Đề cương Sinh học phân tử và kỹ thuật gene

Điều này cho phép sự liên kết enzym mồi primase và ARN polymerase vào các sợi DNA mẹ để tổng hợp sợi dẫn đầu và liên kết của enzym mồi primase với sợi DNA còn lại để tổng hợp sợi theo

Đề cương Sinh học phân tử và kỹ thuật gene

Câu 1: Cho biết các đặc điểm về cấu trúc và chức năng của protein?

Kích thước và hình dạng:

Các protein có thể được phân thành hai lớp lớn Protein dạng hình cầu được cuộn xoắn chặt và trong dung dịch nó thường có dạng ít nhiều giống các hạt hình cầu Phần lớn các enzyme trong tự nhiên có dạng hình cầu Protein dạng hình sợi có tỷ lệ chiều dài/chiều rộng khá biến động và thường là các protein cấu trúc quan trọng

Khối lượng phân tử của protein có thể thay đổi từ vài nghìn Da cho tới 5 triệu Da

Một số protein có chứa những phần không mang bản chất protein

Protein có 4 cấu trúc:

+ Cấu trúc bậc 1: liên kết peptide.

Nhóm α – carboxyl của acid amin này phản ứng với nhóm α – amino của acid amin kế tiếp tạo thành liên kết peptide Nhiều acid amin liên kết lại bằng liên kết peptide tạo thành chuỗi polypeptide

Axit amin ở một đầu của chuỗi polypeptit có nhóm α – amino tự do, còn ở đầu kia là nhóm α – cacboxyl Vì vậy, chuỗi polypeptit là dạng phân tử phân cực, có N ở đầu này và

C ở đầu kia Đôi khi đầu N bị khống chế, ví dụ bằng nhóm acetyl Trình tự axit amin từ đầu N đến đầu C là cấu trúc sơ cấp của chuỗi polypeptit

Kích thước thông thường của một chuỗi polypeptit trong khoảng 100 – 1500 axit amin Tuy nhiên cũng có những chuỗi ngắn hoặc dài hơn

+ Cấu trúc bậc 2: tương tác giữa các nguyên tử gần nhau

Gồm có xoắn α và gấp nếp β Những vùng có cấu trúc bậc 2 xoắn α thường được tìm thấy

ở những protein dạng cầu và ở 1 vài protein dạng sợi Nếp gấp β phẳng được hình thành nhờ các liên kết hydro giữa các nhóm N - H và C = O của liên kết peptide với các nhóm

bổ trợ trên các vùng khác của chuỗi polypeptide

+ Cấu trúc bậc 3: tương tác giữa các nguyên tử xa nhau

Sự kết hợp giữa các xoắn α, gấp nếp β với những cấu trúc bậc 2 cỡ nhỏ khác và những vòng nối cuộn lại thành cấu trúc không gian 3 chiều chính là cấu trúc bậc 3 của chuỗi polypeptide

Bản chất của cấu trúc bậc ba được định sẵn ở cấu trúc bậc một Trong điều kiện nhất định, hầu hết các chuỗi polypeptide cuộn xoắn một cách tự nhiên thành cấu trúc bậc ba,

vì đó là cấu hình tiêu tốn ít năng lượng nhất Tuy nhiên sự cuộn xoắn đúng được thực hiện nhờ protein có tên gọi là chaperon, sao cho các acid amin mang chuỗi phụ ưa nước nằm chủ yếu ở phía ngoài, trong khi các acid amin kỵ nước nằm ở phía trong, điều đó giúp cho cấu trúc ổn định

+ Cấu trúc bậc 4: sự sắp xếp, kết hợp giữa các tiểu đơn vị.

