Nghiên cứu vị trí đa hình đơn nucleotide (rs221634 a t) của gen lin28b trên mẫu u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật emzym cắt giới hạn

HỒ CHÍ MINHBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU VỊ TRÍ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE rs221634 A>T CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH B

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU VỊ TRÍ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (rs221634 A>T) CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN

KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN

s 


C ủ ề t Tiế sĩ Bùi Chí Bảo

.

T H C t 6 2 1

.

ỤC LỤC

NH S H NH NG THÀNH VI N TH GI NGHI N U i

ii

NH H VI T TẮT iii

DANH MUC HÌNH iv

DANH M C BẢNG v

BÁO CÁO THỐNG KÊ vi

h ng I HƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

h ng II PHƯƠNG PH P 4

1 Nguồn mẫu 4

2 Thiết kế th nghiệm 4

3 L a ch n và kiểu gen SNP SNP qu n t m li n qu n ến NB c xuất bản trong một bài báo (He et al., 2016) rs221634 A> T 4

4 Thiết kế mồi 5

5 Enzyme cắt h n chế 5

6 Phân lập DNA bộ gen từ máu toàn phần 6

7 Trình t Sanger 6

h ng III K T QUẢ 8

1 Kết quả chuẩn hoá sản phẩm PCR 8

1.1 ịnh tính và chất l ng mẫu DNA 8

1.2 nh gi mẫu ch y PCR với mồi thiết kế 8

1.3 Kết quả chuẩn hoá sản phẩm RFLP 9

1.4 Kiểm ịnh kết quả kiểu gen qua giải trình t Sanger 12

1.5 T ng qu n kiểu gen trong quần thể UNBTK 13

h ng IV THẢO LUẬN – K T LUẬN 15

h ng V K T LUẬN 18

T i liệu th m khảo 19

.

DANH ỤC CH VIẾT TẮT

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP: Single nucleotide polymorphism

NB: Neuroblastoma

UNBTK: U nguyên bào thần kinh

LIN28B: Lin-28 Homolog B

GWAS: Genome-wide association study

OR: odds ratios

I: onfi en e interv l

.

i PCR bằng enzyme SspI, s u khi iện di (A) tối u hó khối l ng sản phẩm PCR và

n ớc không có nuclease Lan 1: thang 1 kb; ở lan 2-4: một mẫu ối ch ng (C8) cho thờigian k khác nhau, từ 1 ến 3 giờ (B) tối u hó khối l ng sản phẩm P R, n ớc không

có nuclease và enzyme SspI Lan 1: thang 1 kb; Lan 2-4: mẫu ối ch ng (C8) cho thờigian khác nhau, từ 1 ến 3 giờ 11Hình 5 Kiểu gen PCR-RFLP c h nh IN28B rs221634 > T ( ) ẫu RFLP c asáu mẫu DNA sau khi tiêu hóa các sản phẩm khuế h i PCR bằng enzyme SspI, sau khiiện di Ngõ 1: thang 1kb; ngõ 2-4: mẫu NB; ngõ 5-7: mẫu ối ch ng; ngõ 8-10: kiểmsoát tích c c xác nhận bởi Sanger Sequences; ngõ 11: Sản phẩm PCR không h nchế enzyme; ngõ 12: kiểm soát âm tính (dH2O thay vì DNA mẫu) (B) Kiểu gen AA, AT,

TT c x ịnh theo các mẫu h n chế qu n s t c 12Hình 6 Phân tích trình t S nger ( ), (B) v ( ) t ng ng với trình t DNA t i vùngUTR tr n gen IN28B mũi t n hỉ ra các kiểu gen AA, AT và TT ở * 1430, t ng

ng cho rs221634 LIN28B 13

.

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thông tin di truyền c SNPs c ch n 4Bảng 2: Trình t mồi s d ng 5Bảng 3 Các thành phần trong tối u hó xét nghiệm RFLP 9Bảng 4 Tần số kiểu gen c IN28B rs221634 /T trong tr ờng h p u nguyên bàothần kinh và kiểm so t kh ng g y ung th 14Bảng 5 Tần số kiểu gen c IN28B rs221634 > T trong tr ờng h p u nguyên bàothần kinh với các thông số lâm sàng 14

.

