tài lieu công nghe sinh hoc

Vì thế công tác nhân giống in vitro cây lan lai bằng phương pháp nuôi cấy mô thực sự cần thiết vì hệ số nhân giống cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt cáccây con giống có năng suất và

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.ĐẶT VẤN ĐỀ:

Nhu cầu trồng chuối từ cây giốngRiêng ở nước ta việc đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa chưa cao doviệc trồng lan chưa được tổ chức một cách khoa học và chưa có đầu tư thíchđáng, yếu tố hạn chế là các giống lan được nhân lên với tốc độ chậm Vì thế

công tác nhân giống in vitro cây lan lai bằng phương pháp nuôi cấy mô thực

sự cần thiết vì hệ số nhân giống cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt cáccây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như các cây bố mẹ đã chọn lọc,đồng thời sẽ làm giảm tác nhân gây hại cho cây giống và đem lại hiệu quả rấtthiết thực trong việc nâng cao chất lượng giống cây con Vì thế việc ứngdụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống lan lai là rất cần thiết và

có thể tìm ra được nhiều màu sắc khác lạ trên các loài hoa lai tạo với nhau.Hoa lan sinh sản một số lượng lớn, vì hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi có thể

có đến cả triệu hạt trong mỗi quả lan Trước thực trạng trên chúng tôi đã tiến

hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Dendrobium lai qua

phương pháp thụ phấn” được thực hiện nhằm xác định khả năng sinh trưởng

và phát triển của hạt lan lai qua thụ phấn

2 Mục tiêu của đề tài:

- Tạo ra giống lan Dendrobium lai có khả năng sinh trưởng phát triển

tốt, cho hoa đẹp và lâu tàn

- Nhân nhanh cây lan lai để có số lượng lớn cây con phục vụ cho vườntrồng lan

3 Giới hạn của đề tài:

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi đã thực hiện đượctừng giai đoạn trong phòng thí nghiệm Riêng phần ngoài vườn chúng tôi đãchuẩn bị trước thí nghiệm thụ phấn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Một số đặc tính đại cương về họ lan (Orchidaceae)

2.1.1 Đặc điểm sinh học:

Trong số những cây cho hoa có hơn 16.000 loài và 700-800 giốngthuộc họ Orchidaceae đã được xác định (Begum, 2000), và có rất nhiều loàiđược lai giống nhân tạo Họ lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc(Asteraceae) và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm Riêng ở Việt Nam lanrừng được biết gồm hơn 750 loài khác nhau

Khác với các cây trồng cạn, trồng trong môi trường nước (thủy sinh),các loài phong lan (họ lan Orchidaceae) lại có đời sống kí sinh, bì sinh(không cần đất) nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào võ cây rừng nhiệt đới hoặc hútchất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục (Trần Hợp, 1998)

Nhìn chung, họ Orchidaceae bao gồm các loài cây thân thảo, sống lâunăm (đôi khi hoá gổ một phần ở gốc) Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá,hoặc sống phụ, sống hoại (Trần Hợp, 1998) Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzersắp xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm đơn thân (monopodial) như

các giống Vanda, và nhóm đa thân (sympodial) như các giống Cattleya, Dendrobium, Cymbium (Nguyễn Công Nghiệp, 1998) Ngoài ra cây lan còn

mang một số đặc tính đặc biệt như: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầuhết không có chất nuôi dưỡng; việc nẩy mầm và phát triển phải nhờ vào mộtloài nấm mang tính kí sinh hơn là cộng sinh trong tự nhiên; mỗi hoa lan có 3

lá đài, 3 cánh hoa, trong 3 cánh hoa có một cánh ở giữa, phía dưới mang dángđặc biệt như một cái lưỡi gọi là môi Môi hoa lan mịn như nhung, có khi kéo

dài ra hay uốn cong lên, cùng với đài và cánh hoa tạo thành nhiều hình tháiđặc biệt (Trần Văn Bảo, 1999).