Nó cho phép những phân tử protein rất lớn được tạo ra và có thể làm cho protein có khả năng hoạt động chức năng cao nhờ kết hợp các hoạt tính khác nhau vào một đơn vị thống nhất

Chức năng của protein:

+ Là các enzyme:Ngoài một số phân tử ARN có hoạt tính xúc tác còn tất cả các enzyme đều là protein Các enzyme có thể làm cho tốc độ của các phản ứng sinh hóa tăng nhiều lần

+ Là các chất tín hiệu: Các protein thụ quan trên màng tế bào có thể liên kết các phối

thể (ligand), ví dụ như hormon, từ môi trường ngoại bào và thay đổi cấu hình để tế bào đáp ứng lại với các phối thể đó Trong sự gắn kết này thường thì phối thể không bị biến đổi Bản thân một số hormon là các phân tử protein nhỏ, ví dụ như isulin và hormon sinh trưởng

+ Vận chuyển và dự trữ: Hemoglobin vận chuyển oxy trong các tế bào hồng cầu, trong

khi transferrin vận chuyển sắt đến gan Một khi đã ở trong gan, sắt được dự trữ ở dạng gắn với protein ferrintin Các chất béo được lưu thông trong máu nhờ các lipoprotein Nhiều phân tử và ion khác được vận chuyển và dự trữ ở dạng gắn kết với protein Điều

đó có thể giúp tăng cường tính hòa tan và giảm tính phản ứng cho đến khi chúng cần được sử dụng

+ Cấu trúc và vận động: Collagen là protein chính trong da, xương và mô liên kết, trong

khi tóc được cấu tạo chủ yếu từ keratin Còn có nhiều protein cấu trúc khác bên trong tế bào, ví dụ như trong bộ khung xương tế bào Acin và myosin – các protein chủ yếu của

cơ – tạo nên các sợi dễ trượt, là cơ sở của sự co cơ

+ Dinh dưỡng: Casein và ovalbumin là các protein chính của sữa và trứng, được sử dụng

để cung cấp axit amin cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể Các protein trong hạt cũng cung cấp chất dinh dưỡng cho cây phôi nảy mầm

+ Miễn dịch: Các kháng thể nhận biết và gắn kết với các vi khuẩn, virut và các chất lạ

khác (kháng nguyên) là các protein

+ Điều hòa: Các yếu tố phiên mã gắn kết và điều chỉnh hoạt động chức năng của DNA

Nhiều protein khác làm biến đổi chức năng của các phân tử bằng cách gắn kết với chúng

Câu 2: Mô tả các bước của sự tái bản DNA sợi kép ở prokaryot (tái bản DNA nửa gián đoạn).

Khởi đầu tái bản:

Để bắt đầu quá trình tái bản, enzym DNA gyrase sử dụng ATP làm nguồn năng lượng để tháo xoắn phân tử DNA Điều này là cần thiết để phức hợp khởi đầu protein Rep, helicase

và SSB có thể hoạt động

Các bước cần thiết cho khởi đầu tái bản ở vị trí khởi đầu (OriC) là:

+ Protein DnaA bám vào OriC, phá vỡ các liên kết hydro giữa các cặp bazơ tại đó Có khoảng 40 liên kết hydro bị phá vỡ Quá trình này đòi hỏi phải được cung cấp năng lượng

là ATP

+ Liên kết của protein DnaA hỗ trợ cho sự liên kết của các DnaB và DnaC tại vị trí OriC

Và như vậy phức hợp khởi đầu tái bản đã được tạo thành

+ Enzym helicase, protein DnaB và protein Rep cùng với enzym gyrase và SSB bắt đầu tháo xoắn và tách 2 sợi đơn của DNA ra Điều này cho phép sự liên kết enzym mồi primase và ARN polymerase vào các sợi DNA mẹ để tổng hợp sợi dẫn đầu và liên kết của enzym mồi primase với sợi DNA còn lại để tổng hợp sợi theo sau

Chạc tái bản: hai sợi của phân tử DNA chạy song song và ngược chiều nhau DNA luôn được tổng hợp theo chiều 5’ – 3’ Như vậy nếu tính từ điểm gốc tái bản OriC thì một sợi của DNA mẹ chạy theo chiều 5’ – 3’ trong khi sợi kia chạy theo chiều 3’ – 5’

Sự hình thành primosome:

Mỗi khi protein Rep và protein SSB đã bám vào điểm khởi đầu, sự liên kết tiếp theo của enzym ARN polymerase và helicase sẽ tạo thành phức hợp mồi gọi là primosome Đó là phức hợp enzym – protein

