TIỂU LUẬN Enzyme cắt giới hạn

Các nghiên cứu của di truyền vi sinh vật về các enzyme cắt giới hạn và plasmid cũng như việc sử dụng chúng để tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm in vitro trong

Phần 1: Mở Đầu

Từ năm 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi khuẩn

E.coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA ( gọi là DNA ngoại lai

hay DNA lạ ) mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn Chỉ một số ít trường hợp không bị phân cắt và có thể tái bản trong tế bào chủ Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiểm soát của tế bào chủ Năm 1969 Daniel Nathan và Hamilton Smith đã xác nhận các tế bào vi khuẩn là những hệ thống chứa các enzyme sửa đổi và enzyme cắt giới hạn

Các nghiên cứu của di truyền vi sinh vật về các enzyme cắt giới hạn và plasmid cũng như việc sử dụng chúng để tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm ( in vitro ) trong những năm đầu của thập niên 1970 đã tạo ra bước ngoặt quan trong trong quá trình phát triển của Kỹ thuật di truyền Có thể thấy enzyme cắt giới hạn là một trong những công cụ thiết yếu của kĩ thuật di truyền và

có nhiều ứng dụng trong công nghê DNA

Phần II Nội Dung

I Enzyme cắt giới hạn

1 Khái niệm:

Enzyme cắt giới hạn ( Restriction endonuclease ) hay gọi tắt là enzyme giới hạn là các nuclease có khả năng nhận biết và cắ sợi dài DNA tại các vị trí đặc thù thành các đoạn ngắn.

Những enzyme này phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases

2 Hiện tượng giới hạn

Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này được khám phá từ các

chủng E.coli mà đang hạn chế sự phát triển của các thực khuẩn thể Vì thế

enzyme giới hạn được cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virut và giúp loại bỏ các trình tự của virut Enzyme giới hạn đóng vai trò vô hiệu hóa hoạt tính của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc thù để chúng không kịp tái sinh và tổng hợp nên hạt phage mới

DNA của vi khuẩn không bị phân giải vì các base nitogene ở trình tự nhận biết đã bị methyl hóa nên enzyme không nhận ra vị trí cắt Những enzyme phân giải này gọi là enzyme hạn chế

3 Phân loại:

Đã có hơn 1200 enzyme hạn chế khác nhau Các nhà sinh hóa chia

enzyme cắt giới hạn nói chung thành ba loại : loại I, loại II, loại III

Loại I: những enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu vị trí cắt của các enzyme loại này nằm ngoài trình tự nhận biết một khoảng cách không nhất định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide Do không có tính đặc hiệu trong cắt đoạn nên sản phẩm của nó không đồng nhất và không phát hiện được bằng điện di trên gel

Phân tử lượng vào khoảng 300.000D

Loại II: bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt nagy tại vị trí nhận biết Phân tử lượng thấp hơn loại I và ở khoảng từ 20.000 đến 100.000D

Loại III: Bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu thì cắt ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo ra một số đầu cắt khác nhau Tuy vị trí điểm cắt rất gần trình tự nhận biết của chúng nhưng khó đoán trước được các điểm cắt đó Vì vậy mà RE loại III cũng như RE loại I không được sử dụng rộng rãi trong công nghê di truyền

Đối với loại I và loại III cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp enzyme lớn, mặc dù những enzyme thuộc 2 nhóm này cũng nhận biết những trình tự DNA đặc hiệu , vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết có khi tới cả trăm base Chúng cần ATP để hoạt động

Với enzyme giới hạn loại II chức năng phân giải của nó không liên quan tới chức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế bên vị trí nhận biết Ngày nay người ta biết rất nhiều loại enzyme khác nhauloaij này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA

4 Trình tự nhận biết và tính chất đặc trưng của các RE

Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi độc theo chiều 5’-3’ trên mạch DNA gọi là trình tự nhận biết Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này Hầu hết các enzyme đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau ( hình chữ chi ) tạo ra các “đầu

dính”.Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện hình thành các đoạn DNA “đầu bằng”

Ví dụ:

5’… …GGCC…… 3’

3’… …CCGG…… 5’

5’……GG CC……3’

3’……CC GG… 5’

a Cắt tạo đầu bằng ( HaeIII )

5’… GAATTG…….3’

3’.… CTTAAC…….5’

5’… G AATTG… 3’

3’… CTTAA C….5’

b Cắt tạo dầu sole ( EcoRI )

Tính chất đặc trưng của các RE:

Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện được ở các vi khuẩn mà không có ở các sinh vật nhân thật Vì vậy tên goisk của các enzyme giới hạn biểu thị bằng

ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất Chữ cái đầu được viết hoa để chỉ chi ( genus ) và hai chữ cái tiếp theo viết thường để chỉ loài ( species ) và nếu cần thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặc chủng Ngoài ra để phân biệt các enzyme của một nòi dùng thêm số