2.1.2 Sự phân bố

Họ Orchidaceae phân bố từ cực Bắc như Thủy Điển, Alaska xuống tậncác đảo cuối cùng của cực Nam của Ostralia Tuy nhiên trung tâm phân bốcủa họ này ở trên các vĩ độ nhiệt đới , đặc biệt ở Châu Mỹ và Đông Nam Á.Theo nghiên cứu của Dressler (1981), ở vùng nhiệt đới Châu Á có tới 6800loài Riêng ở Việt Nam có trên 800 loài , trong đó có nhiều loài hoàn toànmới trong hệ thực vật toàn cầu (Trần Hợp, 1998)

2.2 Đặc điểm sinh học của lan Dendrobium

2.2.1 Sự phân bố

Dendrobium là một giống lan có nhiều loài trong họ Orchidaceae, giống Dendrobium gồm hơn 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á

nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu Nếu như các

nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng

phong phú Điều kiên sinh thái cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và rahoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thíchnghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào

2.2.2 Đặc điểm hình thái

 Rễ:Rễ:

Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp

với nhiều điều kiện sống như:

- Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn (Trần hợp, 2000)

- Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên võ thân cây gỗ khác, nênthân rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụmlại thành các bụi dày Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏcây gỗ, hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày,

bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màuxám bạc Ngoài ra, nó còn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi

bị gió cuốn đi Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chungcủa cả cơ thể (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000)

- Ở loài sống hoại thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hútchất dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy) Nhiềuloài lại có hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùncủa vỏ cây để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng (Trần hợp, 2000; NguyễnCông Nghiệp, 2000)

 Rễ:Thân Rễ::

Dendrobium thuộc nhóm đa thân (sympodial) Đây là nhóm gồm

những cây tăng trưởng liên tục mà có những chu kỳ nghỉ sau những mùa tăng

trưởng Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân

nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho

sự phát triển giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầydịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ

để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng Đa số củ giả hành có màu xanhbóng, nên cùng với lá, nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp Thường các loài

thuộc giống Dendrobium dùng cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với

nhiều giả hành (Trần Hợp)

 Rễ:Lá:

Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống

lá, có rất nhiều kiểu lá khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cảmọng nước , có lá dẹt, lá dài và lá hình trụ Về màu sắc, phiến lá thường cómàu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau (thường mặtdưới lá có màu xanh đậm hay tía), mặt trên lại khảm thêm nhiều màu sặc sỡ.(Trần Hợp)

 Hoa:

Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc Cácchồi hoa không những mọc trên các giả hành mới mà có thể mọc trên các giảhành củ Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm ch1inh giữa hoa, mang phần đực

ở phía trên và phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước Cột này thường dài, thẳnghay cong về phía trước Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn Baophấn nằm ở cột nhị nhụy Còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn vàthường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với

nhau, rất cứng do có tinh bột, sáp hay chất sừng Vì thế giống Dendrobium

khi ra hoa nó cho một số lượng cành hoa nhiều hơn bất kỳ một loài lan nàokhác, Chính vì thế ngày nay nó chiếm ưu thế trên thị trường hoa cắt cành

Hầu như dòng họ của giống Dendrobium là những loài hoa rất lâu tàn, trung

bình từ 1÷2 tháng (Trần Hợp, Nguyễn Công Nghiệp, 1998)

 Quả:

Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc Khichín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Ởmột số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ rakhỏi vỏquả khi vỏ này mục nát

 Hạt:

Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một máng lưới nhỏ,xốp chứa đầy không khí Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạttrong một quả nặng chỉ bằng 1 phần mười đến một phần ngàn milligam.(Trần Hợp)

2.2.3 Giá trị kinh tế, tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan trong nước và quốc tế.

đồng mỗi năm để nhập phong lan từ các nước láng giềng để đáp ứng nhu cầunội địa Trong những tháng đầu năm 2007, mặc dù kim ngạch nhập khẩu lancắt cành đã giảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khácao Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải Quan, kim ngạch nhập khẩuphong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong tháng 2/2007 là26,515 nghìn USD, giảm 20,17% so với tháng 1/2007 nhưng vẫn tăng51,76% so với tháng 12/2006 Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính củaViệt Nam trong thời gian qua là Thái Lan với gần 100% lượng lan cắt cành.