Trong primosome, các ARN mồi được sản xuất và tạo thành đầu 5’ của mỗi đoạn

Okazaki

Tổng hợp sợi dẫn đầu:

Bởi vì sợi dẫn đầu song song ngược chiều với sợi ADN khuôn của nó và chiều tổng hợp cũng trùng với hướng phát triển của chạc tái bản nên chỉ cần tổng hợp một mồi ARN Sau đó ADN polymerase III sẽ chịu trách nhiệm gắn liên tục các deoxynribonucleotit vào đuôi 3’ của sợi đang tổng hợp

Tổng hợp sợi theo sau:

Các bước kế tiếp nhau xảy ra quá trình tổng hợp sợi theo sau là:

+ Đoạn mồi ARN được tổng hợp bởi primosome

+ Sợi theo sau ở phía sau của phức hợp ARN – ADN cuộn vòng lại 1800 vào trong phức hợp ADN polymerase III, sau đó sẽ kéo dài sợi bằng việc tổng hợp ADN

+ Tổng hợp ADN tiếp tục cho đến khi ADN polymerase đã nối được khoảng 1000 – 2000 deoxyribonucleotit và chạm tới đầu 5’ của đoạn Okazaki tổng hợp trước đó

+ Ở thời điểm này, DNA polymerase sẽ tách khỏi sợi gốc và SSB cũng được giải phóng + Khi DNA tiếp tục được tổng hợp, có nhiều SSB hơn bám vào sợi gốc ngay sau DNA polymerase

+ Sau khi SSB bám vào sợi gốc, primosome liên kết với sợi gốc và bắt đầu tổng hợp đoạn mồi ARN tiếp theo và như vậy chu kỳ tổng hợp đoạn Okazaki được lặp lại

+ Sau khi đã có nhiều đoạn Okazaki được tổng hợp (ít nhất là 2) thì DNA polymerase I

có vai trò như enzym polymerase kéo dài chuỗi và enzym hoạt tính exonuclease cắt 5’ – 3’, nó bắt đầu đưa ra thêm các deoxyribonucleotit vào chuỗi 3’ của đoạn Okazaki, đồng thời tách các ribonucleotit của đoạn mồi ARN ở đầu 5’ của đoạn Okazaki ngay trước nó Hai hoạt động enzym này (polymerase và exonuclease) tiếp tục cho đến khi tất cả các mồi ARN được tách bỏ Vào thời điểm đó, chỉ cần một liên kết phosphodieste là có thể nối hai đoạn Okazaki cạnh nhau Các đoạn Okazaki bây giờ chỉ gồm toàn các

deoxyribinucleotit

+ Enzym DNA ligase sẽ bắt đầu vai trò sử dụng ATP là nguồn năng lượng, tổng hợp cầu nối phophodieste bằng việc liên kết đầu 3’ của đoạn Okazaki này với đầu 5’ của đoạn Okazaki trước nó qua nhóm 5’ – phosphoryl

Những bước này được lặp lại nhiều lần cho đến khi cả sợi dẫn đầu và sợi theo sau của một chạc tái bản được tổng hợp hoàn tất

Bằng cách đó, quá trình tổng hợp DNA theo hai chiều kết thúc

Câu 3: Gen là gì? Gen cấu trúc và gen điều hòa có đặc điểm gì? So sánh gen cấu trúc ở prokaryot và eukaryote.

