Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 3

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 3.

3.1 Nguyên liệu

3.1.1 Nguồn carbon và cách xử lý

3.1.1.1 Bã mía

Rửa sạch, phơi khô 2-3 ngày Sau đó cắt nhỏ, xay, cho qua rây 0,1 và 0,05 lấy phần trên rây 0,05mm

3.1.1.2 Rơm

Xử lý giống như bã mía

3.1.1.3 Mùn cưa

Do kích thước mùn cưa nhỏ nên ta chỉ cần phơi khô và rây để lựa chọn kích thước hợp lý

Nguyên liệu sau khi rây được ngâm trong dung dịch NaOH 1% với tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ Sau đó hấp tiệt trùng ở 1210C, 1at trong 15 phút Lọc rửa nguyên liệu bằng nước cất đến khi dung dịch rửa trung tính (pH=7) Kế đến ta vắt kiệt và sấy khô

ở 60-700C

3.1.2 Hóa chất sử dụng

o NaOH 1% dùng để xử lý nguyên liệu

o NaOH 1N chỉnh pH

o HCl 1N chỉnh pH

o DNS

o NaCl 1%

o NaNO3

o KCl

o FeSO4.7H2O

o MgSO4.7H2O HPO 3H O

o Pepton

o Agar

o Saccharose

o Conggo đỏ

o Dung dịch đệm photphat 0.5 M 3.1.3 Dụng cụ thí nghiệm

o Máy đo pH

o Máy so màu

o Máy lắc

o Cân

o Tủ sấy, tủ ấm và tủ lạnh

o Bể điều nhiệt 3.1.4 Các loại môi trường sử dụng

3.1.4.1 Môi trường carrot-potato:

Thành phần môi trường:

o Khoai tây: 2%

o Cà rốt: 2%

o Agar: 2%

o CMC: 1%

o Nước cất Đầu tiên khoai tây và cà rốt lát mỏng sau đó nấu 1 giờ trong ½ lượng nước cất, lọc lấy dịch lọc Các thành phần khác được nấu trong lượng nước cất còn lại đến khi tan hoàn toàn Trộn 2 thành phần lại và tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút

Môi trường carrot-potato được dùng để giữ giống nấm mốc

3.1.4.2 Môi trường Czapek (Dox) (CZ)

- Czapek stock solution A 50ml

- Czapek stock solution B 50ml

Thành phần A: NaNO3 40g

MgSO4.7H2O 10g FeSO4.7H2O 0.2g Nước cất: 1000ml Thành phần B: K2HPO4 20g

Nước cất: 1000ml Môi trường A và B được trữ lạnh

Môi trường CZ dùng để nuôi cấy nấm mốc trong môi trường lỏng

3.1.4.3 Môi trường malt

Môi trường này được sử dụng làm môi trường để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tạo bào tử Từ đó ta có thể lấy bào tử để nuôi cấy trong môi trường lỏng thu nhận enzym

3.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống

Môi trường được chuẩn bị đổ vào ống nghiệm (khoảng ¼ ống nghiệm), tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút Sau đó để nghiêng 450 cho đến khi thạch đông

Dùng que cấy nhọn cấy nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng Để ở 30-400C trong tủ ấm từ 5 ngày Sau đó bảo quản lạnh <40C

3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc tạo enzym

Môi trường sử dụng ở đây là môi trường CZ Cho 100ml môi trường vào erlen

250 ml, sau đó đem tiệt trùng

Dùng 10ml nước cất vô khuẩn cho vào ống giống trưởng thành Sau đó lắc để rơi bào tử nấm mốc Hút 1ml cho vào môi trường nuôi cấy

Sau đó môi trường nuôi cấy được để trên máy lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ môi trường Ơû đây ta nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm nên việc lắc được tiến hành liên tục nhằm mục đích hòa tan oxy vào môi trường tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Trình tự tiến hành thí nghiệm

Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao

nhất Ta khảo sát 9 loài: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp.

Bước 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc

Bước 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc

Bước 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc

Bước 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulase Bước 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase

Bước 7: Thử ứng dụng enzym cellulase thủy phân cơ chất rơm

3.4.2 Thuyết minh quá trình thí nghiệm

3.4.2.1 Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao nhất

Trong bước này ta tiến hành 2 thí nghiệm.