Trên thực tế, tình hình sản xuất phong lan hiện nay ở Việt Nam cònchưa tương xứng với tiềm năng Qua khảo sát, hiện mới chỉ có một số công

ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt,Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50-60ha/một doanhnghiệp Một vài địa phương khác cũng tiến hành trồng phong lan nhưng mớidừng ở quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m2 đến vài nghìn m2, cá biệt chỉ

có vài hộ trồng trên 1-2ha chứ chưa có vùng quy hoạch trồng lan tập trungứng dụng công nghệ hiện đại

Mặc dù trong thời gian qua, Viện di truyền Nông nghiệp Việt Namcũng đã bước đầu thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lantheo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan, một số địa phương khác như

Sa Pa, Phú Yên đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhângiống, hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan, riêng Trung tâm giống và kỹthuật cây trồng của Phú Yên họ đã tạo ra khoảng 300.000-500.000 cây phonglan giống Song để phát huy tối đa tiềm năng của ngành phong lan trongnước, đáp ứng nhu cầu nội địa và hướng ra xuất khẩu ngành công nghiệp hoalan của Việt Nam cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề về tạo giống, côngnghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu

tư mở rộng cơ sở hạ tầng Đó cũng chính là những vấn đề đặt ra cho ngànhphong lan nước ta được đề cập trong Đề án phát huy tiềm năng xuất khẩu hoa

của Việt Nam trong giai đoạn 2006-2015 (Hồng Nga – TC Nông thôn mới,

số 197, tr 19)

Theo các chuyên gia về lan, nghề trồng lan sẽ đem lại một số lợi nhuận

không nhỏ cho người dân, nếu trồng phong lan cắt cành loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất trồng có thể có thể cho thu nhập 500-1 tỷ đồng/năm, cao

hơn nhiều lần so với trồng lúa và một số hoa màu khác Chỉ tính riêng tạiTP.HCM, năm 2003 doanh thu từ kinh doanh hoa lan đạt 200-300 tỷ đồng.Nhưng chỉ trong qúi 1/2006, con số này đã tăng lên mức 400 tỷ đồng Ngoài

ra, các cơ sở kinh doanh hoa lan cũng tăng từ 264 cơ sở năm 2003 lên 1.000

cơ sở, với lượng phong lan tiêu thụ trung bình mỗi năm lên tới 1 triệu cây.Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên triệu cây(nguồn:TTXVN)

Ở Việt Nam lan là họ thực vật đa dạng, phong phú trải dài từ Bắc vàoNam, từ vùng đồng bằng thấp lên vùng núi cao và khu đảo (Trần Hợp, 2000)nên lan đã được trồng từ lâu để làm cảnh trong nhà Nhưng gần đây một sốnhà vườn bước đầu trồng lan dạng cắt cành chủ yếu cung cấp cho thị trườngtrong nước nhưng cung vẫn chưa đủ cầu do sản xuất vẫn còn mang tính nôngnghiệp, trong đó nổi cộm là vấn đề giống không đủ chất lượng Tuy nhiên,hiện nay bình quân thu nhập lan cắt cành tại thành phố Hồ Chí Minh là 1tỷ/ha/năm (www.vnn.vn/kinhte)

Ngày nay, các nhà phong lan học và các nhà vườn trồng lan đang nổlực lai chéo các giống lan để tạo ra các giống mới nhằm đáp ứng được nhucầu ngày càng đa dạng của thị trường tiêu thụ hoa trong nước và ngoài nước,

mở ra hướng phát triển cho ngành hoa của địa phương

Giá thành sản phẩm cây lan nuôi cấy mô tương đối thấp và lượng sảnphẩm tạo ra tương đối đồng loạt, độ đồng đều cao Nếu tính giá thành mộtchậu lan cấy mô (tính giai đoạn đang ươm ngoài nhà lưới khoảng 12.000 –20.000đ/chậu lan, mỗi vò có 01 cây giống và chiều cao cây khoảng 10-

