Phương pháp Quang phổ UV VIS

Quang phổ hấp thu phân tử - Quang phổ UV-ViS4.2 Các yếu tố tham gia vào sự hấp thụ, các hiệu ứng: a Màu sắc: Màu sắc của một chất có tầm quan trọng chuyên biệt cho chất đó.. Quang phổ hấ

Trang 1

QUANG PHỔ UV-VIS

Biên sọan: Huỳnh Văn Tiến huynhvantiensm@gmail.com

Trang 2

Mục tiêu bài giảng

 Cung cấp những kiến thức tổng quát và cơ bản về

nguyên lý của Quang phổ UV-VIS

 Giúp sinh viên ứng dụng được phương pháp

Quang phổ UV-VIS cho yêu cầu học tập, nghiên cứu và công việc

 Bổ sung một số kỹ năng phân tích kiểm nghiệm

cho sinh viên

Trang 3

Nội dung tóm tắt

 Lý thuyết: cung cấp các khái niệm, định nghĩa,

các định luật cơ bản, phương pháp phân tích về Quang phổ UV-VIS

 Thực hành: Ứng dụng Quang phổ UV-VIS trong

việc phân tích, kiểm nghiệm (đặc biệt là dược phẩm)

Trang 4

Nội dung chi tiết

1 Định nghĩa UV-VIS

2 Nguyên lý của phổ hấp thụ

3 Định luật cơ bản của hấp thụ ánh sáng (Lambert – Beer)

4 Phương pháp Quang phổ UV-VIS

5 Ứng dụng của Quang phổ UV-VIS

Trang 5

Tài liệu tham khảo

[1] Giáo trình Hóa phân tích – ĐH Y Dược TPHCM -

2013

[2] GS Chu Phạm Ngọc Sơn - Các phương pháp

phân tích hiện đại – giáo trình 2003

[3] Dược điển Việt Nam – Bộ y tế

…

Trang 6

1 Định nghĩa UV-VIS

1.1 Bản chất của ánh sáng

Trong quang phổ học: tất cả các tia của ánh sáng (ánh

sáng nhìn thấy, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia X, sóng

radio…điều được gọi chung là bức xạ)

- Tính chất sóng: (hiện tượng nhiễu xạ, giao thoa, phản

xạ…) đặc trưng là tần số, nước sóng

- Tính chất hạt: bức xạ điện từ là những hạt mang năng lượng gọi là photon, photon lan truyền với vận tốc của ánh sáng.

Ánh sáng vừa có tính chất sóng vừa có tính chất hạt

và tồn tại đồng thời.

Trang 7

Trang 8

1.2 Phân vùng sóng điện từ

Trang 9

1.2 Phân vùng sóng điện từ

Trang 10

UV-VIS (ultraviolet – visible): phổ tử ngoại 380nm) – khả kiến (380nm – 800nm)

Trang 11

(10nm-2 Nguyên lý phổ hấp thụ

2.1 Sự dịch chuyển năng lượng: khi bị kích thích bởi bức

xạ ánh sáng, điện tử có thể chuyển từ quỹ đạo của nó sang quỹ đạo cao hơn (trạng thái kích thích) Điện tử ở trạng thái

kích thích sẽ không bền và có xu hướng quay về trạng thái

cơ bản Như vậy sự hấp thụ năng lượng của bức xạ dẫn đến

sự dịch chuyển năng lượng trong nguyên tử (hay phân tử).

Trang 12

2 Nguyên lý phổ hấp thụ

2.2 Quy tắc chọn lọc và cường độ hấp thụ:

- Phân tử không hấp thụ bức xạ một cách hỗn loạn mà chỉ hấp thụ những bức xạ tương ứng chính xác với biến thiên giữa các mức năng lượng của chúng.