Thí nghiệm 1: 9 loài nấm mốc A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp được nuôi trong môi trường

sinh tổng hợp enzym như trong phần 3.3 với nguồn carbon là CMC 1% có bổ sung pepton 0,5% Sau thời gian 48 giờ, ta lấy một ít dịch từ môi trường lỏng đem lọc vô trùng và tiến hành xác định hoạt tính như trong phần 3.5.1 Đây là phương pháp thử nhanh để chọn loài nấm mốc có hoạt tính enzym, sau đó ta cần dùng phương pháp khác để chọn ra loài có hoạt tính enzym cellulase cao nhất

Thí nghiệm 2: từ những loài đã chọn trong thí nghiệm 1 ta tiếp tục nuôi trong môi trường sinh tổng hợp enzym như trong thí nghiệm 1 Sau mỗi ngày ta lấy một ít dịch trong môi trường đem lọc vô trùng, sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzym CMCase theo phương pháp đo lượng đường khử tạo thành Chọn ra loài nấm mốc có hoạt tính enzym cao nhất Thí nghiệm được tiến hành trong 5 ngày

3.4.2.2 Bước 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.

Thí nghiệm 3: Với loài nấm mốc đã chọn ở thí nghiệm 2, ta tiếp tục nuôi cấy trong môi trường 3.3 Ta khảo sát ở 3 nguồn carbon là bã mía, mùn cưa và rơm với hàm lượng 1% Nguồn nitơ bổ sung là pepton 0,5% Sau 4 ngày đo hoạt tính CMCase Sau đó ta chọn nguồn carbon có hoạt tính CMCase cao nhất

Thí nghiệm 4: với nguồn carbon đã chọn ở thí nghiệm 3, tiến hành nuôi cấy giống như trên ở các hàm lượng nguồn carbon là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 Lượng pepton bổ sung là 0,5% Thời gian đo hoạt tính CMCase là 4 ngày Chọn ra hàm lượng nguồn carbon tốt nhất

3.4.2.3 Bước 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.

Thí nghiệm 5: Nuôi cấy nấm mốc trong môi trường ở phần 2.6 với nguồn carbon và hàm lượng đã chọn ở thí nghiệm trên Ta thay đổi nguồn nitơ bổ sung vào môi trường Ở đây ta tiến hành 3 mẫu: 1 mẫu bổ sung pepton, 1 mẫu bổ sung yeast extract và 1 mẫu không bổ sung cả 2 thành phần trên Hàm lượng bổ sung là 0,5%

Kết quả đo hoạt tính CMCase sau thời gian là 4 ngày.

Chọn ra nguồn bổ sung cho hoạt tính enzym cao nhất

Thí nghiệm 6: mục đích là xác định hàm lượng nguồn nitơ bổ sung cho hoạt tính enzym cao nhất Ta sử dụng nguồn nitơ này bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9% Sau 4 ngày đo hoạt tính CMCase chọn ra hàm lượng tốt nhất

3.4.2.4 Bước 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc.

Thí nghiệm 7: Sử dụng các điều kiện tối ưu như trong các thí nghiệm trên, nhưng môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở các pH= 3, 4, 5, 7, 8 Ở đây ta dùng NaOH và HCl để chỉnh pH Thí nghiệm được khảo sát trong khoảng thời gian 7 ngày Sau mỗi ngày ta đều lấy dịch lọc để đo hoạt tính CMCase Chọn pH tối ưu và thời gian tối ưu tương ứng với pH đó

3.4.2.5 Bước 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulase

Thí nghiệm 8: Nhiệt độ ở đây không phải là nhiệt độ nuôi cấy mà là nhiệt độ trong phương pháp xác định hoạt tính enzym CMCase Môi trường nuôi cấy sử dụng tất cả các điều kiện tối ưu trên Khi xác định hoạt tính CMCase ta để enzym tác dụng

ở các nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 60 Chọn ra nhiệt độ tối ưu cho enzym cellulase

3.4.2.6 Bước 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase.

Thí nghiệm 9: sử dụng tất cả các điều kiện tối ưu trên Đo hoạt tính CMCase với các giá trị pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 ( dùng dung dịch đệm photphat) Chọn giá trị pH tối ưu

3.4.2.7 Bước 7: Thử ứng dụng enzym cellulase thủy phân cơ chất rơm.

Thí nghiệm 10: cơ chất ở đây đã được tiền xử lý trước Với các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên, ta nuôi cấy nấm mốc sau đó lọc lấy dịch lọc đem thủy phân cơ chất rơm Cách tiến hành giống như trong phương pháp xác định hoạt tính CMCase nhưng thay nguồn cơ chất CMC 1% bằng rơm với 3 hàm lượng khảo sát là 5%, 10% và 20% (w/v)