Gen: Là 1 đơn vị di truyền mang thông tin cho một chuỗi polypeptide hoặc 1 phân tử

ARN

Tùy thuộc vào chức năng, gen được xếp vào gen cấu trúc hay gen điều hòa:

Gen cấu trúc: mã hóa cho chuỗi polypeptide hay ARN phục vụ cho các hoạt động trao

đổi chất thông thường của tế bào Do đó, 1 gen cấu trúc là 1 đoạn ADN hay ARN trong 1

số virut, mang thông tin mã hóa hoàn toàn cho 1 phân tử ARN vận chuyển (tARN), ARN ribosome (rARN) hoặc 1 polypeptide

Gen điều hòa: mã hóa cho nhũng polypeptide để tạo thành các protein có chức năng điều

hòa sự biểu hiện của gen cấu trúc

Gen thường nằm ở 1 vùng nhất định trên nhiễm sắc thể và có quan hệ đến trạng thái sinh lý của cơ thể sống Gen tự nó không tạo nên hay sinh ra bất cứ 1 cái gì Một tập hợp gen

hoàn chỉnh của 1 tế bào sống gọi là bộ gen (gener) hay hệ gen Kích thước gen có thể được xác định bằng bản đồ di truyền và tần số trao đổi chéo Trung bình 1 gen của prokaryot có khoảng 800 – 1500 cặp bazo, còn gen ở người khoảng từ hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn nucleotide

So sánh gen cấu trúc ở prokaryote và eukaryote:

Prokaryote

+ Được cấu tạo bởi các đoạn nucleotide

không bị ngắt quãng bởi những đoạn không

mã hóa

+ Thường được hoạt hóa từng nhóm Được

gọi là đơn vị phiên mã đa cistron, nghĩa là

một đơn vị phiên mã mang thông tin cho

việc tổng hợp ít nhất là hai chuỗi

polypeptit

Đơn vị phiên mã có sự sắp xếp các đoạn

nucleotide như sau: đoạn dẫn đầu, đoạn

khởi động, đoạn mã hóa, đoạn kết thúc

Eukaryote

+ Được cấu tạo bởi các đoạn nucleotide mã hóa (exon) và không mã hóa (intron) Do

đó gen của eukaryote đôi khi được gọi là gen phân mảnh (không liên tục) Các intron không có mặt 1 cách ngẫu nhiên dọc trên gen mà chúng hiện diện ở những vị trí nhất định Trong quá trình tổng họp protein

ở Eukaryot, các intron được tách ra khỏi phân tử mRNA ngay sau khi mRNA được tổng hợp

+ Đơn vị phiên mã: đơn cistron ARN thông tin chỉ mang thông tin cho 1 chuỗi polypeptide

Câu 4: Kỹ thuật gen là gì? Đặc điểm của vectơ tách dòng? Mô tả ngắn gọn 1 số loại vecto tách dòng?

Kỹ thuật gen: Là thuật ngữ chỉ tập hợp nhiều kỹ thuật nghiên cứu gen, bộ gen và các

thao tác trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo ra các gen mới

Đặc điểm của vectơ tách dòng:

+ Vectơ tách dòng là các phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép gắn các đoạn DNA cần thiết

+ Có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào

+ Tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ, không biến đổi bộ gene của tế bào vật chủ

+ Vectơ tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiệu, mang các gen chỉ thị màu hoặc kháng sinh Được sử dụng như 1 “phương tiện vận chuyển gen” nhằm tạo 1 số lượng lớn các bản sao của 1 gen hoặc 1 trình tự DNA trong các tế bào chủ

Một số loại vectơ tách dòng:

+ Vectơ tách dòng là plasmid: là các phân tử DNA xoắn kép dạng vòng, có kích thước nhỏ, trong tế bào chất của tế bào vi khuẩn hay tế bào nấm men Có khả năng tự tái bản độc lập với sự phân chia tế bào

+ Vectơ tách dòng là phage: Phage bao gồm nhiều loại thực khuẩn thể (ký sinh ở trong vật thể) có bộ gen DNA mạch đơn hoặc mạch kép Các vectơ tách dòng là phage thường được tạo nên từ sự cải tiến bộ gen phage Có ưu điểm so với plasmid là cài đoạn lớn hơn, tạo nhiều bản sao

+ Vectơ tách dòng là phagemid: gồm 1 số gen của plasmid (các gen chỉ thị, đoạn ori…)

và 1 phần gen của phage (đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói)

+ Vectơ tách dòng là cosmid: thiết kế từ 1 đoạn của plasmid và đoạn cos của phage Có thể được gắn thêm đoạn đa cắt nối (MCS), đoạn khởi đầu tái bản (ori)