20cm) Trong đó giá thành sản xuất 01 cây lan con giai đoạn trong phòng thínghiệm có chiều cao trung bình 6 - 8cm, cây có 03 lá trở lên thì giá thànhkhoảng 1.500đ/cây, còn một số nôi cung ứng và nhân giống gia công khoảng2.000đ/cây Qua chiết tính trên cho thấy công nghệ sản xuất và nhan giốnglan nuôi cấy mô là rất cần thiết, và có thể áp dụng phương pháp này nhằm tạo

ra nhiều giống lan mới, giá thành rẽ để đáp ứng như cầu trong tỉnh nói riêng,

cả trong nước và quốc tế nói chung

Việt Nam là nước nằm gọn trong vành đai nhiệt đới Bắc bán cầu, chiềudài theo hướng Bắc-Nam là 1.650km cho nên tạo được sự đa dạng về cácvùng khí hậu, từ đó dẫn đến đa dạng các loài hoa lan Phát triển Nuôi trồng

và kinh doanh, xuất khẩu hoa lan bênh cạnh hiệu quả kinh tế còn mang lạihiệu quả xã hội hết sức to lớn:

- Thu hút được một lực lượng lao động lớn từ những người về hưu đếnnhững người không có công ăn việc làm

- Làm tăng lượng cây xanh đô thị và xung quanh vùng ven đô thị gópphần cải thiện môi sinh

- Nâng cao mức sống văn hóa tinh thần của người nuôi trồng và nhườidân đô thị thưởng thức cái đẹp của hoa lan, của tự nhiên

- Làm cho bộ mặt thành phố cũng như bộ mặt của đất nước ngày càngđẹp và văn minh hơn

* Rễ:Thế Rễ:giới:

Nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng ngày càng tăng, tỷ

lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa thế giới 10% đạt khoảng 49 tỷ USD.Một số nước như Thái Lan, singapo, Hawaii xem lan là một trong những mặthàng đem lại nguồn kim ngạch xuất khẩu lớn (Lê Phạm Trung, 1999; Nguyễn

Công Nghiệp, 2000) Trong đó Dendrobium được chọn làm giống chủ đạo

trong ngành sản xuất lan cắt cành do nó có những ưu điểm sau:

- Siêng bông, cho nhiều cành hoa, số lượng hoa trên một cành nhều(tối thiểu 10 hoa/cành).

- Số lượng loài rất lớn nên chủng loại sản phẩm đa dạng, dễ thay đổitheo thị hiếu của thị trường nên dạng hoa cắt cành này rất được ưa chuộngtrên thị trường Châu Á (Nguyễn Công Nghiệp, 2000)

Ngoài ra, Dendrobium còn được dùng vào các mục đích khác như:

- Thân cây dùng để làm rỗ ở Philippines, Indonesia và New Guinea giả

hành của Dendrobium tokai đã được sử dụng như thuốc tránh thai (Bose and

Bhattacharjee, 1999)

- Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium sallacense nấu với cơm

như người Việt Nam ở Đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa Lá, giả hànhcòn được dùng làm trà hay lấy sợi trong thân làm thành kiềng đeo tay (TrầnVăn Huân và Văn Tích Lượm, 2002)

Ở châu Á, năm 1987 Hồng Kông đứng đầu về xuất khẩu mặt hàng này,nhưng thực tế Hồng Kông lại nhập hoa của các nước khác chuyên xuất nhiềuhơn là tự sản xuất để xuất khẩu Thái lan và Nhật về kim ngạch xuất khẩutính đến năm 1987 đứng vào hàng thứ 8 của Châu Á Nhưng hai nước nàyđang phát triển mạnh sản xuất hoa, lan, cây cảnh Tại Nhật, năm 1990 thunhập mặt hàng này gần 9 tỷ USD, dự kiến năm 1995 sẽ đạt 15 tỹ USD TháiLan là nơi nổi tiếng sản xuất hoa lan, năm 1987 kimh ngạch xuất khẩu là108,9 triệu USD, riêng hoa lan là 21 triệu USD, năm 1990 lên 26 triệu USD,(Phan Thúc Huân)

