Định lượng atenolol trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV VIS

Hiện nay việc xác định Atenolol trong dược phẩmchủ yếu theo Dược Điển Việt Nam, Dược Điển Mỹ USP, Dược Điển Anh BP vớiphương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao tuy có độ chính xác cao nhưng

Bảng 3.1 Hoạch định thí nghiệmBảng 3.1 Khảo sát đô đặc hiệu

Bảng 3.5 dãy đường chuẩn atenololBảng 3.7 Pha mẫu thử thêm chuẩnBảng 4.1 Dãy chuẩn của atenololBảng 4.2 Hàm lượng atenolol trong mẫu thửBảng 4.4 Độ lặp lại atenolol ngày 1Bảng 4.5 Độ lặp lại atenolol ngày 2Bảng 4.6 Độ lặp lại atenolol ngày 3

nm Namomet

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Tổ chức Y Tế Thế Giới cho thấy, mỗi năm khoảng 17 triệu người bị tử vong do bệnh

lý tim mạch Trong đó huyết áp là yếu tố nguy cơ thường gặp nhất Huyết áp cao vốnđược mệnh danh là “kẻ giết người thầm lặng” Năm 2000, theo ước tính của Tổ Chức

Y Tế Thế Giới, toàn Thế Giới có tới 972 triệu người bị THA và con số này được ướctính là khoảng 15,6 tỷ người vào năm 2025 Tuy bề ngoài tăng THA là một bệnh độclập nhưng trên thực tế, nó lại là một nhân tố nguy hiểm gây ra những bệnh tai biến vềmạch máu não, thận và tim Tại Hội nghị “Tăng Huyết Áp Việt Nam Lần Thứ II –2106” được tổ chức sáng ngày 14-15 tháng 5 tại Hà Nội Phát biểu tại Hội nghị, GS.TSNguyễn Lân Việt, Chủ tịch Hội tim mạch Việt Nam cho biết, THA là một vấn đề rấtthường gặp trong cộng đồng, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và dẫn đến cái chếtcủa hàng triệu người mõi năm Tại Việt Nam, năm 2000 khoảng 16,3% người lớn tuổi

bị THA, đến năm 2009 tỷ lệ THA ở người lớn là 25,4% và năm 2016 tỷ lệ người lớn bịTHA đang ở mức báo động là 48%, mức báo động đỏ trong thời điểm hiện tại (BùiThủy, 2016)

Atenolol là dẫn xuất benzenacetamid, có tác dụng ức chức chế chọn lọc β1-adrenergic,được dùng trong điều trị tăng huyết áp Chế phẩm Atenolol được cấp pháp lưu hànhđầu tiên trên thị trường nhằm thay thế propranolol trong điều trị cao huyết áp, do ít bịchuyển hóa lần đầu qua gan hơn so với propranolol Vì vậy, thuốc càng ngày càngđược sử dụng rộng rãi trong điều trị Hiện nay việc xác định Atenolol trong dược phẩmchủ yếu theo Dược Điển Việt Nam, Dược Điển Mỹ (USP), Dược Điển Anh (BP) vớiphương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao tuy có độ chính xác cao nhưng phải sử dụngpha động là các dung môi độc hại và thiết bị đắc tiền, phương pháp chuẩn độ thể tíchtuy ít sử dụng hóa chất độc hại nhưng là phương pháp thủ công dễ sai số, có quy trìnhphức tạp, có độ chính xác không cao lắm

Trước thực tế đó, việc xây dựng một phương pháp có độ chính xác cao và ít độc hại,chi phí thấp là một vấn đề được quan tâm, phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến

là phương pháp thích hợp để tiến hành nghiên cứu Do đó, đề tài “Định lượng Atenolol trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV-VIS” được thực

hiện, với hai mục tiêu sau:

1 Định lượng viên nén atenolol bằng phương pháp UV-Vis, thẩm định phương phápvới một số mục tiêu: Độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng và giớihạn phát hiện một số viên nén chứa hoạt chất atenolol trên thị trường

2 Thử nghiệm và kiểm tra phương pháp định lượng atenolo bằng phương pháp quangphổ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL

2.1.1 Đặc điểm của atenolol

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của AtenololCông thức phân tử: C14H22N2O3