Hệ số thủy phân A được tính bằng tỉ số lượng đường tạo thành khi dùng 1ml dịch môi trường nuôi cấy để thủy phân cơ chất trong thời gian 1h trên lượng cơ chất sử dụng để thủy phân Hệ số này được tính ra %

3.5 Trình tự tiến hành xác định hoạt tính enzym cellulase[18]

3.5.1 Phương pháp thử nhanh bằng cách đo đường kính vòng thủy phân

Nguyên lý: khi enzym tác dụng lên cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị

phân giải làm độ đục môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt Độ trong suốt

tỉ lệ vơi độ hoạt động của enzym

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường có chứa 2% agar, 1% CMC trong dung dịch đệm photphat 0,1 M, pH=5 rồi phân phối vào đĩa petri Sau khi thạch đông ta khoét lỗ nhỏ trên thạch có đường kính 10mm Lấy một ít dịch từ môi trường lỏng đem lọc vô trùng và lấy 50l dịch lọc cho vào lỗ trên hộp petri Để 400C sau thời gian 48giờ

Sau đó cho 5ml dịch Congo đỏ 1% vào hộp petri trong thời gian 15 phút Gạn bỏ dịch Congo, cho thêm 5ml dung dịch NaCl 1M vào và tráng đều Đợi 15 phút Vùng màu vàng trên nền đỏ tía là chỗ enzym tác dụng

3.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính CMCase bằng cách đo lượng đường

khử tạo thành

- Nguyên lý: khi enzym tác dụng trên cơ chất cellulose, dưới tác dụng của phức

hệ enzym cellulase cơ chất bị phân giải tạo thành đường khử Dùng phương pháp so màu DNS ta xác định được lượng đường khử tạo thành từ đó tính được hoạt độ của enzym

Hoạt độ enzym được tính bằng đơn vị UI/ml Một UI được định nghĩa là lượng enzym thủy phân cơ chất tạo thành 1m glucose trong 1phút ở nhiệt độ thích hợp

- Cách tiến hành:

Cách pha thuốc thử DNS:

Cho 1,6 g NaOH vào 20ml nước cất, khuấy đều Cho tiếp 1g DNS vào 30g Natri-Kali tactrat cho vào 50ml nước cất Khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn Trộn

2 thành phần lại sau đó đánh siêu âm đến khi DNS tan hết Định mức 100ml

Để xác định hoạt tính enzym EG ta dùng cơ chất là CMC, còn để xác định hoạt tính enzym CBH ta dùng cơ chất là bông Do EG tác dụng tốt trên cơ chất cellulose biến tính, còn CBH thì tác dụng tốt trên cơ chất cellulose kết tinh

Trình tự tiến hành:

 Đo hoạt tính enzym EG (còn được gọi là hoạt tính CMCase do dùng cơ chất CMC)

Nấu CMC trong dung dịch đệm photphat 0,1M, pH=5 với nồng độ CMC 1% đến khi CMC tan hoàn toàn Sau đó ta dùng dung dịch này làm cơ chất cho enzym tác dụng

Bảng 3.1- Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác định hoạt tính

CMCase Mẫu

Chuẩn

glucose

Cơ

Đầu tiên cho cơ chất phản ứng vào ống nghiệm, cho chuẩn glucose hoặc mẫu vào Để ở 500C cho enzym tác dụng trong thời gian 20 phút Sau đó cho DNS vào và đun cách thủy ở nhiệt độ sôi trong 5 phút Làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng Đo ở bước sóng 540nm

Do trong môi trường nuôi cấy có đường khử, vì vậy để xác định hoạt tính ta cần thêm mẫu đối chứng cho mỗi mẫu đo Mẫu này có thành phần thêm vào giống như mẫu đo nhưng chỉ khác trình tự cho vào (Trong bảng là mẫu 1) Đối với mẫu 1 đầu

tiên ta cho dung dịch cơ chất vào, tiếp đó để ở 60 C trong 20 phút, sau đó cho DNS vào, cho dịch mẫu vào Đun cách thủy 5 phút giống như mẫu khác Như vậy mẫu này thể hiện lượng đường khử còn lại trong môi trường nuôi cấy