Chương 3 Enzym GT HSTP

B-Cấu tạo của Trung tâm hoạt động: 1 Trung tâm hoạt động: Không phải tòan bộ phân tử Enzym tham gia kết hợp vớiù cơ chất, mà chỉ có một phần rất nhỏ củaphân tử Enzym tham gia kết hợp đặc

Chương III ENZYM -

I-KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM:

1- Định nghĩa:

 Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein

 Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên Enzym có tên là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) để phânbiệt với các chất xúc tác hóa học khác

 Enzym cũng là một loại protein nên nó có đầy đủ các tính chất của protein Đa số Enzym cóphân tử lượng từ 1000 – 1000000 Ngắn nhất là ribonuclease 12700 dalton

 Enzym tham gia xúc tác hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể sinh vật Thiếu Enzym thìmọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản, phát triển bìnhthường được, do đó sự sống không tồn tại

 Hiện nay người ta đã khám phá khỏang 2000 Enzym trong đó hơn 200 Enzym thu được ở dạngtinh thể Ngày nay Enzym không chỉ xúc tác các phản ứng sinh hóa trong cơ thể mà nó đã đượcsản xuất rộng rãi cũng như ứng dụng có hiệu quả trong mọi lĩnh vực: y dược, chăn nuôi, thú y,công nghệ chế biến thực phẩm bia, rượu, tương, chao, nước chấm, nước mắm

2- Cấu tạo Enzym:

A.Cấu tạo:

Enzym có bản chất là protein phần lớ là protein dễ tan, có cấu trúc hình cầu, phân tử lượng từ

10000 đến 1000000 dalton

Dựa vào thành phần hóa học, Enzym cũng chia làm hai loại:

(1) Enzym một thành phần: (Enzym 1 cấu tử, Enzym đơn giản)

Chỉ cấu tạo từ các acid amin , từ chuỗi polypeptid, hay còn gọi là protein đơn giản

(2) Enzym 2 thành phần: (Enzym 2 cấu tử, Enzym phức tạp)

Là protein phức tạp Ngoài chuỗi polypeptid còn có phần phi protein

Apoenzym + Coenzym = holoenzym

 Cofactor: nhóm ngoại: phần phi protein gắn với apoenzym bằng liên kết đồng hóa trị bềnvững, và không thể tách ra độc lập (postetic)

Thí dụ: metaloenzym: ion kim loại là nhóm ngoại

Tuy vậy sự phân biệt trên chỉ là tương đối vì khó đưa ra được tiêu chuẩn thế nào là gắn chặt, thếnào là không gắn chặt, nhất là trong những năm gần đây người ta đã chứng minh được có nhữngcoenzym gắn vào apoenzym bằng liên kết đồng hóa trị

B-Cấu tạo của Trung tâm hoạt động:

(1) Trung tâm hoạt động:

Không phải tòan bộ phân tử Enzym tham gia kết hợp vớiù cơ chất, mà chỉ có một phần rất nhỏ củaphân tử Enzym tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất Phần cấu trúc đó là nơi trực tiếp xảy ra cácphản ứng xúc tác và được gọi là trung tâm hoạt động của Enzym

 Enzym 1 cấu tử:

Trung tâm hoạt động thường là các nhóm định chức có hoạt tính cao, và không tham gia vào việctạo thành trục chính của chuỗi polypeptid

Nhóm -SH của cystein

Nhóm OH của serin, tyrosin

-NH2 của lysin

-COOH của acid glutamic, aspartic

- Vòng himidazol của histidin

- Indol của tryptophan

Các nhóm này ở xa nhau nhưng vơí câú trúc bậc 3,4 chúng sẽ tiến laị gần nhau hình thành trungtâm hoạt động

Vậy những biến đổi nhỏ của môi trường sẽ làm biến đổi cấu trúc không gian của Enzym,dẫn đếnlàm mất khả năng hoạt động của trung tâm hoạt động vàEnzym bị vô hoạt

Ví dụ:  - chimotrypsin có trung tâm hoạt động gồm –OH của serin – 195, imidazol của histidin –

57 và nhóm –COOH của aspartic 102

- Có Enzym chỉ có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có Enzym có nhiều trung tâm hoạt động

- Thí dụ: alcol dehydrogenase gan có 2 trung tâm hoạt động

alcol dehydrogenase của nấm men có 4 trung tâm hoạt động

Các trung tâm hoạt động có thể giống nhau mà cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chứcnăng

 Enzym hai cấu tử:

- Trung tâm hoạt động thường bao gồm nhóm ngoại hay coenzym và các nhóm chức của acidamin