Khối lượng phân tử: 266,3

Ðiều trị atenolol sẽ ức chế tác dụng của catecholamin khi gắng sức và căng thẳng tâm

lý, dẫn đến làm giảm tần số tim, giảm cung lượng tim và giảm huyết áp

Ðiều trị atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch ngoại biên

Ở liều điều trị, tác dụng co cơ trơn phế quản của atenolol kém hơn so với những thuốcchẹn thụ thể beta không chọn lọc Tính chất này cho phép điều trị cả những người cóbệnh hen phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác

Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat Bởi vậy,atenolol có thể dùng được cho người đái tháo đường Ở người tăng huyết áp, atenolollàm giảm một cách có ý nghĩa huyết áp ở tư thế đứng lẫn tư thế nằm.

Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần, có thể kết hợp atenolol với thuốc chống tăng huyết

áp khác, chủ yếu là thuốc lợi niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên (Bộ y tế, 2009).Một số nghiên cứu so sánh tác dụng giữa các đồng phân quang học của atenolol:

Nghiên cứu so sánh tác dụng giảm nhịp tim của atenolol racemic và R-atenolol, atenolol so với giả dược trên người tình nguyện sau khi tập thể dục do Stoschitzky K

S-và cộng sự thực hiện cho thấy tác dụng giảm nhịp tim sau khi uống 100 mg atenololracemic tương đương với uống 50 mg S- atenolol, trong khi không thấy tác dụng giảm

nhịp tim sau khi uống 50 mg R- atenolol (Stoschitzky K et al, 1998), (Stoschitzky K et

al, 1998)

Theo nghiên cứu của McCoy R và cộng sự khi tiến hành thử nghiệm trên người, atenolol có tác dụng ức chế chọn lọc β1-adrenergic hơn khoảng 40 lần và có ít tác dụngphụ như loạn nhịp, đánh trống ngực so với R- atenolol (McCoy R,1994)

S Dược động học

Sau khi uống thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương trong vòng từ 2-4 giờ Sinhkhả dụng xấp xỉ 45%, nhưng có sự khác nhau tới 3 - 4 lần giữa các người bệnh Thểtích phân bố là 0,7 l/kg Atenolol chỉ được chuyển hóa một lượng nhỏ Phần lớn liềuthuốc dùng được bài tiết qua thận dưới dạng không thay đổi Nửa đời trong huyếttương của thuốc từ 6 - 9 giờ đối với người lớn có chức năng thận bình thường Nửa đờitrong huyết tương của thuốc tăng lên đối với người có chức năng thận giảm và không

bị ảnh hưởng bởi bệnh gan

2.1.2 Một số thuốc lưu hành trên thị trường

Aginolol 50 mg của công ty cổ phần Dượcphẩm AGIMEXPHARM

Thành phần:

Atenolol………50mg

Tá dược………vừa đủ 1 viênChỉ định: Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạntính ổn định, nhồi máu cơ tim sớn (trong vòng

12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim,loạn nhịp nhanh trên thất (agimecpharm,2015)

Atenolol stada 50 mg của công ty TNHH Liêndoanh STADA Việt Nam

Thành phần:

Atenolol………50mg

Tá dược………vừa đủ 1 viênChỉ định: Tăng huyết áp, đau thắt ngực, loạnnhịp tim, điều trị sớm nhồi máu cơ tim cấp(stada, 2018)

Atenolol 50 mg của công ty cổ phần Dược phẩm T.V PHARM

Thành phần:

Atenolol………50mg

Tá dược………vừa đủ 1 viênChỉ định: Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu

cơ tim sớn (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim,loạn nhịp nhanh trên thất (tvpharm, 2018)

Teginol 50 mg của công ty cổ phần DượcHậu Giang

Thành phần:

Atenolol………50mg

Tá dược………vừa đủ 1 viênChỉ định: Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạntính ổn định, nhồi máu cơ tim sớn (trongvòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu

NaOHAxit hóa

Hình 2.2 Sơ đồ tổ hợp atenolol (Nguyễn Văn Thắng, 2009)

2.1.4 Một số phương pháp phân tích atenolol

2.1.4.1 Định tính atenolol (Dược điển Việt Nam V, 2018)

Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:

C Điểm cháy: từ 152 oC đến 155 oC

D Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Bản mỏng: silica gel đã được silan hóa F254

Dung môi khai triển: Amonic 18 M – methanol ( 1:9 )

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10 mg atenolol chuẩn trong 1 ml methanol

Cách tiến hành: chấm riêng biệt trên bảng mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên Sau khitriển khai sắc ký, lấy bảng mỏng ra để khô ngoài không khí và quan sát dưới ánh sang

tử ngoại ở bước sóng 254 nm Vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đốichiếu về vị trí và kích thước

2.1.4.2 Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Bảng 2.1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

ST

T Đặc điểm phương pháp Tài liệu tham khảo

1

Pha động: Natri 1-heptanesulfonate và Natri bazan dibasic

khan trong nước pH 3,0

đó được tách thành hai tia sáng có cường độ bằng nhau bằng một bán gương

Một tia sáng (chùm sáng mẫu) sẽ đi xuyên qua một vật chứa trong suốt (cuvet) có chứahỗn hợp chất nghiên cứu được hòa tan trong dung môi trong suốt (dung dịch thử) Tiasáng còn lại (tia sáng tham chiếu) sẽ đi xuyên qua một cuvet khác (giống với cuvetchứa dung dịch thử) chỉ chứa dung môi hòa tan (mẫu trắng) Cường độ của hai tia sáng

sẽ được đo bằng đầu dò điện tử và được so sánh Tia sáng tham chiếu sẽ hấp thụ íthoặc không hấp thụ, được xác định là I0 Cường độ của tia sáng mẫu được xác định là

I Trong một thời gian ngắn, quang phổ kế sẽ quét tất cả các bước sóng Vùng UVthường được quét trong khoảng 200nm – 400nm, vùng Vis từ 400nm – 800nm.

Bộ phận đầu dò (detector) sẽ so sánh cường độ chùm ánh sáng đi qua dung dich (I) và

đi qua dung môi I0 Tín hiệu quang được chuyển thành tín hiệu điện, sau khi đượcphóng đại, tín hiệu sẽ chuyển sang bộ phận ghi để vẽ đường cong sự phụ thuộc của log(I0/I) vào bước sóng Nhờ sử dụng máy tính, bộ tự ghi còn có thể ghi ra cho ta những

số liệu cần thiết như giá trị λmax cùng với giá trị độ hấp thụ A Tất cả các cường độ hấpthụ ứng với mỗi bước sóng sẽ được thể hiện trên phổ đồ

Cường độ tia sáng trước và sau khi qua cuvette được liên hệ với nhau bởi biểu thứcLambert – Beer:

2.2.2 Sơ đồ hệ thống máy quang phổ UV – Vis (Bộ Y tế, 2007)

2.2.2.1 Sơ lượt về máy quang phổ UV – Vis

Hình 2.3 Cấu tạo chung của máy quang phổ UV-Vis

Với những máy quang phổ có khả năng làm việc cả tử ngoại và khả kiến thường bố trí

cả 2 đèn Việc chuyển đèn sử dụng có thể tự động hay cơ học trong vùng 320 – 350nm

2.2.2.3 Bộ phận đơn sắc hóa

Tùy theo khả năng đơn sắc hóa cần có mà bộ phận đơn sắc hóa cũng được chế tạokhác nhau Từ một chùm tia sáng có nhiều bước sóng khác nhau người ta có thể thuđược các chùm tia đơn sắc hơn qua bộ phận đơn sắc hóa Bộ phận đơn sắc hóa có thểlà:

Kính lọc: chủ yếu áp dụng với các quang kế và làm việc trong vùng khả kiến Chùmtia thu được sau kính lọc là các tia có bước sóng chênh lệch vài chục nm Các quang

kế sử dụng đơn sắc hóa kiểu này thường được bố trí một bộ kính lọc cho phép làmviệc ở một số bước sóng (biểu kiến) khác nhau

Lăng kính: dựa trên hiện tượng tán sắc của ánh sáng khi qua lăng kính Với các máylàm việc cả trong tử ngoại thì vật liệu làm lăng kính không hấp thu tử ngoại và thườngđược chế tạo từ thạch anh