+ Vectơ tách dòng là các nhiễm sắc thể nhân tạo: mỗi loại có những đặc điểm đặc trưng riêng, cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước khác nhau

+ Vectơ tách dòng là Ti plasmid: là plasmid có kích thước lớn tới 200 kb trong tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefacien Ti plasmid có 1 đoạn T – DNA khoảng 10 – 20 kb mang các gen tổng hợp opin, auxin gây khối u ở thực vật 2 lá mầm

+ Vectơ tách dòng ở tế bào sinh vật Eukaryot: thường được thiết kế từ promoter của

PCMV, trình tự ori của virus SV40, đoạn đa cắt nối (MCS) và một đoạn gen của vi khuẩn E.coli

Câu 5: Cho biết các enzyme thường dùng trong kỹ thuật gen Các kiểu cắt của ezyme giới hạn.

Các enzyme thường dùng trong kỹ thuật gen:

+ Enzyme giới hạn: có khả năng nhận biết các trình tự nucleotid đặc hiệu trên phân tử DNA (khoảng 4 – 8 nucleotid)

+ Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA:

Nhóm enzym xúc tác tổng hợp DNA gọi chung là DNA polymerase, xúc tác gắn các nucleotid mới vào chuỗi mạch đơn DNA đang tổng hợp, điển hình là tad DNA

polymerase, pfu DNA polymerase,…

Enzym phiên mã ngược xúc tác tổng hợp cDNA từ mạch khuôn là RNA

Enzym xúc tác tổng hợp RNA gồm các loại thông dụng là T3 RNA polymerase và T7

RNA polymerase

+ Enzyme nối DNA: xúc tác hình thành các liên kết phosphoeste

+ Các loại enzyme phân cắt acid nucleic: cắt phân tử DNA hay RNA, có vai trò quan trọng trong các kỹ thuật tinh sạch DNA, RNA, trong phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA

Các kiểu cắt của enzyme giới hạn:

Cắt đầu bằng hoặc đầu so le

Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng 1 điểm tạo các đoạn cắt có đầu bằng Các đoạn DNA có đoạn cắt bằng đầu bằng không có khả năng tự dính lại với nhau, để nối các đoạn này cần sử dụng enzyme nối (DNA ligase)

Các loại enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí khác nhau tạo nên các đoạn cắt có đầu so le (hay đầu dính) Các đoạn DNA có đầu so le có thể tự nối với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase

Câu 6: Mô tả đặc điểm cấu trúc vectơ biểu hiện gen và các loại

promoter thường sử dụng trong biểu hiện gen? Ưu điểm và hạn chế trong biểu hiện gen ở E.Coli?

Đặc điểm cấu trúc vectơ biểu hiện gen:

Vectơ biểu hiện gen cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng, tạo nên các protein lai

Thành phần: promoter mạnh, trình tự sao chép (Ori), vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc dịch mã, các trình tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ thị… Vectơ biểu hiện mạnh có các đặc điểm:

+ Tạo nhiều bản sao trong tế bào chủ

+ Dịch mã tạo nhiều protein lai

+ Đoạn MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu

+ Hoạt động của vectơ không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ

Các loại promoter thường sử dụng trong vectơ biểu hiện gen:

+ Các loại vectơ biểu hiện gen trong tế bào prokaryote thường sử dụng các promoter mạnh của thực khuẩn thể (T7 promoter, T3 promoter,…) hoặc 1 số promoter mạnh của vi khuẩn (lac promoter, Trp promoter,…) là những loại vectơ thích hợp với nhiều loại RNA polymerase

+ Trong tế bào eukaryote thường sử dụng các vectơ biểu hiện gen có các promoter mạnh của virus như CMV (cytomegavirus), SV40,… hoặc các promoter mạnh của nấm men như PGK promoter, GAL, AOX I promoter

Ưu điểm và hạn chế trong biểu hiện gen của E.coli :

Ưu điểm:

+ Tốc độ sinh trưởng nhanh

+ Khả năng biểu hiện promoter mạnh

+ Khả năng tạo sản phẩm gen cao, từ 50mg/lít đến 500mg/lít

+ Giảm được các chi phí cho công nghệ và hóa chất, nên giá thành sản phẩm hạ

+ Cấu trúc và các đặc điểm di truyền biết tương đối đầy đủ

Hạn chế:

+ Khó khăn cho protein có kích thước lớn hơn 50 kD, protein giàu cyterin hoặc protein

có nhiều liên kết disunfur S- S

+ Protein không biến đổi sau dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa

+ Có thể gây bệnh hoặc tạo các độc tố

+ Tiết protein ngoại bào tương đối thấp

Câu 7: Nguyên lý chung của phương pháp PCR Các yếu tố nào cần chú ý trong phương pháp PCR.

Nguyên lý chung của phương pháp PCR:

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ cao 94 – 95oC, làm đứt mạch liên kết hydro gen, hai sợi DNA tách rời nhau, kéo dài 1 đến 2 phút

+ Giai đoạn gắn mồi (Annealing): ở nhiệt độ cao khoảng 55 – 65oC, mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’, thời gian khoảng 30 – 60 giây

+ Giai đoạn tổng hợp (Elongation): nhiệt độ khoảng 70 – 72oC thích hợp cho hoạt động của enzyme DNA polymerase DNA polymerase xúc tác gắn nucleotid vào cuối đoạn mồi, thời gian giai đoạn này khoảng 30 giây đến vài chục phút Thời gian 2 phút tổng hợp được những đoạn DNA kích thước dưới 2 kb

+ Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, sản phẩm tạo ra làm khuôn cho phản ứng tiếp theo,

20 – 40 chu kỳ Như vậy, mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220 – 240 bản sao DNA

Các yếu tố cần chú ý trong phương pháp PCR:

+ DNA khuôn (DNA template): sạch Nhỏ hơn 3kb cho kết quả tốt Có thể khuếch đại từ mẫu máu, tóc, xương

+ Các nucletid tự do (dNTP): gồm dATP, dTTP, dGTP và dTCP Chú ý đến tỷ lệ G – C trong đoạn khuôn Nồng độ dNTP khoảng 50 – 200 μm

+ Mồi (primer): đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 14 – 35 nucleotid, gồm mồi xuôi F (Forward) và mồi ngược R (Revert) Mồi xuôi có trình tự tương đồng mạch DNA không mang mã Mồi ngược có trình tự tương đồng mạch DNA mang mã di truyền

Điều kiện đảm bảo mồi: mồi không quá ngắn (nhỏ hơn 8 nucleotid) hoặc quá dài (lớn hơn

50 nucleotid) Trình tự mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp đầu 3’ Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không chênh lệch nhau

+ Enzyme DNA Polymerasa:

Tag DNA Polymerasa được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm, có hoạt tính cao ở

75 – 80oC, tốc độ tổng hợp mạch đơn DNA rất cao (trung bình 130 – 300

nucleotid/1giây)

Pfu DNA Polymerasa có hoạt tính ở nhiệt độ 72 – 78oC, tốc độ xúc tác tổng hợp mạch đơn DNA chậm, khoảng 12/1 giây, nhưng tỷ lệ sai sót giảm đi nhiều lần so với Tag + Dung dịch đệm cho PCR: ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi vào khuôn

+ Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: có thể thực hiện phản ứng với bể ổn nhiệt, bộ đếm giờ với dụng cụ thông dụng Các hãng sản xuất khác nhau ngày càng đưa ra các loại máy PCR thế hệ mới, có nhiều đặc điểm tiện lợi, cho kết quả cao, tốn ít thời gian thực hiện phản ứng

Câu 8: Cho biết cấu trúc gen mã hóa insulin ở người và công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp.

