Kỹ thuật SAC KY COT

KHÁI NIỆM: Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất... CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:Lựa chọn chất hấp thu Lựa chọn dung môi Nạ

II SẮC KÝ CỘT

1 KHÁI NIỆM:

Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất

NGUYÊN TẮC:

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng ai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.

II SẮC KÝ CỘT

Dung môi dùng có thể là 1, 2 hoặc 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp.

II SẮC KÝ CỘT

NGUYÊN TẮC:

Với các chất hấp phụ cổ điển dung môi sử dụng có độ phân cựa tăng dần

Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới

có khóa, đầu trên có mút mài để nối với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ

Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt

II SẮC KÝ CỘT

II SẮC KÝ CỘT

3 ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

Lựa chọn chất hấp thu

Lựa chọn dung môi

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Nạp mẫu

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(1)Lựa chọn chất hấp thu:

Pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.

Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên

di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nóở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực.

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(2) Lựa chọn dung môi:

Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A)

Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5l dd(A)

Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn

UV hay thuốc thử

•  

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(2) Lựa chọn dung môi:

Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp

Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột

Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:

Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột

để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất

II SẮC KÝ CỘT

4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(4) Nạp mẫu:

Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc

ký Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký

II SẮC KÝ CỘT

5 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:

Gồm 7 bước như sau:

• Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để

hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột.

• Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu

cột Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu.

II SẮC KÝ CỘT

5 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:

• Bước 3: Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra

khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô

• Bước 4: Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung

môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột

II SẮC KÝ CỘT

5 THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT:

• Bước 5: Mở khoá cho dung môi chảy ra Lặp laị

vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu

• Bước 6: Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát

hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu

để bảo vệ mặt cột

• Bước 7: Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành

giải ly trên cột

II SẮC KÝ CỘT

6

II SẮC KÝ CỘT