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VIỆT NAM

ộc lập - T do - H nh phúc

y t 2 BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I THÔNG TIN CHUNG

1 T ề tài:

NGHIÊN C U VỊ TRÍ HÌNH ƠN NU EOTI E (rs221634 >T) ỦA GENLIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYMCẮT GIỚI HẠN

2 C ủ vụ:

H và tên: BÙI CHÍ BẢO

Ng y, th ng, năm sinh: Nam/ Nữ: Nam

H c hàm, h c vị: Tiến sĩ

Ch c danh khoa h c: Không Ch c v : Nghiên c u viên

iện tho i: Tổ ch c: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không

Tên tổ ch c ch trì nhiệm v : i h Y c Thành phố Hồ Chí Minh

iện tho i: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304

E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn

Website: http://yds.edu.vn/yds2/

ịa chỉ: 217 Hồng B ng, ph ờng 11, quận 5, TP.HCM

4 T cơ qua c ủ quả ề t i h Y th nh phố Hồ hí inh

1 T n Kho hoặ Trung t m, n vị - n i quản lý tr tiếp nh n l m h nhiệm ề t i

.

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hi n nhi m vụ:

- Theo H p ồng ã ký kết: từ th ng 6 năm 2018 ến th ng 6 năm 2019

- Th c tế th c hiện: từ th ng 6 năm 2018 ến th ng 6 năm 2019

- c gia h n (nếu có): Không

Thời gian

(Th ng, năm)

Kinh phí(Tr )

Thời gian(Tháng, năm)

Kinh phí(Tr )

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

- ý o th y ổi (nếu có):

4 Cá nhân tham gia thực hi n nhi m vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Bùi Chí Bảo Bùi Chí Bảo Ch nhiệm ề

tài2

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

Theo kế

ho ch

Th c tế t

c

1 Thu nhận mẫu mô từ bệnh nhân 4-5 /2018 4-5 /2018

2 Tách chiết DNA tu mẫu mô 6-7 /2018 6-7 /2018

3 Thiết kế mồi chuyên biệt cho vị

trí SNP rs221634 c a gene 7-9 /2018 7-9 /2018

4 Khuế h i gene LIN28B bằng

cặp mồi ặt hiệu 10-11 /2018 10-11 /2018

5 Chuẩn hóa quy trình s d ng

enzym cắt giới h n cho SNP

8 Viết báo cáo và tiến hành

nghiệm thu ề tài 3-4 /2019 3-4 /2019

- ý o th y ổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩ H&CN tạo ra:

Thực tế đạt được

.

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo

kế ho ch

Th c tế

t c1

Theo

kế ho ch

Th c tế

t c1

2 Đ về hi u quả do ề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa h c và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

3 Tình hình thực hi n chế ộ báo cáo, kiểm tra của ề tài:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo tiến ộ

C ƣơ I GIỚI THIỆU

U nguyên bào thần kinh là một bệnh ung th ở trẻ em gây t vong phổ biến, chiếm

~ 10% t vong o ung th Nó bắt nguồn từ hệ thống thần kinh giao cảm ng ph t triển(Matthay et al., 2016) Vị trí phổ biến nhất cho u nguyên bào thần kinh bắt nguồn (nghĩ

là khối u nguyên phát) là ở tuyến th ng thận iều này xảy ra ở 40% các khối u c c bộ