 Coenzym sẽ quyết định kiểu phản ứng hóa học và trực tiếp tham gia kết hợp với cơ chất

 Apoenzym lại chọn lọc cơ chất , duy trì tính đặc hiệu và ảnh hưởng đến cường độ phản ứng

Ví Dụ 1:

 không có Enzym phản ứng được xúc tác bởi Fe3+ , xảy ra rất chậm

N H

Nếu xúc tác phản ứng là hematin thì cường độ phản ứng sẽ tăng lên hàng ngàn lần ( Coenzym củacatalaza)

triệu lần

(hình vẽ)

Ví dụ 2:

Enzym catalaza và peroxydaza có nhóm coenzym giống nhau nhưng khác nhau phần apoenzym

xúc tác cho 2 kiểu phản ứng rất khác nhau chính apoenzym đã qui định tính đặchiệu, khả năng chọn lựa cơ chất của phản ứng, apoenzym cũng làm tăng cường độ của phản ứng.Thường các Enzym 2 cấu tử có coenzym bản chất là vitamin

Đây là mô hình cổ điển

Theo Fisher thì trung tâm hoạt động của Enzym đã được hình thành sẵn với một cấu tạo nhất địnhvà chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào, như chìa khóa tra vào ổ khóa

(hình vẽ)

Cơ chế này giải thích thỏa đáng được tính đặc hiệu nhóm của Enzym

(2) Trung tâm dị lập thể (Alosteric)

 Trên các phân tử Enzym này ngoài một trung tâm hoạt động làm chức năng xúc tác còn có mộtloại trung tâm khác mang nhiệm vụ điều chỉnh hoạt tính của Enzym gọi là trung tâm điều chỉnh

hay trung tâm dị lập thể Đây là 2 cấu trúc riêng biệt, có tác dụng tương hỗ nhưng có nhiềutrường hợp khác trung tâm dị lập thể vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym Có 2 trườnghợp:

 Dị Lập Thể dương :khi kết hợp với chất dị lập thể có thể làm tăng hoạt tính Enzym hoặc làEnzym từ trạng thái không hoạt thành hoạt động

 Dị Lập Thể âm: khi kết hợp với chất dị lập thể Enzym sẽ giảm hay mất hoạt tính

 Ta sẽ mô hình hóa những điều nói trên:

 Các Enzym dị lập thể thường có cấu trúc bậc 4, các tiểu thể liên kết với nhau không chặt, do đóchúng có thể tách rời hay kết hợp lại rất dễ dàng, tạo ra sự mềm dẻo, dễ thay đổi cấu hìnhtrong không gian một cách thuận nghịch

Thí dụ: dị lập thể dương: Enzym acetyl coA Carboxylase

dị lập thể (+) : citrat hay isocitratmonome không có hoạt tính, có citrat gắn thành polyme có hoạt tính

dị lập thể âm: sản phẩm của phản ứng

dị lập thể thường : Enzym aspartat transcarbamylase

xúc tác phản ứng ngưng tụ Carbamyl Phosphat với aspartat tạo ra Carbamyl aspartat

Dùng Hg để khóa trung tâm dị lập thể lại, hoạt tính Enzym vẫn không bị ảnh hưởng

(3) Phức hợp Enzym (Multienzym):

trong cơ thể có những chu trình chuyển hóa gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, sản phẩm củaphản ứng này lại là cơ chất của phản ứng sau Ta đã biết qua một chu trình đó là chu trìnhOrnithin Trong cơ thể sinh vật diễn ra rất nhiều chu trình như vậy Mỗi phản ứng lại được mộtEnzym xúc tác , trong chu trình sẽ có nhiều loại Enzym hoạt động Các Enzym này hoặc hoạt độngriêng lẻ, hoặc kết hợp với nhau thành phức hợp Enzym

Enzym Dihydrolipoat dehydrogenase carboxyl oxy hóa của acid pyruvic(4) Tiền Enzym (Proenzym, zimogen)

 Phần lớn các Enzym được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tử Enzym có sẵn hoạt tínhsinh học Nhưng cũng có những Enzym được tổng hợp ở dạng trung gian chưa có hoạt tính xúctác được gọi là zimogen hay proenzym, tiền Enzym

 Đa số Enzym một cấu tử, nhất là Enzym của hệ tiêu hóa thường tồn tại ở trạng thái chưa hoạtđộng.

