?

Q2 Bé Tem thực hiện cắt giới hạn plasmid pET2B bằng enzyme EcoRI, HindIII và kết quả của gel electrophoresis như hình Hãy tìm vị trí nhận biết của EcoRI và HindIII, với các tỉ lệ khoảng cách tương ứng

Q3 Tìm vị trí các VTNB của đoạn DNA

sau

Bài thu hoạch

1 Enzyme cắt nội bào khác với enzyme cắt ngoại bào như thế nào?

2 Nêu 5 lý do tại sao KHÔNG có kết quả cắt giới hạn?

3 Hãy vẽ bản đồ cắt giới hạn của DNA sau