v trong 60% tr ờng h p bệnh lan rộng U nguyên bào thần kinh ũng ó thể pháttriển bất c n i n o c theo chuỗi hệ thống thần kinh giao cảm từ cổ ến x ng hậu.Các tần suất ở các vị trí khác nhau bao gồm: cổ (1%), ng c (19%), b ng (30% khôngtuyến th ng thận) hoặ x ng hậu (1%) Trong những tr ờng h p hiếm hoi, không cókhối u nguyên phát nào có thể c phân biệt Ủy ban hệ thống phân lo i u nguyên bàothần kinh quốc tế (INSS) và Hệ thống phân lo i nhóm nguy u nguy n b o thần kinhquốc tế (INRGSS) là hệ thống phân lo i trong u nguyên bào thần kinh (Monclair et al.,2009) Theo INRGSS, chỉ có hệ thống phân lo i tiền x lý là bắt buộc về s hiện diệnhoặc vắng mặt c a các yếu tố r i ro x ịnh bằng hình ảnh (I RF) Th ng th ờng,trẻ em c chẩn o n mắc u nguyên bào thần kinh nguy o kiến sẽ iều trị

ộc tế b o ph ng th c chuyên sâu và gần y, iều trị bằng liệu pháp miễn dịch tiêntiến (Kiyonari, 2015) Tuy nhiên, tỷ lệ sống hiện t i vẫn ới 50% nh ấu s cần thiếtphải iều trị hiệu quả h n

Những nỗ l c nghiên c u hiệp hội trên toàn bộ bộ gen (GW S) ã l m nổi bật cáchiệp hội di truyền ng kể góp phần vào tính nh y cảm trong o n hệ NeuroblastomaConsortium D tr n sở dữ liệu GWAS hiện t i, s khởi ầu và hình thành NB có thể

bị ảnh h ởng bởi len h nh h năng tr n gen li n qu n Thú vị h n, ít nhất

m ời hai hiệp hội di truyền ã x ịnh và xác nhận Nhiều trong số gen cthành lập này có ảnh h ởng g y ung th hoặc ch năng c chế khối u Một số gen nh ycảm NB nh O1, H E1, IN28B, S 15 / S 14, B R 1 góp phần gây rabệnh nguy o v một số yếu tố nguy thấp nh USP12, X4, I 31R ,

HS 17B12 ã c th c hiện và chỉ r trong sở dữ liệu c a GWAS (Matth , 2016).

.

Việc mở rộng từ nghiên c u tiền ề c minh h a bởi He (He et al., 2016) th c hiệntrên cỡ mẫu t ng ối nhỏ h n 256 tr ờng h p NB và kiểm soát 531 trẻ em miềnNam Trung Quốc Bốn d ng h nh ó khả năng tr n gen IN28B l kiểu gen ó ph ngpháp Taqman, theo trình t , kết quả chỉ ra rs221634 A> T và kiểu gen rs221634 TT cthể c phát âm có liên quan nhiều h n ến nguy NB tăng l n trong o c Hán.Gen LIN28B nằm trên nhiễm sắc thể 6q21, bao gồm bảy exon v t ng ồng LIN28A

c mã hóa cho các protein thuộc h lin-28, ặ tr ng bởi s hiện diện c a miền sốc

l nh (CSD) và một cặp CysCysHisCys (CCHC) miền ngón tay kẽm ho ến nay, bằng

ch ng liên quan ã xuất hiện cho thấy vai trò quan tr ng c a LIN28B góp phần hìnhthành và phát triển một số l ng ng kể bệnh ung th ở ng ời (Zhou, Ng, & Chng,2013) ặc biệt, LIN28B, kết h p với NANOG, OCT4 và SOX2, duy trì tr ng th inăng a tế bào gốc phôi và thậm chí giúp tái lập trình các tế bào biệt hóa thành tế b onăng trong ống nghiệm (Yu et al., 2007) Ngoài ra, LIN28B ảnh h ởng ến tính nh ycảm c a u nguyên bào thần kinh và biểu hiện bệnh thông qua một tầng tín hiệu gây ung

th ph c t p m ng ến khả năng n thiệp iều trị trong t ng l i ó h n l c, proteinLIN28B ho t ộng nh một chất c chế tr ớc thông qua việ ngăn hặn quá trình từ tiềnchất let-7 th nh miRN ho phép 7 tr ởng thành có nhiều on ờng khác nhau Hlet-7 óng một vai trò trong x lý c chế khối u thông qua việc làm im lặng các gen gâyung th h chốt (nh gen R S, Y , Ks) v ặ tr ng bởi s iều hòa giảmtrong m ung th (Powers et l , 2016) Biểu hiện thấp c gi nh let-7 nhấn m nh