 Cơ chế chuyển zimogen thành Enzym hoạt động:

Các zimogen đã hàm chứa các trung tâm hoạt động nhưng có những đoạn peptid vây hãm, che lấp.Hoạt hóa tiền Enzym là cắt đứt các liên kết vây hãm đó Xúc tác cho quá trình hoạt hóa này làEnzym khác hay pH

có 2 cách gọi tên Enzym

a Tên thông dụng:

là tên gọi đã có từ lâu và quen dùng, thường theo tên người tìm ra hoặc tùy tiện theo ý tác giả,không theo quy ước nào và cũng không nói lên kiểu phản ứng Hiện nay lối gọi tên này vẫn đượcdùng rộng rãi vì nó ngằn gọn dễ nhớ và quen thuộc

b Tên hệ thống:

 Là tên Enzym đã được hội nghị sinh hóa quốc tế lần thứ 5(1961) qui định Tên Enzym sẽ gồm 2phần

Tên cơ chất + tên phản ứng + ase (aza, az)

 Tên hệ thống dài khó nhớ nhưng nói được tên cơ chất bị chuyển hóa và kiểu phản ứng màEnzym xúc tác.

Thí dụ: pyruvat decarboxylase: khử CO2 của acid pyruvic

Glucophosphat isomerase: chuyển đồng phân gốc (p) trong gluco

 Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hỗ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ haicủa tên gọi một dấu ngoặc

Thí dụ:

Theo hội nghị này thì mỗi Enzym lại có 1 mã số gồm E C X X X X

X là 4 số (1): nhóm chính(lớp)

(2): nhóm phụ(phân lớp)(3): phân nhóm phụ (tổ)(4): tên Enzym : thứ tự của Enzym trong phân nhóm phụthí dụ: lớp có 6 lớp I : oxihóa khử oxydoreductaza

II : phản ứng chuyển hóa dạng đồng phân : isomeraseIII : phản ứng thủy phân hydrolase

IV : phân cắt tạo nối đôi: liase

V : quá trình chuyển nhóm chức: transferase

VI : phản ứng tổng hợp từ thành phần đơn giản : ligase (synthetase)Mỗi lớp lại phân tiếp …

EC 3.1.1.3 : thủy phân acid béo thành glycerin

EC 2.6.1.1 : L-aspartat : -cetoglutarat amino transferaza xúc tác cho phản ứngchuyển vị nhóm chứa N của amin

II – VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYM:

1- Cơ chế tác dụng của Enzym:

 Muốn cho phản ứng Enzym xảy ra thì cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động củaEnzym, tạo thành phức hợp Enzym cơ chất (ES) Trung tâm hoạt động của phân tử Enzym cónhững nhóm chức đặc biệt trực tiếp tham gia vào cơ chế xúc tác Dưới tác dụng của Enzymhoạt tính hóa học của cơ chất tăng lên rõ rệt Do đó chỉ cần một năng lượng hoạt hóa nhỏ hơnnhiều cũng đủ làm cho phản ứng xảy ra tức thì để biến cơ chất thành sản phẩm

 Một phản ứng Enzym có thể chia làm 3 giai đọan:

(1) giai đoạn 1: tạo phức ES

sự tạo thành phức ES xảy ra nhanh chóng và cần năng lượng hoạt hóa thấp Phức này không bền,chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn rồi chuyển sang giaiđoạn tiếp theo ngay

Để chứng minh cho sự tồn tại của phức ES, ta sử dụng phương poháp đo phổ hấp thu cực đại

Thí dụ: Hematin trong Enzym catalase và peroxydase có phổ hấp thuc cực đại là 400nm Khi có cơchất H2O2 , phổ hấp thu cực đại chuyển sang 420nm Giai đọan tồn tại rất ngắn, sau đó phổ hấp thusẽ quay trở lại 400nm.

(đồ thị)

(2) giaiđoạn 2: hoạt hóa cơ chất S

sau khi phức ES tạo thành, ở phân tử cơ chất có sự chuyển hóa Về bản chất là sự phân bố lại nộinăng do đó có sự chuyển vị electron, hoặc phá vỡ các liên kết đồng hóa trị, hình thành các liên kếtmới trong phân tử cơ chất, làm cơ chất bị kích thích và sẵn sàng chuyển hóa tạo sản phẩm Mứcnăng lượng hoạt hóa của giai đoạn này cũng không cao

(đồ thị)

 Lý do: phân tử Enzym có các nhóm chức đặc hiệu (thường là mạch nhánh R) Các nhóm nàycùng với ion kim loại hay coenzym tương tác với cơ chất một cách định hướng, làm cho cơ chấtcó hoạt tính hóa học cao Những nhóm đó giữ vai trò xúc tác Các phản ứng tương tác này hìnhthành các loại liên kết yếu (không phải liên kết đồng hóa trị) Đó là phản ứng phát năng, giảiphóng năng lượng tự do Năng lượng này được gọi là năng lượng kết hợp (binding energy), tuykhông lớn nhưng do số lượng nhiều nên tổng năng lượng là khá lớn Đây là nguồn năng lượnglàm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng (  F3 )

