CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký cột

Sắc ký Chromatography là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc

TS: Ngô Đại Nghiệp

Lớp: SHO7B1

Nhóm 4 MSSV

 Nguyễn Đinh Diễm Thụy

30700514  Huỳnh Thị Lệ Phương 30760857

 Nguyễn Anh Tôn 30700536

 Trần Quốc Nhẫn 30700342

 Đỗ Minh Trí 30760942

 Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ

protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa

các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó

 Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào

các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác

nhau vốn có của nó

 Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho

việc tinh sạch, người ta gắn vào protein một đuôi acid amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp

(fusion protein)

 Tủa protein

 Thẩm tích

 Siêu lọc

 Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)

 Điện di protein (điện đi trên gel Agarose, điện di trên gel Polyacrylamide, điện di protein theo

điểm đẳng điện… )

Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein là sắc ký cột (column chromatography).

Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được

sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh

Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi

(là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các

chất Thông thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào một dung môi

(pha động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột theo cách phù hợp sao cho chất

nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký.

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân

bố khác nhau của các chất giữa hai pha

động và tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha

tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc

tách sắc ký

K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động.

 Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase,

thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết

định quá trình sắc kí

thuộc vào chất nhồi cột

Thực hiện:

và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó

nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt

1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn

định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ

thay đổi độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa : lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra , mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ Sau đó đem chấm bản các hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất Tiếp tục như vậy thì cuối cùng

ta sẽ tách được các chất mong muốn.

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản

nhất ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử

trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay

đường cong thoát (có tác giả gọi là

đường cong xuất)

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người

ta cho V ml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A

có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa trong V ml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột

nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía

dưới nhanh hơn B

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi

đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với

pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách

Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần

xuống phía dưới khi ta tiến hành quá

trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi

cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực

với cột mạnh dần

V PHÂN LOẠI CÁC

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:

chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được gắn lên trên chất mang rắn

Pha động : có thể là chất lỏng hoặc chất khí.

kỹ thật sắc ký khí Trong trường

hợp này chất khí được gọi là khí

mang hay khí vecto

kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp

mỏng, sắc ký cột Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly (eluant).

Sắc ký phân chia (Partition chromatography)

 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc

ký khí).

 Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lòng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn và

có tính trơ.

Sắc ký hấp thu (Adsorption

chromatography)

 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

 Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn

nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong

một cái ống bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.

Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange

chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion Có hai

loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa

trao đổi cation

Sắc ký lọc gel ( Size exclusion

chromatography; gel filtration

chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

 Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng

 Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kế cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển

sẽ bị cản trở.

 Đây là một phương pháp rất hiệu quả và

được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.

 Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch.

Sắc ký ái lực (affinity chromatography):

phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp

Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.

Sắc ký lỏng cao áp:

Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper and thin- layer chromatography):

 Trong sắc ký giấy:

Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulose

Pha động : là chất lỏng.

 Trong sắc ký lớp mỏng:

Chất hấp thu thông dụng torng sắc ký lớp mỏng là silica

gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

Pha động: luôn luôn là chất lỏng

 Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, kiểu triển khai sắc ký thông dụng nhất là pha động di chuyển từ

dưới thấp lên trên cao.

Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc

ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt

dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ Mẫu

cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha

tĩnh

Pha động là dung môi được liên tục rót

vào đầu cột

Thời gian lưu (retention time): (tR )

Với máy sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha tĩnh là bột rắn, nhuyễn cực mịn, được nén trong một ống hình trụ nên

cần phải có một thiết bị tạo lực đẩy để giúp

pha động di chuyển ngang qua pha tĩnh

Thiết bị cảm biến thường được gọi là đầu dò (detector) tạo ra các tín hiệu điện tử để ghi

Độ phân giải(Resolution ,R)

 Từ sắc ký đồ, người ta biết được độ

phân giải, ký hiệu R.