- Biên độ và cường độ bức xạ khi đi qua chất hấp thụ sẽ bị

Trang 13

3 Định luật Lambert-Beer

Chiếu một chùm tia đơn sắc song song có cường độ Io thẳng góc lên bề dày L của một môi trường hấp thụ thì sau khi qua lớp hấp thụ này cường độ của ánh sáng nhỏ đi và còn là I (I<Io),Gọi T là độ truyền qua của ánh sáng thì T=I/IoĐịnh luật Lambert-Beer:

Độ hấp thụ của ánh sáng tỷ lệ với hai thành phần là nồng độ của chất hấp thụ và khoảng đường của ánh sáng truyền qua vật chất đó.

Trang 14

Ví dụ: hệ số hấp thụ mol  của Benzen tại các max (nm) khác nhau như sau:

Trang 15

A : là cường độ hấp thụ của dung dịch có nồng

độ 1% với cuvet đo có chiều dày dung dịch là 1cm Trong các dược điển Mỹ, Anh A sử dụng như

Trang 16

3 Định luật Lambert-Beer

Điều kiện ứng dụng định luật Lambert-Beer

 Ánh sáng phải đơn sắc

 Dung dịch phải loãng và trong suốt

 Chất khảo sát phải bền trong dung dịch và bền

dưới tác dụng của tia sáng chiếu tới

Trang 17

4 Quang phổ hấp thu phân tử - Quang phổ UV-ViS

4.1 Sự chuyển mức năng lượng

- Điện tử : liên kết đơn trong phân tử từ  *C*l cần năng lượng lớn (<150nm) Các hydrocarbon no có liên kết  chỉ hấp thụ bức xạ trong vùng UV xa nên thường được sử dụng làm dung môi Ví dụ n-hexan, nước

- Điện tử :liên kết  tham gia liênkết đôi,ba, từ  *C*l cần năng lượng nhỏ (UV gần), phân tử có nhiều nối đôi sự hấp thụ trong vùng UV-VIS càng dễ

- Điện tử tự do n (không liên kết): là những điện tử không cặp đôi, có các dị tố: O, S, N Từ n *C*l cần năng lượng thấp hơn  *C*l

Trang 18

Biểu đồ: Chuyển mức năng lượng của các liên kết

Các phân tử có cấu trúc liên hợp nhiều điện tử  và n và tham

gia n  * ,   * nên có thể cho phổ UV-VIS

Trang 19

4.2 Các yếu tố tham gia vào sự hấp thụ, các hiệu ứng:

a) Màu sắc:

Màu sắc của một chất có tầm quan trọng chuyên biệt cho chất đó Màu của một chất liên quan đến sự hấp thụ và phản xạ của một chất Mắt người nhìn thấy màu bổ trợ cho màu hấp thụ

Trang 20

a) Màu sắc:

Hai hợp chất có thể hấp thụ ánh sáng tại cùng bước sóng nhưng xuất hiện màu sắc khác nhau Màu cuối cùng phụ thuộc vào phổ hấp thụ chuyên biệt Chất khảo sát có thể hấp thụ trong một phạm vi rộng hơn hoặc chất khảo sát có thể có nhiều max

Trang 21

a) Màu sắc:

Trang 22

b) Nhóm mang màu (chromophore): Là nhóm chức chưa no, liên kết đồng hóa  trong phân tử gây ra sự hấp thụ bức xạ trong vùng UV- VIS

- Nhóm mang màu có sự chuyển dịch n  *C*l thường có   300 nm

- Nhóm mang màu có sự chuyển dịch   *C*l thường có  < 190nm Trong hệ liên hợp, tính chất bất định xứ của liên kết  càng tăng thì các nhóm màu càng dễ hấp thụ

Trang 23

b) Nhóm mang màu (chromophore):

Trang 24

c) Nhóm trợ màu (auxochrome):

Là các nhóm thế no gắn vào các nhóm mang màu làm thay đổi cả bước sóng lẫn cường độ của dãi hấp thụ cực đại Thường làm chuyển dịch  max về phía dài hơn

Các nhóm điển hình: -OH, -NH2 , -Cl, -SH… (làm tăng tính hấp thụ, giảm năng lượng cần hấp thụ)

Trang 25

d) Các hiệu ứng và sự chuyển dịch:

• Sự chuyển dịch sang đỏ (Red shift),  max chuyển về

bước sóng dài hơn.