(3) giai đoạn 3: tạo sản phẩm protein

cơ chất sau khi được hoạt hóa sẽ biến đổi về chất để hình thành chất mới và phân ly khỏi Enzymtạo thành sản phẩm protein

thí dụ: xét 1 phản ứng thủy phân

Enzym thủy phân thường có 2 trung tâm hoạt động

hydrolase

(hình vẽ)

1 mol Fe 3+ xúc tác phân ly 10 -6 mol/phút 1phân tử catalase có 1nguyên tử Fe phân ly 5.10 6 mol/phút

2- So sánh với chất xúc tác hóa học:

ta làm một bảng so sánh với các chất xúc tác hóa học để thấy rõ hơn sự ưu việt của các phản ứngxúc tác bằng Enzym

(1) điều kiện phản ứng:

 phản ứng xúc tác hóa học: P cao

t0 cao, thời gian lâu nồng độ xúc tác cao, hiệu suất thấp

TD: phản ứng thủy phân : HCl 6N , 100 – 1070C,…

NaOH 6 – 8N, t0 sôi,…

t0 thườngthời gian ngắnnồng độ xúc tác nhỏhiệu suất triệt đểTD:

 = vài giờ, trong điều kiện cơ thể

(bao tử bò nhai lại)(2) Hiệu quả năng lượng:

Với cơ chế xúc tác đã nêu ở trên, phản ứng với xúc tác Enzym chỉ cần 1 năng lượng hoạt hóa thấphơn rất nhiều so với năng lượng hoạt hóa của phản ứng xúc tác thường

(3) cường độ phản ứng:

Enzym có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với xúc tác thông thường Lượng Enzym cần rất ítnhưng cóthể chuyển hóa một lượng cơ chất rất lớn trong thời gian ngắn

H + đặc, T 0+ , P, thiết bị khó Hiệu suất thấp E.cellulase

OH - , H + Đun sôi trong vài chục giờ

Proteaza Xảy ra trong vài chục phút

amilaza vài phút

H + , đun sôi trong vài giờ

(4) Vận tốc phản ứng:

phản ứng do Enzym xúc tác thường xảy ra rất nhanh và do một hệ các Enzym kết hợp vơí nhau tácdụng vào

(5) Tính đặc hiệu:

 Đối với các chất xúc tác hóa học, 1 chất xúc tác có thể xúc tác cho rất nhiều phản ứng

 Đối với Enzym, khi xúc tác có khả năng chọn lọc cơ chất rất cao Một Enzym chỉ xúc tác chomột vài phản ứng hay chỉ một phản ứng duy nhất

(6) Hoạt tính xúc tác :

 các chất xúc tác khác chỉ có khả năng tác dụng giống nhau, và bản thân chúng là một hợp chấthóa học, không phải là hợp chất sinh học

 Enzym sẽ thay đổi hoạt tính dưới tác động của các yếu tố môi trường, t0, pH, yếu tố hóa học.+ Enzym có thể tách ra từ cơ thể sinh vật và bảo tòan hoạt tính của nó ở ngoài cơ thể

+ Ngược lại các yếu tố của môi trường tác động lên cơ thể sẽ tác động trước tiên vào hệ Enzymcủa cơ thể, gây ra những sai lệch và biến đổi trong quá trình sinh học dẫn đến biến dị là cơ sởcho sự tiến hóa vì tạo ra những giống mới

III HOẠT TÍNH CỦA ENZYM:

1-Định nghĩa:

Hoạt tính của Enzym là khả năng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm

hoạt tính càng cao thì lượng sản phẩm tạo thành càng nhiều Tốc độ phản ứng càng nhanh

2- xác định hoạt tính của Enzym:

phản ứng Enzym xảy ra như sau:

có hai cách xác định hoạt tính của Enzym:

(1) xác định vận tốc chuyển hóa cơ chất:

lượng cơ chất S mất đi trong một đơn vị thời gian

(2) xác định vận tốc tạo thành sản phẩm

Lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn vị thời gian

 Hoạt tính của Enzym được biểu thị bằng số đơn vị hoạt động có trong một đơn vị chế phẩmEnzym

+ Đơn vị hoạt động của Enzym (UI) : là một đại lượng qui ước, nó có thể là lượng Enzym tốithiểu cần thiết để chuyển hóa 1mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn ( là điều kiện t0,pH,…thích hợp nhất để Enzym đó hoạt động)

 Hoạt tính riêng (hoạt độ riêng) (specific activity)

Là số đơn vị hoạt động trong một đơn vị khối lượng hay thể tích chế phẩm Biểu thị độ tinh sạchEnzym Cần thiết trong công nghệ sản xuất Enzym Hoạt đô riêng càng cao, chế phẩm Enzym càngtinh sạch.