La Mã kèm theo sau

Ví dụ: EcoRI

- Tính đặc hiệu vị trí: chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định Tùy theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết

mà chia ra hai loại chính: loại I bao gồm các enzyme cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết và loại II bao gồm các enzyme cawtss đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết

- Enzyme giới hạn phân hủy bất kỳ DNA ngoại lai nào xâm nhập vào

tế bào vi khuẩn

- Các enzyme giới hạn có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài nghĩa

là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và các vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA

- Các RE nhận biết DNA mạch kép ở những trình tự điểm nhận biết cắt DNA ở ngay điểm này hay điểm kế cận Các trình tự nhận biết thường có trình tự 4-6 cặp nu

II Ứng dụng của enzyme giới hạn

Việc sử dụng RE có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử sinh vật nhân chuẩn, chúng cho phép cắt nhỏ bộ nhiễm sắc thể khổng lồ của sinh vật nhân chuẩn Các RE chủ yếu được sử dụng trong việc tạo dòng với mục đích tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một trình tự DNA xác định RE còn được ứng dụng để lập bản đồ cắt giới hạn vào việc phân tích so sánh bộ gene ở các loài khác nhau thông qua kỹ thuật RFLP Sau đây ta chỉ tìm hiểu hai ứng dụng lớn của enzyme cắt giới hạn:

1.Enzyme giới hạn trong phân tích DNA:

Hầu hết các phân tử DNA trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm

Trong các tế bào phần lớn các nhiễm thể thường là một phân tử DNA dài chứa hàng trăm thậm chí hàng nghìn gene khác nhau Vì vậy để có thể phân lập và phân tích từng gên người ta phải cắt các phân tử DNA kích thước lớn thành các phân đoạn nhỏ Công việc này được thực hiện bởi một nhóm các enzyme đặc biệt gọi là enzyme giới hạn Về nguyên tắc một bộ gene phức tạp có thể bị cắt thành nhiều phân đoạn mà từ đó người ta có thể phân lập được một đoạn gene đặc hiệu bằng cách điện di trên gel Những điện di DNA đặc hiệu được thử nghiệm cho gene định nghiên cứu bằng cách lai hóa với những bản sao phóng xạ của gene tinh chế từ tế bào bằng những biện pháp thích hợp Gene toàn bộ hoặc một phần của nó có thể thu được những phân đoạn nhỏ hơn bằng cách cắt đoạn liên tiếp với những RE khác

Từ đó có thể phân lập được gene mong muốn Trình tự DNA cần nghiên cứu được cắt với nhiều RE, theo các tổ hợp cắt đơn, cắt phối hợp Các sản phẩm cắt sau đó được phân tích bằng điện di và xử lí với các phần mềm máy tính để xây dựng bản đồ cắt giới hạn

Tất cả các enzym giới hạn đều có hai đặc tính: 1) nhận biết một trình tự đặc hiệu trên phân tử ADN (gọi là trình tự giới hạn); và 2) cắt bên trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu (hoặc ngay tại vị trí giới hạn như đối với nhóm enzym giới hạn loại ; hoặc cách vị trí giới hạn một số nucleotit nhất định như đối với các nhóm enzym giới hạn thuộc các nhóm và ) Trong các nhóm enzym giới hạn, nhóm thường được dùng trong các nghiên cứu di truyền phân tử và kỹ nghệ gen là nhóm nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng được xác định rõ Vì vậy chúng ta chỉ đề cập đến việc ứng dụng của nhóm enzym giới hạn này Các trình tự giới hạn của enzym nhóm thường gồm 4 –

8 bp, thông thường có tính đối xứng và vị trí cắt thường nằm trong trình tự giới hạn này Ví dụ như enzym giới hạn coR được tìm thấy ở vi khuẩn E

coli có trình tự giới hạn là 5’-GAATTC- 3’ với vị trí cắt ở giữa G và A Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi khuẩn mà từ đó enzym được tìm thấy (Eco = Escherichia coli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vi khuẩn và số thứ

tự của enzym được tìm thấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên được tìm thấy ở E coli)

Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm 6 bp giống EcoRI thông thường được trông đợi sẽ có trung bình một vị trí cắt trong một đoạn trình

tự có kích thước khoảng 4 kb (bởi theo nguyên tắc xác suất tại một vị trí nhất định xác suất để có một loại nucleotit nhất định là 1/4, vì vậy xác suất

để có một trình tự nhất định gồm 6 bp sẽ là 1/46 = 1/4096) Giả sử có một phân tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN này bằng EcoRI sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt, 7 phân đoạn ADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lượng (vì chúng khác nhau về thành phần và trình

tự các nucleotit) Như vậy, một phân đoạn ADN sẽ tương ứng với một vùng của phân tử ADN ban đầu

Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn gồm 6 bp, nhưng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt khác với khi sử dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu) Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phân tích

