Chương 3 Enzym

Cấu tạo Enzym Phân loại 1 Enzym một thành phần Enzym 1 cấu tử, Enzym đơn giản: chỉ cấu tạo từ các acid amin, từ chuỗi polypeptid protein đơn giản 2 Enzym 2 thành phần Enzym 2 cấu tử, Enz

CHƯƠNG III: ENZYM

I KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM

1 Định nghĩa

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein (biocatalisateur)

Enzym cũng là một loại protein nên nó có đầy đủ các tính chất của protein

MEnzym = 10.000 – 1.000.000 D, ngắn nhất là ribonuclease 12.700 D Dễ tan, có cấu trúc hình cầu,

Đã khám phá khoảng 2000 Enzym trong đó hơn 200 Enzym thu được ở dạng tinh thể

2 Cấu tạo Enzym

Phân loại

(1) Enzym một thành phần (Enzym 1 cấu tử, Enzym đơn giản): chỉ cấu

tạo từ các acid amin, từ chuỗi polypeptid (protein đơn giản)

(2) Enzym 2 thành phần (Enzym 2 cấu tử, Enzym phức tạp): ngoài

chuỗi polypeptid còn có phần phi protein (protein phức tạp)

 Chuỗi polypeptid: chất mang, Apoenzym, Apoferment

 Phi protein: nhóm hoạt hóa, Coenzym – cofactor, Coferment

• Coenzym: phần phi protein có liên kết lỏng lẻo với

apoenzym, và dễ dàng tách ra khi dùng phương pháp thẩm tích (đa số là vitamin)

• Cofactor (nhóm ngoại): phần phi protein gắn với apoenzym

bằng liên kết đồng hóa trị bền vững, và không thể tách ra độc lập (ion kim loại là nhóm ngoại)

Cấu tạo

 Điểm khác biệt so với protein bình thường là sự hình thành các trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động (TTHĐ)

Phần cấu trúc mà nơi đó trực tiếp xảy ra các phản ứng xúc tác được gọi là trung tâm hoạt động của Enzym

 Enzym 1 cấu tử

 TTHĐ thường là các nhóm định chức có hoạt tính cao, và không tham gia vào việc tạo thành trục chính của chuỗi polypeptid Các nhóm này ở xa nhau nhưng vơí cấu trúc bậc 3,4 chúng sẽ tiến lại gần nhau hình thành TTHĐ

 Nhóm –SH của cystein

 Nhóm –OH của serin, tyrosin

 Nhóm ε-NH2 của lysin

 Nhóm –COOH của acid glutamic, aspartic

 Vòng himidazol của histidin N NH

 Indol của tryptophan

 Cấu trúc không gian của Enzym bị biến đổi thì khả năng hoạt động của TTHĐ bị biến đổi và hoạt tính của Enzym cũng bị biến đổi

 Một Enzym có thể có 1 hay nhiều TTHĐ Các TTHĐ trên cùng một Enzym có thể giống nhau hoặc khác nhau về cấu tạo và chức năng

 Enzym hai cấu tử:

TTHĐ thường bao gồm nhóm ngoại hay coenzym và các nhóm chức của acid amin

•Coenzym quyết định kiểu phản ứng hóa học và trực tiếp tham gia

kết hợp với cơ chất (thủy phân, oxy hóa, tổng hợp, phân ly,…)

 Apoenzym chọn lọc cơ chất và ảnh hưởng đến cường độ phản

ứng (protein, lipid, glucid,…)

Cơ chế ổ khóa, chìa khóa (mô hình Fisher)

TTHĐ của Enzym có cấu tạo nhất định và chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào, như chìa khóa tra vào ổ khóa

 Không giải thích được các kiểu đặc hiệu nhóm

Cơ chế Koshland (mô hình tiếp xúc cảm ứng)

 TTHĐ của Enzym chỉ hình thành trong quá trình tiếp xúc giữa Enzym và cơ chất

 Khi chưa có cơ chất, các nhóm chức năng của TTHĐ chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động

 Khi tiếp xúc với một cơ chất nào đó, cảm ứng không gian sẽ biến đổi hình dạng của Enzym, các nhóm chức năng định hướng thích hợp và chính xác và cấu trúc không gian TTHĐ thay đổi để gắn với cơ chất, thực hiện quá trình xúc tác

 Giải thích thỏa đáng được tính đặc hiệu nhóm

Trung tâm dị lập thể (TTDLT)