Riêng Thái Lan đã xuất khẩu lên đến 610 loại hoa lan khác nhautrong từng năm một Nhiều giống hoa lan được nhân giống từ lan rừng chothấy Thái Lan là một trung tâm phân phối và sưu tập hoa lan của vùng ĐôngNam Á Sự phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp đạt được nhiều kết quảtrong sản xuất nông nghiệp đã đưa Thái Lan trở thành quốc gia hàng đầu thếgiới sản xuất về hoa đặc biệt là hoa lan Thái Lan là quốc gia xuất khẩu đứngthứ tư trên thế giới về hoa cắt cành trong năm 1993-1994

Đối với các nước đang phát triển, kim ngạch xuất khẩu và kim ngạchnhập khẩu hoa, lan, cây cảnh chỉ chiếm khoảng 25-30% tổng kim ngạch xuấtnhập khẩu của toàn thế giới Tuy nhiên, một số nước đang phát triển đã có cơ

sở sản xuất và đã có bạn hàng tiêu thụ vững vàng như Thái land, Singapore,Colombia, Kenya, Nam Phi Inđônêxia, Côsta Rica Đặc biệt Colombia trongnhững năm gần đây đã phát triển ngành hoa lan, cây cảnh xuất khẩu một cáchnhảy vọt và đã đứng hàng thứ hai trên thế giới, chỉ sau Hà Lan

IsraelÝThailand

KenyaKhác

2,153.56395.64146.12111.2867.5861.58388.17

Hà LanColombiaIsraelThailandKenyaÝKhác

1,456.24415.61115.2665.3760.5748.39318.94

Hà LanColombiaIsraelThailandKenyaEcuadorKhác

1,586.40431.71134.1568.2067.5752.88400.95Tổng 3,323.82 Tổng 2,480.37 Tổng 2,741.86(Nguồn: International Floriculture Trade Statistics 1995)

Năm 1994 khối lượng hoa cắt cành của Thái Lan xuất khẩu đến NhậtBản, Ý, Mỹ, Đức, Đài Loan và Hà Lan là 11.897 tấn Bên cạnh hoa lan, TháiLan cũng xuất khẩu các loài hoa cắt cành khác

2.3 Phương pháp vi nhân giống

2.3.1 Mục đích vi nhân giống

Nuôi cấy tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tếbào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ: việc nuôi cấy đượcduy trì dưới các điều kiện kiểm soát Vi nhân giống là phương pháp nhânnhanh với số lượng lớn và giảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.3.2 Các giai đoạn vi nhân giống

Vi nhân giống đã được chia thành 5 giai đoạn khác nhau (Debergh,1991), mỗi giai đoạn có một chức năng riêng :

- Giai đoạn 0 : Chuẩn bị cây mẹ

- Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

- Giai đoạn 2 : Nhân nhanh

- Giai đoạn 3 : Sự ra rễ in vitro.

- Giai đoạn 4 : Sự thuần dưỡng

Trong giai đoạn nhân nhanh, những mẫu cấy sẽ được cấy trên môitrường thích hợp cho sự nhân chồi Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh

số lượng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất

định, chồi bên và chồi ngọn sẽ được cảm ứng phát triển in vitro bằng cách

làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện hữu Một mẫu cấy có mộtchồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay thành cụm chồi tùy thuộc vào loàithực vật mà môi trường nuôi cấy sau vài lần cấy truyền các chồi được tạo ra

và chuyển sang giai đoạn ra rễ (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên,2002)

Do các chồi hoặc cây con thu được từ giai đoạn 2 còn nhỏ và chưa cókhả năng tự phát triển trên đất hoặc phân trộn nên chúng được chuyển sangmôi trường cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh Giai đoạn 3 đượcchia thành hai giai đoạn là giai đoạn kéo dài và giai đoạn kích thích tạo rễ vàtiền thuần dưỡng Giai đoạn kéo dài nhằm cung cấp các chồi có kích thướcthích hợp cho giai đoạn tạo rễ, còn giai đoạn kích thích tạo rễ nhằm tạo rễ

cho các chồi in vitro thu được ở giai đoạn kéo dài (George, 1993).