• Sự chuyển dịch sang xanh (Blue shift),  max chuyển về

bước sóng ngắn hơn.

• Hiệu ứng tăng cường độ (hyperchromic): xảy ra khi có

sự tăng tính liên hợp  -  *C*l trong phân tử

• Hiệu ứng giảm cường độ (hypochromic): khi có sự

phân ly của phân tử.

Trang 26

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thụ

1) Cấu trúc phân tử

2) Môi trường

• Dung môi: dung môi cũng hấp thu UV-VIS do vậy khi khảo sát phải

chú ý đến dung môi và sử dụng 1 dung môi duy nhất cho các lần đo

• Nồng độ dung dịch: nồng độ quá cao sẽ không còn tuyến tính.

• Độ PH: PH ảnh hưởng rất lớn đến sự hấp thụ, làm dịch chuyển cân

bằng Chú ý trường hợp PH ảnh hưởng đến phổ hấp thụ thì nên dùng đệm PH

• Nhiệt độ: làm giản nở, làm mất cân bằng vật lý… cần chú ý khi

khảo sát mẫu nếu nhiệt độ ảnh hường đến độ hấp thụ thì sử dụng cốc đo ổn định nhiệt.

Trang 27

5 Ứng dụng Quang phổ UV_VIS

5.1 Cấu tạo máy đo UV_VIS

Trang 28

Sơ đồ nguyên lý:

Trang 29

1 Nguồn sáng: đèn Tungsten – Halogen hay Wolframe cho

vùng VIS; đèn Hydrogen, Deuterium hay Thủy ngân cho vùng UV

2 Hệ tán sắc: biến chùm tia đa sắc thành chùm tia đơn sắc

Dùng lăng kính thạch anh, cách tử 1200 vạch/mm

3 Cốc chứa mẫu đo (cuvet):

+ Bằng thạch anh để đo trong vùng UV-VIS có ký hiệu là QS hay VV

+ Bằng thủy tinh thườngđể đo vùng VIS có ký hiệu là OS (SiO2 hấp thụ trong vùng VV)

Trang 30

4 Bộ phận nhận tín hiệu:

 Detector: gồm ống nhân quang (photomultiplier), đo từ

200-680nm, trong trường hợp đo vùng có bước sóng lớn hơn có thể dùng tế bào quang PbCe.

 Bộ phận khuyết đại tín hiệu (amplificator)

 Bộ phận ghi (hay đồng hồ đo) gồm 02 thang

- Độ hấp thụ A hay mật độ quang D (Absorbance, Optical

Density)

- Thang đo độ thấu quang, độ truyền quang T (transmittance)

A=lg1/T

Trang 31

5.2 Ứng dụng PP Quang Phổ UV-VIS

 Kiểm tra độ tinh khiết: Nếu có tạp chất hấp thụ

UV-ViS thì độ hấp thụ sẽ giảm theo sự gia tăng của tạp chất

 Xác định cấu trúc: Kết hợp với PP IR (phổ hồng

ngoại), MNR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) để xác định cấu trúc của các chất

 Định tính: căn cứ đường biểu diễn độ hấp thụ cực

đại theo bước sóng của ánh sáng chiếu tới để xác định hợp chất cần định tính

 Định lượng: Áp dụng định luật Lambert-beer

Trang 32

5.2 Ứng dụng PP Quang Phổ UV-VIS.