Ngoài TTHĐ làm chức năng xúc tác, một trung tâm khác có nhiệm

vụ điều chỉnh hoạt tính của Enzym gọi là trung tâm điều chỉnh hay

trung tâm dị lập thể

Đây là 2 cấu trúc riêng biệt, có tác dụng tương hỗ

 TTDLT dương: khi kết hợp với chất dị lập thể có thể làm tăng hoạt tính Enzym hoặc là Enzym từ trạng thái không hoạt thành hoạt động

 TTDLT âm: khi kết hợp với chất dị lập thể, Enzym sẽ giảm hay mất hoạt tính

Phức hợp Enzym

 Nhiều chu trình chuyển hóa trong cơ thể sinh vật gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, sản phẩm của phản ứng này lại là cơ chất của phản ứng sau

 Mỗi phản ứng được một Enzym xúc tác, vì vậy trong chu trình sẽ có nhiều loại Enzym hoạt động

 Các Enzym này hoặc hoạt động riêng lẻ, hoặc kết hợp với nhau thành phức hợp Enzym

 Phức hợp Enzym là tổ hợp nhiều Enzym cùng xúc tác cho một quá trình sinh hóa

Tiền Enzym (Proenzym, zimogen)

Phần lớn các Enzym được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tử Enzym có sẵn hoạt tính sinh học

Có những Enzym được tổng hợp ở dạng trung gian chưa có hoạt tính xúc tác được gọi là tiền Enzym (zimogen hay proenzym)

Đa số Enzym một cấu tử, nhất là Enzym của hệ tiêu hóa thường tồn tại ở trạng thái chưa hoạt động (Pepsinogen tại bao tử, Trypsinogen tại thành ruột, Protrombin gây đông tụ máu)

Cơ chế chuyển zimogen thành Enzym hoạt động:

Tác nhân hoạt hóa tiền Enzym thường là một Enzym khác, hoặc pH

3 Tên gọi của Enzym

Tên thông dụng

 Tên gọi quen dùng, thường là tên người tìm ra hoặc tùy tiện theo

ý tác giả, không theo quy ước nào và cũng không nói lên kiểu phản ứng

 Pepsin, trypsin, catalase, amilase, rennin, bromelin, papain, …

Tên hệ thống

 Được Hội nghị Sinh Hóa Quốc tế lần thứ 5 (1961) qui định:

Tên cơ chất + tên phản ứng + ase (aza, az)

Pyruvat decarboxylase - khử CO2 của acid pyruvic

Glucophosphat isomerase - chuyển đồng phân gốc phosphate

trong dẫn xuất của glucose

 Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hỗ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ hai của tên gọi một dấu ngoặc

CH

N

H2

R

COOH

R

COOH

L-acidamin oxydoreductaza (deamin)

L-acid amin

 Mỗi Enzym có 1 mã số E C X X X X

(1) (2) (3) (4)

4 chữ X là 4 số (1): nhóm chính (lớp)

(2): nhóm phụ (phân lớp) (3): phân nhóm phụ (tổ) (4): tên Enzym, thứ tự của E trong phân nhóm phụ

I : oxihóa khử oxydoreductase

II : chuyển hóa dạng đồng phân, isomerase (EC.2.7.7.16 - ribonuclease) III : phản ứng thủy phân, hydrolase (EC 3.1.1.3 - thủy phân chất béo)

IV : phân cắt tạo nối đôi, liase

V : quá trình chuyển nhóm chức, transferase

VI : tổng hợp từ các chất đơn giản, ligase (synthetase)

II VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYM

1 Cơ chế tác dụng của Enzym

GĐ 1: tạo phức ES

Xảy ra nhanh chóng và cần năng lượng hoạt hóa thấp

Phức ES không bền, chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn

GĐ 2: hoạt hóa cơ chất S

Khi tạo thành phức ES, ở phân tử cơ chất có sự chuyển hóa: sự phân bố lại nội năng do đó có sự chuyển vị electron, hoặc phá vỡ các liên kết đồng hóa trị, hình thành các liên kết mới trong phân tử cơ chất, làm cơ chất bị kích thích và sẵn sàng chuyển hóa tạo sản phẩm

Mức năng lượng hoạt hóa của giai đoạn này cũng không cao

GĐ 3: tạo sản phẩm protein

Cơ chất sau khi được hoạt hóa sẽ biến đổi về chất để hình thành chất mới và phân ly khỏi Enzym tạo thành sản phẩm protein

TD: xét 1 phản ứng thủy phân

Enzym thủy phân thường có 2 trung tâm hoạt động

Hydrolase

So sánh với chất xúc tác hóa học

Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym

Điều

kiện

phản

ứng

Aùp suất cao, nhiệt độ cao,

thời gian dài, nồng độ xúc

tác cao, hiệu suất thấp

Aùp suất thường, nhiệt độ thường, thời gian ngắn, nồng độ xúc tác nhỏ, hiệu suất triệt để