Cấu trúc gen mã hóa insulin ở người:

Gen mã hóa insulin nằm ở nhiễm sắc thể số 11, trên cánh ngắn (11p)

Vùng không mang mã di truyền chia làm 3 cụm gen, ký hiệu class I, class II và class III Vùng mã hóa có kích thước 1430kb Trong vùng mã có 2 intron

Đoạn gen mã hóa 4 chuỗi peptid trong cấu trúc phân tử insulin: chuỗi peptid tín hiệu, chuỗi peptid B, chuỗi peptid C và chuỗi peptid A

Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp:

Nguyên lý chung gồm:

+ Tách chiết và tinh sạch RNA thông tin mã hóa preproinsulin

+ Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược

+ Sử dụng enzyme giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa chuỗi peptid C, tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và chuỗi B

+ Tạo vectơ biểu hiện gen đoạn A và gen B

+ Biến nạp riêng mỗi loại vectơ trong E.coli

+ Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A – lacZ và chuỗi B – lacZ

+ Thu riêng từng loại protein lai và thực hiệc các phản ứng cắt với cyanua bromide (CNBr) giữa acid amin cuối cùng của insulin và acid amin của β – Galactosidase

+ Tách và tinh sạch riêng biệt các chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp chuỗi A với B hình thành cầu nối disunfit và thu insulin thành phẩm

Câu 9: Vaccin tái tổ hợp và vaccin DNA là gì? Kỹ thuật sản xuất vaccin tái tổ hợp phòng chống bệnh viêm gan?

Vaccin tái tổ hợp là: Các loại vaccin sản xuất bằng kỹ thuật gen, nhờ tạo các sản phẩm

protein kháng nguyên tái tổ hợp trong các tế bào chủ

Vaccin tái tổ hợp điển hình là vaccin phòng chống các bệnh viêm gan (B, A, C,…), vaccin phòng chống HIV và các bệnh sốt xuất huyết, sốt rét, cúm gà,…

Nó có ưu điểm như: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nhiễm vi khuẩn, kí sinh trùng, virus,…

Vaccin DNA là: Tập hợp các gen mã hóa kháng thể đặc hiệu thường được gắn vào các

vectơ biểu hiện mạnh, khi đưa vào tế bào các gen được dịch mã tạo các kháng thể đặc hiệu, giúp tế bào chống lại sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh

Loại vaccin này có hiệu quả cao trong phòng chống nhiều bệnh hiểm nghèo (ung thư, HIV,…) Vaccin DNA gồm hai loại chủ yếu là vaccin tập hợp các gen kháng nguyên và vaccin tập hợp các gen sinh kháng thể trực tiếp

Nó có nhiều ưu điểm như: dễ dàng thiết kế và sản xuất, bảo quản được lâu, vận chuyển

và sử dụng đơn giản, tiện lợi,…

Kỹ thuật sản xuất vaccin tái tổ hợp phòng chống bệnh viêm gan:

+ Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản xuất ở nấm men S cerevisiae

từ năm 1981 Sử dụng bắt đầu từ 1986

+ Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax IIB, Engerx – B, Genhevac B…được sản xuất trong tế bào nấm men và vi khuẩn

HBV vaccin sử dụng gen mã hóa protein vỏ Protein kháng nguyên HBsAg có khả năng tạo kháng thể miễn dịch mạnh nhất

+ Người ta thực hiện kỹ thuật tách dòng các gen mã hóa protein vỏ của virus HBV, thực hiện tổng hợp protein tái tổ hợp và biểu hiện trong các tế bào chủ (nấm men, vi khuẩn,…) làm cơ sở sản xuất vaccin tái tổ hợp

+ Gen mã hóa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1mã hóa chuỗi peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 mã peptid có 55 a.a và gen S mã hóa chuỗi peptid có 226 a.a

+ Người ta có thể tách riêng phức hợp gen S với gen Pre – S1 hoặc phức hợp gen S với gen Pre – S2 để tạo nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau Biểu hiện các loại vectơ tái tổ hợp khác nhau thu các loại protein tái tổ hợp khác nhau, tạo nên các loại vaccin có hiệu quả khác nhau

+ Việt nam là một nước có mức nhiễm HBV trong cộng đồng dân cư ở mức cao: viêm gan cấp tính do HBV khoảng 37 – 49%, xơ gan có HBV là 47 – 87%, ung thư gan có HBV là 57 – 80%

+ Gần đây một loại vaccine viêm gan B mới được tạo nên từ sự biểu hiện cả gen kháng nguyên : S, Pre – S1 và gen Pre – S2 của HBV trong tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc

Câu 10: Công nghệ tạo giống lúa vàng được thực hiện như thế nào? Theo Anh (Chị) chúng ta cần làm gì để thực hiện an toàn sinh vật biến đổi gen.