được chuẩn hoá

C% X = A/A1%1cm

Bước 1: Pha dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác

Trang 33

Trang 34

Bước 4: Đo độ hấp thụ của mẫu cần đo, nội suy

từ đường chuẩn, xác định nồng độ của chất cần đo

 Phương pháp thêm chuẩn (định lượng gián tiếp)Nguyên lý: chất cần đo có độ hấp thụ yếu hoặc không

hấp thụ trong vùng UV-VIS, người ta thêm một chất khác vào dung dịch để tạo thành phức chất (mang màu), hấp thụ mạnh hơn chất ban đầu

Trang 35

 Phương pháp thêm chuẩn (định lượng gián

tiếp)

Cách làm: lấy cùng 1 lượng dung dịch Cx cần phân

tích cho vào 2 bình định mức 1 và 2 Thêm vào bình 2 một lượng chuẩn chất phân tích Co, lắc đều, để cho bền màu (tuỳ theo từng chất) Đem

đo 02 dung dịch ở độ hấp thu cực đại max được

độ hấp thu tại max là Ax và Ao

Trang 36

Trang 37

 Phương pháp thêm chuẩn (định lượng gián

tiếp)

Ví dụ 1: Chì (Pb 2+ ) trong nước không màu, không hấp thu

trong vùng UV-VIS nhưng khi cho chất tạo phức dithizon trong dung dịch chloroform (CHCl3) thì phức chất Pb- dithizon trong dung môi CHCl3 có màu đỏ và hấp thu mạnh trong vùng UV-VIS.

VD2: tương tự trường hợp của Zn 2+ trong môi trường nước

không có màu, không hấp thu trong vùng UV-VIS nhưng khi cho melamine vào trong môi trường PH=5 thì phức chất Zn-melamine có màu đỏ tím, hấp thu mạnh UV-VIS.

Trang 46

- Đánh giá chất lượng lô hàng

- Khảo sát biến đổi hàm lượng

Yêu cầu: mẫu đem phân tích phải là mẫu trung bình của thành phần mẫu đem tới kiểm nghiệm Mẫu phải đồng nhất.

Trang 47

TỔNG QUAN VỀ PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG CÁC CHẤT

Các giai đoạn phân tích:

b) Sử dụng qui trình kiểm nghiệm:

- Qui trình phải được công nhận

- Qui trình được đánh giá, kiểm soát một cách khoa

học theo các đặc trưng của một PP phân tích

Trang 48

TỔNG QUAN VỀ PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC

CHẤT

Trang 49

- Qui trình phân tích bao gồm:

+ Cách tiến hành:

Lượng cân cần phải tính toán sao cho chất cần xác định có

Trang 50

- Qui trình phân tích bao gồm:

 Đưa dung dịch mẫu về dạng đo:

Loại trừ các yếu tố ảnh hưởng

Nồng độ chất cần phân tích phải đáp ứng yêu cầu định lượng

có độ đúng cao.

Trang 51

 Thiết bị đo ổn định sẵn sàng làm việc, thực hiện

đúng theo các bước hướng dẫn

Trang 53

- Biểu diễn bằng khoảng tin cậy – Giá trị thực nằm

trong khoảng giá trị với xác suất định trước (90%, 95%, 99%)

Trang 54

 Quy trình phân tích, điều kiện phân tích, độ thuần

thục và kiến thức của người thực hiện phải hội đủ các yêu cầu sao cho kết quả phân tích đạt độ chính xác yêu cầu

Trang 55

Bài tập ứng dụng:

Bài 1: Cho mẫu nguyên liệu vitamin B12 có nồng độ

khoảng từ 80% đến 90% Xác định nồng độ chính xác của nguyên liệu theo 2 cách

Trang 56

Chất tạo phức màu là dung dịch được pha như sau:

Pha dung dịch Amoni heptamolipdat như sau:

100g Amoni heptamolipdat trong nước nóng +

Pha dung dịch Amoni monovanmadat như sau:

2.35g Amoni monovanmadat trong 400ml

(ddB)

Thước thử molipdovanadat: 200ml ddA + 200ml

Trang 57

Bài 3: Định lượng thành phần Tyrosine trong sữa bột

bằng pp UV_VIS biết tyrosine tạo phức màu xanh tím với ninhydrin

Bài 4: Viết qui trình định lượng Mn bằng PP UV-VIS

Áp dụng: Xác định nồng độ Mn trong thuốc Vitamin B

complex C, biết nồng độ Mn trong mẫu khoảng 0,1% đến 0,2%

Trang 58

Thank you!

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	1,78 MB