Đối với một số enzym giới hạn khác, chẳng hạn như Sau3A1 (tìm thấy ở vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn hơn (5’-GATC-3’), nên tần số cắt của chúng thường cao hơn các enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí cắt trong một đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ một đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, mới có 1 vị trí cắt (1/48 = 1/65536)

Các enzym giới hạn không chỉ khác nhau về trình tự giới hạn và độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử ADN Chẳng hạn như enzym HpaI tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn các enzym RcoRI, HindIII và PsIt cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính Sở dĩ gọi là “đầu dính” bởi phần các trình tự ở hai đầu sau khi được enzym cắt ra bổ trợ với nhau theo nguyên tắc Chargaff và vì vậy chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tử ADN được cắt bởi cùng một loại enzym giới hạn Tính chất này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật tách dòng phân tử

2 Tạo DNA tái tổ hợp:

Bất kì đoạn DNA nào nếu được cắt bởi cừng một loại enzyme giới hạn (ví dụ EcoRI) tạo ra các đầu dính thì có thể dính lại với nhau và được nối bởi DNA ligase Năm 1973 H.Boyer đã tạo ra được phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên gồm vecto là plasmid nhỏ pSC101 của E.coli và DNA ngoại lai là một plasmid khác Chính sự kiện này đặt ra triển vọng lớn cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp sau này

DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo ra trong ống nghiệm bằng cách kết hợp các DNA từ các nguồn khác nhau theo một quy trình kĩ thuật nhất định, gọi là kĩ thuật tái tổ hợp DNA

Thông thường một phân tử DNA tái tổ hợp bao gồm một phân tử DNA có bản chất

là plasmid hoặc phage nguyện vẹn gọi là vecto ( thể tải ) và một đoạn DNA từ nguồn khác nhau

RE có thể được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp, DNA có thể được cắt và nối lại với nhau từ các nguồn khác nhau Việc tạo dòng DNA có nghĩa là gắn một đoạn DNA ( một gene vào một vecto tạo dòng sau đó đặt vào một tế bào sống ( biến nạp ) để khuếch đại gene mục tiêu

Hình 1: Hai phân tử DNA khác nhau được cắt bởi cùng một enzyme giới hạn EcoRI tạo ra các đầu dính bổ sung nhau

Mục đích của việc tạo dòng là thu được một số lượng lớn bản sao của một đoạn DNA xác định Về nguyên tắc một quy trình kỹ thuật DNA tái tổ hợp gồm các bước cơ bản sau:

• Tách DNA và plasmid ra khỏi tế bào, chọn lọc và xử lí DNA thuộc các nguồn khác nhau

• Kiến tạo phân tử DNA tái tổ họp trong ống nghiệm

• Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

• Phát hiện dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu

3 Kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA ( RFLP và AFLP )

Các kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA đều sử dụng enzyme cắt giới hạn RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là phương pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạ cùng loại sẽ thấy các băng DNA hoàn toán giống nhau về số lượng và kích thước Ngược lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA

AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism) là phương pháp nghiên cứu

đa hình chiều dài đoạn được khuếch đại Nguyên lí của phương pháp này là:

 Cắt DNA genome bằng enzyme giới hạn

 Gắn adapter có trình tự nhận biết của RE

 Sử dụng cặp mồi nhân lên

 Điện di phát hiện

Phần 3: Kết Luận

Việc phát hiện ra enzyme giới hạn đã góp phần làm thúc đẩy sự phát triển của ngành sinh học nói chung và của di truyền học phân tử nói riêng Giúp các nhà khoa học dễ dàng nghiên cứu và tìm hiểu về gene Nhờ có các enzyme giới hạn

mà con người đang dần từng bước hiểu rõ hơn về DNA và cơ chế hoạt động của chúng, enzyme này còn giúp điều hòa các cơ chế hoạt động của DNA trong

cơ thể sống Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng rộng rãi trong các kĩ thuật

di truyền như RFLP, AFLP, Southern blot,…và trở thành một phần không thể thiếu trong các kĩ thuật di truyền ngày nay

Mục Lục

Phần 1: Mở đầu

Phần 2: Nội dung

I Enzyme cắt giới hạn

1 Khái niệm

2 Hiện tượng giới hạn

3 Phân loại

4 Trình tự nhận biết và tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn

II Ứng dụng của enzyme giới hạn

1 Enzyme giới hạn trong phân tích DNA

2 DNA tái tổ hợp

3 Kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA

Phần 3: Kết luận

Tài liệu tham khảo

1 Giáo trình Di truyền học, NXB giáo dục, PGS.TS Chu Hoàng Mậu

2 Sinh học phân tử,NXB Đai học quốc gia Hà Nội, Võ Tương Lan

3 Di truyền học vi sinh vật và ứng dụng, NXB đại học Huế, Hoàng Trọng Phán

4 Trang web: http://congnghesinhhoc24h.com