 Hoạt tính phân tử: (molecular activity)

Là số đơn vị hoạt động trong 1 mol Enzym

Đơn vị này chỉ dùng trong một số trường hợp đặc biệt khi Enzym đã được tinh chế đến dạng tinhkhiết và có thể xác định được phân tử lượng của nó

Thí dụ: urease có M = 480000

 Hoạt tính tòan phần: (total activity: TA)

Đơn vị này dùng trong quá trình tinh chế, có thể tính được hiệu suất tinh chế: là tổng số hoạt độ củatòan bộ chế phẩm Enzym

Tùy vào điều kiện cụ thể ta có thể chọn đại lượng khảo sát là cơ chất hay sản phẩm, tùy thuộc vàoloại phản ứng, và vào điều kiện có sẵn

3-các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym:

 Hoạt tính Enzym được biểu lộ qua vận tốc của phản ứng mà Enzym đó xúc tác Tốc độ càngcao thì khả năng chuyển hoá càng lớn do đó họat tính Enzym đó càng cao

 Vận tốc phản ứng Enzym phụ thuộc vào nồng độ Enzym, nồng độ cơ chất, các chất kìm hãm, t0,pH,…

a-Ảnh hưởng của nồng độ Enzym:

 Trong điều kiện thừa cơ chất S thì vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ Enzym.Tốc độ phản ứng sẽ tăng đến khi tòan bộ Enzym đều tham gia phản ứng rồi ngừng lại

 Trong trường hợp nồng độ Enzym lớn, vận tốc phản ứng sẽ tăng đến khi hết cơ chất

(không dùng biện pháp này.)

b-Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất S:

năm 1913 Leonon Michaelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình động học của phản ứng Enzym.Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất [S] được gọi làphương trình Michaelis – Menten

phản ứng Enzym được đặc trưng bởi hằng số tốc độ phản ứng

K+1

K-1

K+2

K m + [S]

K+1 hằng số tốc độ của phản ứng tạo phức [ES]

K-1 hằng số tốc độ của phản ứng phân ly phức [ES] ngược lại

K+2 hằng số tốc độ của phản ứng phân ly phức thành sản phẩm protein

Mỗi phản ứng được biểu diễn bằng hằng số tốc độ phản ứng:

Mà [E] = [E0] – [ES]

K+1 [S] ([E0] – [ES]) = (K-1 + K+2) [ES]

Vận tốc tòan bộ phản ứng chủ yếu là phản ứng phân ly ES thành sản phẩm nên Vpư = K+2 [ES]

Đặt Km = : hằng số Michaelis Menten

Hằng số ái lực của Enzym đối với cơ chất S

Ta có:

V = Vmax

 Ý nghĩa của phương trình Michaelis – Menten:

Ta thấy khi E = const

 Khi [S] = Km thì V = ½ Vmax vậy Km là nồng độ cơ chất ở đó vận tốc phản ứng bằng ½ Vmax.

 Vận tốc phản ứng phụ thuộc nhiều vào nồng độ cơ chất:

Khi [S] vô cùng nhỏ thì V tỉ lệ thuận với [S]

Khi [S] vô cùng lớn thì

 1 V = Vmax

 Km: hằng số ái lực của Enzym đối với cơ chất S

Ý nghĩa của Km:

 Nếu có cùng một lúc nhiều Enzym cùng tác động lên cơ chất, Enzym nào có Km nhỏ nhất thìEnzym đó sẽ tác động xúc tác chuyển hóa cơ chất đó

 Nếu biết Km có thể xác định được đúng hoạt tính Enzym

Hoạt tính Enzym chỉ được xác định đúng khi S  20 Km

Đó là vùng phản ứng có vận tốc tỉ lệ thuận với cơ chất

 Ta có thể xác định Km bằng thực nghiệm:

V =Đảo ngược

y = ax + bđồ thị là một đường thẳng

(đồ thị)

c Aûnh hưởng của nhiệt độ:

 Khi t0 tăng thì động năng tăng dẫn đến vận tốc phản ứng tăng

 Khi t0 tăng cao, vì có bản chất là protein nên Enzym bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác

(đồ thị)

max max

1][

11

V S V

K v

m 