Cellulose acid đặc, nhiệt độ cao, áp suất, thiết bị

hiệu suất thấp

E cellulase Vài giờ, điều kiện bình thường (bao tử bò nhai lại)

Glucose

Hiệu

quả

năng

lượng

Acid, Q = 25.000 cal/mol

E invertase, Q = 9.400 cal/mol

Fructose + Glucose

Cường

độ

phản

ứng

2H2O2 1 mol Fe3+ xúc tác phân ly 10-6 mol/phút

1 phân tử catalase có 1 nguyên tử Fe phân ly 5.106 mol/phút

2H2O + O2

Vận

tốc

phản

ứng

Tinh bột Amylase, nhiệt độ thường, vài phút

Acid, đun sôi trong vài giờ Glucose

Tính

đặc

hiệu

1 chất xúc tác có thể xúc

tác cho rất nhiều phản ứng

Có khả năng chọn lọc cơ chất rất cao Một Enzym chỉ xúc tác cho một vài phản ứng hay chỉ một phản ứng duy nhất

Hoạt

tính

xúc

tác

chỉ có khả năng tác dụng

giống nhau, và bản thân

chúng là một hợp chất hóa

học, không phải là hợp chất

sinh học

Thay đổi hoạt tính dưới tác động của các yếu tố môi trường, t0, pH, yếu tố hóa học Có thể tách ra từ

cơ thể sinh vật và bảo toàn hoạt tính của nó ở ngoài cơ thể

III HOẠT TÍNH CỦA ENZYM

1 Định nghĩa

 Hoạt tính của Enzym là khả năng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm

 Hoạt tính càng cao thì lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn

vị thời gian càng nhiều, tốc độ phản ứng càng nhanh

2 Xác định hoạt tính của Enzym

[1] Xác định vận tốc chuyển hóa cơ chất: lượng cơ chất S mất đi trong

một đơn vị thời gian

[2] Xác định vận tốc tạo thành sản phẩm: lượng sản phẩm tạo thành trong

một đơn vị thời gian

[3] Xác định nồng độ thấp nhất của E để chuyển hóa hết một lượng cơ

chất xác định

Hoạt tính của Enzym:

Số đơn vị hoạt động trong một đơn vị chế phẩm Enzym

Đơn vị hoạt động của Enzym (UI):

Lượng Enzym tối thiểu cần thiết để chuyển hóa 1µmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn (là điều kiện t0, pH,…thích hợp nhất để Enzym đó hoạt động)

Hoạt tính riêng (hoạt độ riêng):

Số đvị hoạt động trong một đơn vị khối lượng hay thể tích chế phẩm Biểu thị độ tinh sạch Enzym Hoạt độ riêng càng cao, chế phẩm Enzym càng tinh sạch

TD: Enzym papain trong vỏ đu đủ

1g chế phẩm I (đã loại tạp chất lần I) 3000 UI/g

1g chế phẩm II (loại tạp chất lần II) 300000 UI/g

Hoạt tính phân tử

Số đơn vị hoạt động trong 1 mol Enzym

Đơn vị này chỉ dùng trong một số trường hợp đặc biệt khi Enzym đã được tinh chế đến dạng tinh khiết và có thể xác định được phân tử lượng của nó

TD: urease có M = 480000

Hoạt tính toàn phần

Tổng số hoạt độ của toàn bộ chế phẩm Enzym, dùng để tính hiệu suất tinh chế

TD: 1kg vỏ đu đủ 30 UI/g TA = 30000 đv

5g chế phẩm I 3000 UI/g TA = 15000 đv 0.03g chế phẩm II 300000 UI/g TA = 9000 đv

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym (tốc độ phản ứng E)

Ảnh hưởng của nồng độ Enzym

Thừa cơ chất S: vận tốc phản ứng sẽ tăng tuyến tính đến khi

toàn bộ Enzym đều tham gia phản ứng

Nồng độ Enzym lớn: vận tốc phản ứng sẽ tăng đến khi hết cơ chất S

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất S

Phương trình Michaelis – Menten: biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất [S]

K+1

K-1

K+2

K+1 hằng số tốc độ của phản ứng tạo phức [ES]

K-1 hằng số tốc độ của phản ứng phân ly phức [ES] ngược lại

K+2 hằng số tốc độ của phản ứng phân ly phức thành sản phẩm

Với Km = K-1 + K+2

K+1

m + [S]

