Bài làm sắc ký rây phân tử và sắc ký cột

Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm Vt Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ

Chào mừng cô và các bạn đang đến với bài

thuyết trình của nhóm

NGUYỄN THỊ KIM HUYỀN

Trường Đại Học Thủ Dầu Một Khoa Khoa Học Tự Nhiện

Trường Đại Học Thủ Dầu Một Khoa Khoa Học Tự Nhiện

Sắc ký rây phân tử &

sắc ký khí

Sắc ký rây phân tử &

sắc ký khí

ĐỀ TÀI

NỘI DUNG

SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ

SẮC KÝ CỘT

 Pha động là một dung môi hữu cơ,kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel.

 Pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel

2 Nguyên lý hoạt động

Mẫu được đưa vào cột chứa

đầy gel hoặc một loại vật

liệu xốp, và được pha động

dẫn chạy qua cột.

Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký.

Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm Vt

Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột qua các khoảng trống

giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ Vo

3 CẤU TẠO

Đường ra của cột được nối với một

detector có gắn với một máy ghi tự

Một cột sắc ký có kích thước phù

hợp

1 Xác định tỷ lệ thành phần tương đối

2 Xác định khối lượng phân tử

3 Sự phân bố polymer theo kích thước phân tử

Sắc kí rây phân tử dùng để xác định:

4 Ví dụ: Phân bố khối lượng phân tử trong dextran

Kiểm tra bằng phương

pháp sắc ký rây phân tử:

Dung dịch(1)

Dung dịch đánh dấu

Dung dịch hiệu chuẩn

Hoà tan 5 mg dextrose chuẩn và

2 mg chất đối chiếu hóa học dextran Vo trong 1ml pha động.

Hoà tan riêng rẽ 15 mg các chất đối chiếu hóa học dextran 4,dextran 10 dùng cho hiệu chuẩn và 20 mg các chất đối chiếu hóa học dextran 40,dextran 70, dextran 250 dùng cho hiệu chuẩn trong 1 ml pha động.t đối chiếu hóa học dextran Vo trong 1ml pha động.

Hoà tan 0,200 g mẫu thử vào pha

động và pha loãng tới 10 ml bằng

pha động.

Chuẩn hóa hệ thống sắc ký

Tiến hành tiêm lặp lại vài lần một thể tích nhất định dung dịch đánh dấu.

 peak đầu tương ứng chất đối chiếu dextran Vo V0

 peak thứ 2 là của dextrose Vt

Tiêm một thể tích nhất định các dung dịch chuẩn Vẽ cẩn thận đường nền của mỗi sắc ký đồ Phân chia mỗi sắc

ký đồ thành p phần (ít nhất là 60) bằng những đường gạch thẳng dọc bằng nhau.

 Vt = thể tích thấm tổng của cột, được xác định bởi píc tương ứng với dextrose trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch đánh dấu,

 Vi = thể tích rửa giải của phần i trong sắc ký đồ thu được với mỗi dung dịch chuẩn

Tiến hành hiệu chuẩn

Vẽ đường cong chuẩn:

Tiến hành hiệu chuẩn

Tính toán qua đường cong chuẩn:

Trong đó:

p = số phân đoạn chia trong sắc ký đồ,

y = chiều cao của đường sắc ký phía trên đường nền trong phân đoạn i.

Mi = khối lượng phân tử trong phân đoạn i.

Điều kiện sắc ký rây phân tử:

Cột (0,3 m x 10 mm) nhồi agarose loại liên kết chéo dùng trong sắc ký hoặc một dãy các cột (0,3 m x 10 mm) nhồi gel polyether hydroxyl hóa dùng trong sắc ký

 Dung dịch chứa 7g natri sulfat khan và 1g clorobutanol trong 1lít nước đểlàm pha động, tốc

độ dòng 0,5 - 1 ml/phút, giữ ổn định với sai số ±1%/giờ

 Detector khúc xạ ánh sáng vi sai

Buồng tiêm mẫu dung tích 100 - 200 μl duy trì hệ thống hoạt động ở nhiệt độ ổn định (± 0,1°C)

Phần II SẮC KÝ CỘT

1 KHÁI NIỆM:

Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng ai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ

2 NGUYÊN TẮC:

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng oxid nhôm, silicagel,CaCO3, than

hoạt tính, polyamid,… các chất này phải được tiêu chuẩn hóa

Dung môi dùng có thể là 1, 2 hoặc 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp

2 NGUYÊN TẮC:

Với các chất hấp phụ cổ điển dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.

Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có mút mài để nối với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ

Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt

2 NGUYÊN TẮC:

• Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển.

• Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh

3 ĐIỀU KIỆN:

• Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao.

• Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột

3 ĐIỀU KIỆN:

Ưu điểm:

 Sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm.

 Có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn

Lựa chọn chất hấp thu

Lựa chọn dung môi

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Nạp mẫu

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(2) Lựa chọn dung môi:

Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A)

Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5l dd(A)

Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử

•

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(2) Lựa chọn dung môi:

Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp

Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực

và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột

Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:

Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này sẽ được rót lại lên đầu cột

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất

5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

Gồm 7 bước như sau:

• Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột

xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột

• Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng một

pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu

6 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT

• Bước 3: Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu

được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô

• Bước 4: Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng

dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột

6 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:

• Bước 5: Mở khoá cho dung môi chảy ra Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm

sâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu

• Bước 6: Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột

• Bước 7: Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột.

6 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:

8/30/16 33