2.3.3 Những thuận lợi của phương pháp vi nhân giống.

- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo

- Nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh.

- Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp

(nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây conquanh năm

- Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro làm cây mẹ cho các bước

nhân giống tiếp theo

2.4 Kỹ thuật nhân giống phong lan

Để tạo cây giống lan lai phục vụ cho công tác nuôi trồng có thể nhângiống bằng hai cách: nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính

2.4.1 Nhân giống hữu tính

Trong nhiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúccủa hoa lan hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa lan là một loại hoalưỡng tính, cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoakhông đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính cách bắt buộc Sự thụ phấncủa hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở củamùi thơm và ánh sáng hấp dẫn và những cấu tạo của hoa là những dấu hiệuchỉ dẫn cho côn trùng trong quá trình thực hiện

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo

ra các giống lan lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thực hiện Sự thụphấn của lan có thể cùng cây, có thể khác cây Đối với lan ở các vườn nuôitrồng, việc thụ phấn do con người thực hiện đuợc tiến hành như sau:

Dùng kim hay một cái kẹp nhỏ để làm dụng cụ thụ phấn

Lấy và loại bỏ hai khối phấn bọc nhụy của cây lan được chọn làm cây

mẹ (cây cho phấn là cây cha, cây được thụ phấn là cây mẹ)

Lấy hai khối phấn của hoa cây được chọn làm cây cha, khối phấn hoalan thường có cấu tạo gót dính hay sáp cho nên khi thụ phấn cần dùng một

cái kim hay một cái kẹp nhỏ làm dụng cụ để lấy khối phấn ra khỏi hoa câycha cho dễ.

Đỉnh khối phấn lấy được ở hoa cây cha đặt vào phần lõm có chất keodính được gọi là đàn nhụy của hoa cây mẹ, khối phấn sẽ dính ngay vào đànnhụy của cây mẹ và sự thụ phấn được thực hiện Sau khi thụ phấn toàn bộbầu của hoa cây mẹ phát triển hình thành nên quả của lan và tạo nên hạt lan

và hình thành những cây lan lai sau này

Để có những cây hoa lai tạo đạt được các yêu cầu về mặt thẩm mỹ cầnquan tâm đến những chủng loài để khai thác làm nguồn gen ban đầu nhằm laitạo được các giống mới Song song với những định hướng lai tạo giống mới,cần tiếp tục nghiên cứu thêm lĩnh vực nhân giống vô tính để gia tăng sốlượng cây đạt các yêu cầu mong muốn (Phan Thúc Huân)

2.4.2 Nhân giống vô tính

 Phương pháp tách chiết thông thường

 Phương Rễ:pháp Rễ:tách Rễ:cây Rễ:con

Khi rễ cây con được 6-10cm có thể tách để trồng riêng Đây là cáchnhân giống đơn giản và dễ làm nhất

 Phương Rễ:pháp Rễ:giâm Rễ:cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu Đặtcác đoạn này vào một nơi nóng ẩm, chỉ cần cát và rêu Sau vài tuần sẽ xuấthiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới

Các phương pháp nhân giống cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinhnghiệm của nông dân, giá thành thấp Tuy nhiên phương pháp này cũng cómột số trở ngại như : chậm (tăng khoảng 2-4cây/năm); chất lượng giốngkhông cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lantruyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh,1998)

 Phương Rễ:pháp Rễ:nuôi Rễ:cấy Rễ:mô

Phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thểnhân giống lan trên qui mô công nghiệp So với phương pháp tách chiếtthông thường tốc độ phát triển 1 cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽsản xuất một số lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm(Nguyễn Công Nghiệp, 1998)

Bảng 2.1 Một số kết quả đạt được trong nhân giống một số loài

Dendrobium Rễ:bằng Rễ:phương Rễ:pháp Rễ:nuôi Rễ:cấy Rễ:mô Rễ:(theo Rễ:George, Rễ:1993)