Vmax

Km hằng số ái lực của Enzym đối với cơ chất S

Nếu có cùng một lúc nhiều Enzym cùng tác động lên cơ chất, Enzym nào có Km nhỏ nhất thì Enzym đó sẽ tác động xúc tác chuyển hóa cơ chất đó

Ảnh hưởng của nhiệt độ

• Nhiệt độ tăng: vận tốc phản ứng tăng

• Với đa số Enzym: T0 opt = 40-60 0C (T0 opt E.ĐV thường thấp hơn E.TV)

• Khi nhiệt độ tăng cao, vì có bản chất là protein nên E bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác

T0 = 700C E bắt đầu mất hoạt tính

To = 1000C E hoàn toàn mất hoạt tính

• Enzym chịu t0 cao: papain T0 opt = 80 0C, termamyl T0 opt = 90 0C

• Ứng dụng của yếu tố nhiệt độ

T0 opt tốc độ phản ứng cao nhất, khi cần thu sản phẩm p.ứng

T0 thấp bảo quản E, Vpư = 0, Enzym không biến tính

T0 > 40, 50 vô hoạt Enzym, nhiệt độ thanh trùng

Ảnh hưởng của pH

pH opt là pH mà ở đó tốc độ phản ứng xảy ra cực đại pHopt của E dao động trong một khoảng gọi là vùng pHopt

Đối với đa số Enzym, pHopt trong vùng acid yếu, kiềm yếu gần vùng

trung tính Một số Enzym có pHopt ở vùng rất acid hay rất kiềm (Pepsin - pHopt = 2; Trypsin - pHopt = 8 – 9)

Vùng pH biến tính thuận nghịch: vùng pH mà hoạt tính của E mất

đi, nhưng khi đưa về pHopt, hoạt tính E lại được khôi phục

Vùng pH bất thuận nghịch: vùng pH mà hoạt tính E mất đi không

thể nào khôi phục lại

Phản ứng Enzym thuận nghịch thì pHopt(T) ≠ pHopt(N)

C H COOH

CH3

COOH

CH3 O

pH =8 opt

pH =6 opt

Enzym lactat dehydrogenase (coenzym NAD NADH2)

Tuỳ cơ chất mà pHopt của cùng một Enzym cũng thay đổi

Pepsin: S là hemoglobin thì pHopt=1,8 / S là casein thì pHopt=2,2

Ứùng dụng của yếu tố pH

 Tách chiết Enzym, tinh sạch Enzym pH thuận nghịch

thuận nghịch

Ảnh hưởng của chất kích thích (chất hoạt hóa)

 Chất có khả năng làm tăng thêm tốc độ phản ứng E, hoặc biến E từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động

 Các chất hoạt hóa có bản chất rất khác nhau:

 Coenzym (vit): khi có mặt chúng thì E mới có hoạt tính xúc tác

 Ion kim loại: hoạt hóa trực tiếp vì nó tham gia vào thành phần

của trung tâm hoạt động hoặc là cầu nối giữa E và S (Ca2+cần để hoạt hóa E amylase, trypsin,… K+, Na+, Mg2+,Fe2+, Fe3+, Mo4+ cũng là chất hoạt hóa cho nhiều loại E, TTHĐ của Ascorbat oxydase là Cu)

Ảnh hưởng của chất kìm hãm (chất ức chế)

Chất bổ sung vào phản ứng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng E, hoặc là

vô hoạt Enzym, ký hiệu là I (Inhibitor)

 Kìm hãm thuận nghịch: khi có mặt chất kìm hãm I, hoạt động E yếu

đi, khi loại bỏ I thì hoạt tính E trở lại như cũ

 Kìm hãm bất thuận nghịch: khi có mặt chất kìm hãm I, hoạt động E

yếu đi, nhưng khi loại bỏ I, E không trở lại hoạt tính ban đầu

 Kìm hãm cạnh tranh: I có cấu tạo hóa học gần giống cấu tạo hóa học

của cơ chất, tranh giành kết hợp với TTHĐ của E làm cho lượng cơ chất S phản ứng với E bị giảm xuống, tốc độ phản ứng giảm

Nồng độ I càng cao, vận tốc phản ứng càng giảm, cần tăng nồng độ

cơ chất S để loại bỏ tác dụng của I

(I)

CH2

COOH

COOH

acid malonic

CH2

CH2 COOH

COOH acid succinic

CH COOH

COOH

acid fumaric

 Kìm hãm không cạnh tranh:

 Chất kìm hãm I có cấu tạo hóa học khác với cấu tạo hóa học của cơ chất

 Không liên kết với E ở TTHĐ mà làm thay đổi cấu trúc không gian của TTHĐ làm cho E không tác dụng được với cơ chất

 Vận tốc phản ứng E lúc này chỉ tùy thuộc vào nồng độ I mà không có cách khắc phục

 Thí dụ về I không cạnh tranh

• Thuốc Sulphamid trị đau bụng tiêu chảy TTHĐ của VSV đường ruột chứa p-aminobenzoic, sulphamid sẽ thế chỗ của p.a.s làm E bị vô hoạt dẫn đến VSV chết

• Hợp chất CN kết hợp với Fe của E citocromoxydase (E điều khiển sự hô hấp) làm vô hoạt E này, ta sẽ bị ngạt thở và chết

• Cơ chất S hoặc sản phẩm P thừa cũng có thể là chất kìm hãm không cạnh tranh ức chế hoạt động của E

IV TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYM

1. Định nghĩa:

Mỗi E chỉ có thể xúc tác chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, tùy vào cấu tạo của TTHĐ Sự lựa chọn này của E được gọi là tính đặc hiệu của E

Đặc hiệu quang học

 Mỗi E chỉ có thể xúc tác với một dạng đồng phân quang học

Fumarat hydratase chỉ tác dụng lên dạng L-acid malic mà không tác dụng với D- Theo chiều ngược lại, nó cũng chỉ tác dụng lên dạng trans-a fumaric mà không tác dụng với dạng cis

COOH CH

CH COOH

+H O -H O

2

2

O

CH2 COOH COOH

 Có E xúc tác cho phản ứng chuyển hóa qua lại giữa các dạng đồng phân quang học

Lactat-transmerase xtác pứng chuyển D-a lactic thành L-a lactic

Đặc hiệu kiểu phản ứng

Mỗi E chỉ có thể xúc tác cho 1 kiểu phản ứng chuyển hóa nhất định (E thủy phân, tổng hợp, chuyển vị, đồng phân hóa, oxy hóa khử, …)

Đặc hiệu kiểu cơ chất

∗ Đặc hiệu nhóm tương đối:

Chỉ cần 1 điều kiện – bản chất của liên kết (bromelin, lipase)

∗ Đặc hiệu nhóm tương đối:

Cần 2 điều kiện – liên kết và cấu tạo của 1 trong 2 cấu tử tạo thành liên kết (aminopeptidase; carboxylpeptidase; tripsin/lkết peptid, R1=Arg, Lys; Chimotrypsin/ lkết peptid, R1=Phe, Tryp, Tyr; Pepsin/lkết peptid, R2=Phe, Leu)

∗ Đặc hiệu tuyệt đối:

Cần 3 điều kiện - liên kết và cấu tạo của cả 2 cấu tử tạo thành liên kết (glucoxydase, ascorbat-oxydase, arginase, urease,…)

2 Phân loại Enzym theo tính đặc hiệu

Thể hiện qua cách gọi tên hệ thống và ký hiệu nhóm

[1] Oxydoreductase (E xúc tác phản ứng oxy hóa khử)

Tên chất cho H+: tên chất nhận H+ + oxydoreductase

[2] Transferase: (E xúc tác phản ứng chuyển vị)

Tên nhóm chuyển vị + transferase

∗ Acyltransferase: chuyển vị nhóm acyl qua CoA

∗ Glucotransferase: chuyển vị nhóm đường (pentose, hexose)

∗ Aminotransferase: chuyển vị nhóm NH2 (amin)

∗ Phosphotransferase: chuyển vị gốc P

∗ Metyltransferase: chuyển vị gốc –CH3

∗ Carboxyltransferase: chuyển vị gốc –CO2

[3] Hydrolase: (E xúc tác phản ứng thủy phân)

∗ Peptihydrolase: thủy phân liên kết peptid

∗ Esterase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester (lipase, phosphatase, lecithinase,…)

∗ Glucosidase: thủy phân liên kết ester của gốc đường

[4] Liase: (E xúc tác phản ứng phân cắt không có H 2 O)

Tên cơ chất + tên nhóm bị cắt + Liase

∗ Decarboxylase: cắt CO2

∗ Hydratase: loại bỏ và kết hợp H2O

[5] Isomerase: (E xúc tác phản ứng đồng phân hóa)

 Glucophosphatisomerase

[6] Ligase /synthetase: (E xúc tác phản ứng tổng hợp)

 Asparagin synthetase: tổng hợp asparagin

 Glutamin synthetase: tổng hợp glutamin