Lúa vàng đầu tiên được công bố vào năm 2000

Lúa vàng giàu vitamin A là một sản phẩm của kỹ thuật gene

Các nhà khoa học đã chuyển 2 gene mã hoá enzyme phytoene synthase (psy) từ hoa Thuỷ Tiên vàng (Daffodil) và enzyme phytoene desaturase (CrtI) từ vi khuẩn đất (Erwinia uredovora) vào trong hệ gene của cây lúa Các enzyme sẽ giúp quá trình chuyển hoá GGPP (geranylgeranyl diphosphate) trong gạo trắng thành beta-Carotene trong gạo vàng Cũng nhờ 2 enzyme này đã giúp cho quá trình tích tụ beta-carotene trong hạt, còn ở giống lúa bình thường thì quá trình tích tụ beta-carotene chỉ diễn ra trên lá Màu vàng của gạo là

do nó chứa nhiều beta-Carotene

Sơ đồ công nghệ tạo giống lúa vàng:

+ Bước 1: Tách chiết các gen mã hóa sự tạo thành β – caroten từ cây Thủy tiên hoa vàng (daffodil) và từ khuẩn Enwinia uredorova

+ Bước 2: Tạo vectơ tái tổ hợp với các plasmid thích hợp và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefacien

+ Bước 3: Chuyển vectơ tái tổ hợp mang các gen mã hóa β – caroten vào các tế bào phôi lúa

+ Bước 4: Sàng lọc các tế bào phôi được chuyển gen, nuôi cấy mô để tạo dòng lúa có khả năng tạo β – caroten trong hạt gạo Sau đó thực hiện lai chéo dòng lúa nuôi cấy mô có hàm lượng β – caroten cao được tạo ra với các giống lúa địa phương nhằm tạo ra giống lúa lai có khả năng tạo β – caroten cao Tiếp tục cho lai giống để đảm bảo tính ổn định di truyền của các giống lúa có hàm lượng β – carotene cao

Thực hiện an toàn sinh vật biến đổi gen:

Sinh vật biến đổi gen:

+ Gây nhiều tranh cãi

+ Tổ chức y tế thế giới (WHO) khẳng định cây chuyển gen và động vật chuyển gen không tác hại đến sức khỏe con người

+ Vấn đề nhân bản người nên hay không nên? Mục đích nhân bản người? là vấn đề còn được tiếp tục tranh luận

+ Ở Việt Nam hành lang pháp lý về an toàn sinh học còn chưa cụ thể

Để an toàn sinh vật biến đổi gen, nên thực hiện các công việc sau:

+ Tổ chức nghiên cứu triển khai về ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp của sinh vật biến đổi gen

+ Các mặt hàng nhập khẩu có nguồn gốc là sinh vật biến đổi gen phải ghi rõ nhãn mát + Cần có một cơ quan quản lý có uy tính, chất lượng Không để thất thoát các sinh vật biến đổi gen ra môi trường khi chưa biết hết ảnh hưởng của nó

+ Trong sản xuất nông nghiệp, sinh vật biến đổi gen cần có quy trình sản xuất khép kín, phấn hoa và thân cây cần có chế độ xử lý an toàn, như thiêu hủy xác cây sau mỗi mùa thu hoạch

+ Xây dựng các phòng thí nghiệm nghiên cứu phải đảm bảo theo những tiêu chuẩn tốt nhất hiện hành

+ Thực hiện an toàn xuyên quốc gia, không nhập khẩu hoặc xuất khẩu các sinh vật có nguồn gốc là sinh vật biến đổi gen khi nó vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng

+ Cần có một rào cảng pháp lý an toàn cho con người và sinh vật trên trái đất