tỷ lệ sống sót trong khuynh h ớng c a u nguyên bào thần kinh S khuế h i c a genMYCN, thuộc h Y , c tìm thấy trong khoảng 25% tr ờng h p v t ng qu n

m nh với bệnh ó nguy o ũng nh bệnh nhân lâm sàng kém Khuế h i MYCN

c g i chung là dấu hiệu phổ biến nhất c s d ng trong nguy u nguy n b o thầnkinh Gen n y c biết ến nh một yếu tố phi n mã iều chỉnh s tăng sinh tế bào, chu

kỳ tế bào và quá trình t h y Hiện t i, l u ý, gen IN28B c thành lập ũng c xácịnh có ảnh h ởng ến biểu hiện RAN oncogene trong m ng báo hiệu LIN28B-RAN-AURKA (Schnepp et al., 2015) RAN, một thành viên c gi nh R s a GTPase nhỏ,nổi tiếng với vai trò buôn bán h t nh n, c thể hiện quá m c trong các khối u ác tính

.

kh nh u v thú ẩy quá trình phosphoryl hóa AURKA (Aurora kinase A) RAN là mộtthành phần h nguồn c IN28B ó li n qu n ến biểu hiện IN28B l m tăng R NmRNA và các protein có thể dẫn ến giảm tỷ lệ sống sót chung

Giới h n ộ i o n ph n o n Ph ng ph p h nh (RF P) l kỹ thuật bản

ể phát hiện h nh nu leoti e n (SNPs) li n qu n ến việc phân tách một mẫuDNA bằng enzyme cắt giới h n, có thể nhận ra và cắt DNA bất c khi nào xảy ra mộtchuỗi ngắn c thể nh một tiêu hóa h n chế o n N thu s u ó c phântách theo chiều dài thông qua một qu tr nh c g i l iện i tr n gel g rose H n nữa,bằng cách so sánh với các xét nghiệm hiện i nh Giải trình t S nger, ph ng ph pTaqman và Giải trình t thế hệ tiếp theo, PCR-RFLP cho phép phát hiện nh nh ộtbiến iểm sau khi trình t gen c khuế h i bằng P R, y l ph ng ph p n giản,

nh y cảm v ng tin ậy và cần ầu t tối thiểu vào thiết bị, và tiện ích c a nó trongnghiên c u di truyền phân t ã c ch ng minh trong một lo t lĩnh v c

Nói chung, các nghiên c u tr ớ y ã h ng minh vai trò quan tr ng c a

LIN28B trong việ ph t sinh ung th nguy n b o thần kinh, IN28B, o ó, ần phải

c chú tr ng, ặc biệt l tr n sở di truyền Trong nghiên c u này, những SNP này

d kiến sẽ c phát hiện trên dân số Việt Nam bằng ph ng ph p h nh o n giới h n

và phân tích thống k ể x ịnh các biến thể trong gen IN28B v s u ó ph n tí hthống kê mối liên quan với u nguyên bào thần kinh và mối liên quan giữa các yếu tố lâmsàng và kiểu gen TT Th c hiện theo quy trình, các kết quả s u ó c so sánh với cácmẫu chuẩn ( ã c xác nhận kiểu gen) ể xác nhận x ịnh ho ph ng ph p h nhphân mảnh bằng enzyzme cắt giới h n (RFLP)

.