 Độ phân giải của cột sắc ký cho biết cột

có khả năng tách các chất riêng ra hay

không, được định nghĩa là sự khác nhau

về thời gian lưu của hai pic kề sát nhau chia cho giá trị trung bình bề rộng đáy

của 2 pic đó

Hình học Cấu hình

sắc ký Chiều di chuyển của pha động Loại sắc ký

Phẳng Giấy Đi lên, đi xuống,

từ tâm lan tỏa

tròn

Phân chia

Phẳng Lớp mỏng Đi lên, đi xuống,

từ tâm lan tỏa

tròn

Hấp thu, phân chia, trao đổi ion,

lọc gel Cột Cột hở Đi xuống Hấp thu, phân

chia, trao đổi ion,

lọc gel Cột Sắc ký khí (GC) Nhờ vào ngoại

lực Hấp thu, phân chia

lực chia, trao đổi ion, Hấp thu, phân

lọc gel

VI CÁC LOẠI PHA TĨNH SỬ

DỤNG TRONG SẮC KÝ:

 Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silica natri (cho tác

dụng với acid sulfiric) để thành acid

polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và

polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ

rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt… như yêu cầu.

 Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của silica gel bằng các cho silica gel kết hợp với những

hợp chất khác như các bazo, các dung dịch

Silica gel- tạo nối dùng cho pha đảo

Loại silica gel pha đảo có tính kém phân cực nên có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực, giữ chặt các hợp chất này lại trong cột Pha động

thường là nước

Thực hiện các phản ứng điều chế tương tự như trên nhưng nhóm chất cuối dãy thường là phenyl, cyano, amino, diol,…

Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa lập thể của chúng Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khí đối phân còn lại không có dược tính đó, mà còn gây độc, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng

b Silica gel chế hóa:

Loại pha tĩnh thủ tính Cơ chế bắt giữ chất của pha

(Immobilised enzymes) Ái lực thủ tính

Phức amino acid kim loại Phức xuyên lập thể phân

Alumina là oxid aluminium Al 2 O 3 được điều chế với là hydroxid aluminium, có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch

phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với

bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính.

Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình

điều chế là đặc điểm khác nhau giữa

alumina và silica gel Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng ở

400- 500 o C trong 12- 16 giờ Muốn làm

giảm hoạt tính, thêm nước vào.

 Với sắc ký giấy, rất thuận tiện khi sử

dụng tờ giấy lọc làm pha tĩnh, nhưng

việc sử dụng trực tiếp có nhiều nhược điểm.

 Ngược lại, nếu pha tĩnh làm bằng bột

giấy, các hạt nhuyễn mịn và cùng kích

thước sẽ tạo nên pha tĩnh đồng nhất

nên pha động di chuyển dễ dàng hơn và chất tan không lan rộng trên bề mặt của pha tĩnh.

Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bôt, agar

(polysaccarid) hoặc polyacrylamid,

trong đó các chuỗi dây dài được nối

mạng ngang để tạo thành mạng không gian ba chiều Gel thường được sử

dụng trong sắc ký cột hoặc điện di

Tên thương

chất có trọng lượng phân tử (đơn vị C)

Thể tích gel trương nở trong nước (ml /g gel khô)

P-2 100 – 2.000 3

P-4 800 – 4.000 4

P-6 1.000 – 6.000 6,5

P-10 1.500 - 20.000 7,5

Loại gel

chất có trọng lượng phân tử ( đơn vị C)

Thể gel trương

nở trong nước (ml/g gel khô)

 Sắc ký cột khô (Dry – column

chromatography)

 Sắc ký nhanh ( còn gọi là sắc ký chớp

nhoáng) (Flash chromatography)

 Sắc ký nhanh- cột khô (Dry – column

flash chromatography; Vacuum liquid chromatography)

Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc

ký chớp nhoáng , với một vài khác biệt sau:

nhoáng sử dụng một lực đẩy từ trên đầu cột xuống,

còn sắc ký nhanh – cột khô dùng một lực hút tạo chân

không ở đầu ra của cột nhờ một máy bơm hút loại

nhẹ.

dùng cho sắc ký cột, còn sắc ký nhanh- cột khô sử

dụng silica gel dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, cỡ hạt

15- 40 micromet.

một lớp dung môi ở trên đầu cột (cột không được

khô), còn với sắc lý nhanh- cột khô cột sắc ký được

rút khô san mỗi phân đoạn thu được.

 [1] Nguyễn Kim Phi Phụng; Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ; nhà xuất bản ĐHQG Tp.HCM – 2007

methods Kluwer Academic Publishrs Boston- london, 45-501,1999.

chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution J Org chem, 1978

s/ion_exchange.htm

ds-1/ch5_ion-exchange.jpg