Dendrobium

laciniosum

Đỉnh sinh trưởngcủa chồi ngọn vàchồi bên

Tạo sự khởi đầu

Morel (1974)

Dendrobium spp Các ngọn chồi Tạo protocorm và

tăng sinh nhanhprotocorm

Morel (1965)

Dendrobium spp Ngọn chồi và

chồi bên

Tạo protocorm vàtái sinh cây con

Tái sinh chồi từmắt

Nuraini andMohd.Shaib(1992)

Dendrobium spp Các mắt thân của

2.5 Các yếu tố của môi trường cấy ảnh hưởng đến các giai đoạn

trong nuôi cấy in Rễ:vitro.

Trong nuôi cấy in vitro sự tăng trưởng của cây phần lớn được xác định

bởi các thành phần của môi trường cấy Thành phần chính của hầu hết môitrường nuôi cấy mô là các thành phần khoáng, đường được xem là nguồncung cấp carbon và nước Những thành phần khác có thể được bổ sung baogồm các chất hữu cơ, các chất điều hoà sinh trưởng, chất làm đặc môi trường.Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo các giaiđoạn cấy và loài cây, môi trường MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sửdụng phổ biến nhất

2.5.1 Khoáng đa vi lượng

Các khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng các muối

vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hổn hợp muối vô cơ

Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong traođổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh của tế bào (Moxolov,1987), do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.Đạm được sử dụng trong nuôi cấy mô thường ở dạng ammonium (NH4+) vànitrate (NO3-)

Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein,acid nucleic và tham gia vào cấu trúc của màng Lân thường được sử dụng ởhai dạng ion là H2PO4- và H2PO42-

Nồng độ khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thườnggiảm xuống còn một nữa so với bình thường (tuỳ theo loài cây) Nguyênnhân có lẽ là do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm xuống (NguyễnĐức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.5.2 Vitamin

Thực vật cần vitamine để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau,các vitamine thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là:

Thiamine HCl (vitamine B1); Pyridoxine HCl (vitamine B6); Acid nicotinic ;Myo-inositol (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

điều kiện in vitro khi nồng độ CO2 và mật độ ánh sáng tăng lên

2.5.6 Các chất hữu cơ

Nước dừa (CW-coconut water) được dùng thông dụng trong nuôi cấy

mô Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid,chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác Nước dừa chỉ kích thích những tếbào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừathường dùng ở nồng độ 15% Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vậtđược nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụngkích thích sự phát triển cây như chà là, chuối, mầm lúa mì nhưng thôngthường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùngnguồn gốc (Trần Văn Minh - Viện Sinh học Nhiệt Đới)

2.5.7 Than hoạt tính

Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định Nó có tácdụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường Sự kết hợp của 0.3% thanhoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cảchồi Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làmtăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con (Nguyễn Đức Lương và

Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.6 Nhóm các chất điều hoà tăng trưởng ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô.

* Một Rễ:số Rễ:đặc Rễ:tính Rễ:cơ Rễ:bản Rễ:của Rễ:các Rễ:chất Rễ:kích Rễ:thích Rễ:sinh Rễ:trưởng

- Chúng hoạt động ở liều rất yếu; ở liều cao chúng trở nên độc, điềunày cho phép một số chất kích thích tố được sử dụng như thuốc diệt cỏ

- Chúng can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, điều này bao hàm ítnhiều dạng thức hoạt động của chúng, từ sự kiện này khái niệm về “hormonechuyên biệt” hiện tại đã được bỏ đi

2.6.1 Auxin (C10H9O2N) (acid indole .acetique)

Có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào

2.6.1.1 Rễ:Tính Rễ:chất Rễ:sinh Rễ:lý Rễ:của Rễ:Auxin

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó phụthuộc vào nồng độ và các sự hỗ tương qua lại của chúng với các chất điềuhoà khác Các tác dộng của Auxin được thể hiện như sau:

 Kéo dài tế bào: làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâmnhập của nước vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bàogiảm đi và tế bào tự kéo dài ra

 Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thểhiện bằng một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tácdụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+

 Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốccambium Hiệu quả này là do chất “histogene” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tếbào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”.

 Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chấtetylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỷ lệ chất auxin, ít nhất ởmức chuyên chở

 Hoạt động trong các phản ứng về tăng trưởng và trong các sự hỗtương giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ưu thế của chồi non

 Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái

 Có tác dụng kích thích tạo rễ

2.6.1.2 Rễ:Auxin Rễ:trong Rễ:cây Rễ:trồng

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin dạng tổng hợp tuỳ theogiai đoạn phát triển của chúng Chất auxin sinh ra được hiện diện trong các lárất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quảcòn non

Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phâncực rõ ràng được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quátrình chuyển này chúng bị thoái hoá bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấynồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng Như vậy,auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trưởng hoặc ở pháthoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào

2.6.1.3 Rễ:Các Rễ:chất Rễ:auxin Rễ:tổng Rễ:hợp

Gồm các chất chính sau:

 Acid indolylbutyrique (AIB)

 Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất củachúng như:

 Acid naphtyloxyacetique (ANOA)

 Acid naphtylacetamide (NAD)

 Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4D)

Trong lĩnh nuôi cấy invitro, những chất giống được sử dụng và auxin

đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứuthuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ Ngoài ra, trong thực tiễn chúngcòn được dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sựthu hoạch quả (Dương Công Kiên, 2002)

2.6.2 Gibbérelline

Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng ChấtGibbérelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibbérelline hoặc là GA3, kếđến là GA4 + GA7 và GA7 Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giốngnhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất gắn trênnhân

2.6.2.1 Rễ:Tính Rễ:chất Rễ:sinh Rễ:lý Rễ:của Rễ:Gibbérelline

 Hoạt động kéo dài các đốt của cây, họat động này cũng có thể ápdụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc nhữngphát hoa phát triển hơn

 Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đến nhiều đỉnh

sinh trưởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hìnhcầu, tạo nên các mắt cây

 Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa

 Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt

 Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làmthuận lợi cho sự nảy mầm

 Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấycác hoạt động đối kháng: chúng dường như đối ngược với hiện tượng phân

hóa tế bào Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không được sử dụng vào

mục đích này, nhưng chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnhsinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân…)

2.6.2.2 Rễ:Gibbérelline Rễ:trong Rễ:cây Rễ:trồng

Gibbérelline được tìm thấy trong tất cả các loài cây và trong các loạinấm, ở đây chúng được phân bố không đồng đều, một vài loại có trong vàiloại cây, một vài loại nấm và một vài chất Gibbérelline có trong cà hai nhóm(như GA1, 3, 4, 5, 9).Trong cây trồng một vài loại cây chỉ có một chấtGibbérelline, các loài cây khác có thể có nhiềi\u loại chất Gibbérellin.

2.6.3 Cytokinine

Cytokinine được khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro.

Người ta đã biết sự thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quảlàm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi Vàonăm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt động người ta đặt tên làkinetine, do AND biến chất

Cytokinine là các chất adenine được thay thế, chất này được biết qua 2nhóm nội sinh là:

 Isopentenyladenine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổnghợp, có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:

 Kinetine (6 furfuryl-aminopurine)

 Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine)

2.6.3.1 Rễ:Tính Rễ:chất Rễ:sinh Rễ:lý Rễ:của Rễ:Cytokinine

 Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trìnhnày, chúng cần thiết nhưng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin,Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của aciddesoxyribonucleique (AND) và Cytokinine cho phép làm tách rời cácchromosome

 Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽkích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non Trái lại, chúng là chất đốikháng với sự tạo rễ

 Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phầnviệc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chốnglại tác động của enzyme li giải.

 Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: các chồi nách được

xử lý Cytokinine sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng

 Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể

hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia

tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa

2.6.3.2 Rễ:Cytokinine Rễ:trong Rễ:cây Rễ:trồng

Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của câyngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn

Corynebacterium fascines Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu

của rễ cây