C ươ II PHƯƠN PH P

Trong nghiên c u này, chúng tôi nhằm m í h tối u hó xét nghiệm h nh

o n giới h n o n (RF P) ể x ịnh các biến thể trong gen IN28B v s u ó ph ntích thống kê mối liên quan với u nguyên bào thần kinh và các thông số lâm sàng ở trẻ emViệt Nam

o n h yếu từ năm 2015 ến 2017 t i Bệnh viện Nhi ồng 2, Thành phố Hồ Chí Minh

H n nữ , húng t i ũng tuyển d ng 25 tình nguyện viên không bị ung th ng ờiViệt Nam Tuy nhi n, ộ tuổi c a các mẫu ối ch ng hầu nh kh ng t ể phù h pvới các mẫu NB do s chấp thuận thu thập máu từ trẻ em Tất cả các mẫu m u l utrữ ở -20⁰C Rõ ràng, những ng ời th m gi iền vào s ồng ý tham gia nghiên c u

3 Lựa chọn và kiểu gen SNP

SNP qu n t m li n qu n ến NB c xuất bản trong một bài báo (He etal., 2016) rs221634 A> T

Bảng 1 Thông tin di truyền của NPs ược chọn

Gene SNP

Name Symbol GenBank

accessionnumber

dbSNP Location Position Variation

4 Thiết kế m i

Trong nghiên c u này, cặp mồi b n ầu c thiết kế trên CLC Main Workbench(Qiagen Bioinformatics) Các tiêu chí chính trong quá trình l a ch n mồi l : ầu tiên,chiều dài tổng thể c a mỗi mồi nên từ 20 ến 24 bp; th hai, GC% phải là 50% và trong

tr ờng h p S nger Sequen es, kí h th ớc khuế h i phải nằm trong khoảng từ 300 ến

700 bp, y l kí h th ớc phù h p ể ph n tí h S nger th nh ng ể ó c kết quảchất l ng cao, thiết kế mồi c húng t i c coi là chiều dài mồi, chênh lệ h ộ dài

c a cặp mồi, chiều dài sản phẩm PCR, tỷ lệ GC, nhiệt ộ nóng chảy (Tm), kẹp GC, hìnhthành mờ (bao gồm cả mờ và t mờ), cấu trúc kẹp tó v tính ặc hiệu c a phần mềmPrimer BLAST, Primer3Plus và OligoAnalyzer 3.1

.

.

C ƣơ III KẾT QUẢ

1 Kết quả chuẩn hoá sản phẩm PCR

1.1 Định tính và chất lƣợng mẫu DNA

Tất ả mẫu N ã h n ho P R th ng th ờng

với hất l ng v số l ng o (tỷ lệ 260 / 280: 1 7-1.9;

A260 / A230: 1.7-2 2) ng hú ý, tất ả N hiết xuất

r giải trong 50-100 buffer ung ị h r giải ể thunồng ộ N o (tr n 70 ng / ) o n N kết quả

ó thể nh n thấy ới ng ải x ịnh rõ r ng (H nh

1)

1.2 Đ ẫu chạy PCR với m i thiết kế

ặp mồi P R thiết kế ể khuế h i ể ph vùng gen nhắm m

ti u b o gồm vị trí SNP (rs221634 A>T) v một vị trí enzyme h n hế kh Bằng

h s ng N BI Primer B ST ể kiểm tr tính ặ hiệu mồi, mồi

kh ng phù h p với m ti u kh theo h ớng nhất ịnh v trong khoảng

h nhất ịnh ho phép khuế h i kh ng mong muốn ột ặp Primer ũng

kh ng ó ấu trú th ấp m nh v t bổ sung th ng qu I T Oligo Ph n tí h, ó

gi trị elt G l -6,3 k l / mol Theo mồi Tm Tm, nhiệt ộ ó thể tối u

hó ở m 54 ° - 60 ° bằng h th hiện P R ộ ố nhiệt ộ (H nh 3) B n

nh ó, húng t i ã th hiện P R với 35 hu kỳ ho N bộ gen Bằng h

h nh ung sản phẩm P R s ng bộ huyển ổi UV, ải s ng v nhỏ g nnhất với kí h th ớ kiến (466 bp) ã qu n s t rõ r ng trong l n 3 bằng

h so s nh với th ng 1kb o ó, nhiệt ộ tối u l 56 ° (H nh 2)

bp

Hình 1 Kết quả n di Agarose gel 8-10% với DNA bộ gen

ƣợc tách chiết từ máu Cột 1: DNA ladder (1kb); Cột 2: DNA

bộ gen

.