Cách tử: hay dùng nhất là cách tử phản xạ Trên mặc phản xạ của cách tử người ta bốtrí rất nhiều vạch sát nhau Khi chiếu một chùm tia lên bề mặt phản xạ của cách tử cáctia sẽ bị phản xạ theo các phương khác nhau

Khe sáng (trước buồng đo) cũng là một bộ phận tham gia vào quá trình đơn sắc hóa.Việc mở rộng khe sáng sẽ tăng được cường độ của chùm tia đi vào buồng chứa mẫunhưng sẽ giảm độ đơn sắc của chùm tia Ngược lại nếu giảm khe sáng sẽ thu đượcchùm tia đơn sắc hơn nhưng có thể làm cho tín hiệu quá yếu không đủ cho bộ phận thunhận làm việc

2.2.2.4 Bộ phân tiếp nhận và xử lý tín hiệu

Bộ phận phát hiện (detector) là bộ phận tiếp nhận tín hiệu có nhiệm vụ biến đổi các tínhiệu quang thành tín hiệu điện Bộ phận phát hiện trong các máy quang phổ có thể làcác tế bào quang điện (photocell), ống nhân quang (photomultivlers), mảng diod(diode array) Nhân quang điện kiểu ống là một loại dụng cụ để thu nhận tín hiệuquang học có tính chất vạn năng, có độ nhạy và tính chọn lọc cao Vùng phổ họa độngcủa các bộ phận phát hiện loại này thường là từ 190 – 900 nm với hệ số khuếch đại cỡ

106

Hình 2.4 Nguyên tắc hoạt động của ống nhân quang và mảng diod

Các tín hiệu quang qua bộ phận phát hiện được chuyển thành tín hiệu điện và chuyểnđến bộ phận khuếch đại Các tín hiệu sau khuếch đại được chuyển đến máy ghi(recorder) để vẽ phổ hay chuyển vào máy tính để xử lý tiếp và lưu lại các dữ liệu, đồngthời phổ được dựng ra và in ra qua máy in hay máy vẽ

2.2.2.5 Buồng đo và cốc đo

Buồng đo là buồng kín chứa các cốc đo (cuvet) Các dung dịch cần đo được để trongcác cốc đo bằng thủy tinh hay nhựa trong suốt, nếu đo trong vùng tử ngoại thì cốc đophải là thạch anh (quartz) Cốc đo thường có hình hộp chữ nhật 2 hoặc 4 mặt trongsuốt và có thể có nắp đậy Một số có cấu tạo đặc biệt để giảm thể tích nhưng vẫn đảmbảo bề dày dung dịch đo

Hình 2.5 Cốc đo dùng trong máy quang phổ UV-VisCấu tạo của buồng đo có thể cho biết đó là máy một chùm tia hay hai chùm tia

Sơ đồ quang của máy một chùm tia như Hình 2.3 Với máy một chùm tia mẫu trắng vàmẫu đo phải được xử lý lần lượt Dung môi hoặc mẫu trắng được đưa vào buồng đo đểchỉnh giá trị mật độ quang về 0 Sau đó dung dịch đo được đưa vào đo để xác định giá

trị Việc chuyển mẫu đo có thể cơ thể cơ học bằng cách thay thế qua cửa buồng đo haybằng hệ thống kéo khay chứa cốc cần đo vào vị trí thích hợp.

Hình 2.6 Sơ đồ quang của máy quang phổ một chùm tiaVới máy hai chùm tia cả mẫu trắng và mẫu đo được đặt cùng trong buồng đo và chùmtia đơn sắc tuần tự đi qua mẫu trắng và mẫu đo nhờ các hệ thống gương quay Hình2.4 cho thấy sơ đồ quang của máy quang phổ tử ngoại khả kiến hai chùm tia

Hình 2.7

Sơ đồquangcủa máyquangphổ haichùm tiaVới cácmáyquangphổ UV-Vis hiện nay đều có thể thực hiện đo cả ở chế độ đo điểm, quét phổ Hiện naycác máy quang phổ thường đi kèm với máy tính nên các thao tác xử lý dữ liệu thuđược rất đa dạng Một số máy ngoài việc cho phép ghi phổ hấp thu bình thường có thểcho phép thu được các phổ đạo hàm với các bậc khác nhau hay có thể đưa vào cácthông số để tính toán ra kết quả từ giá trị mật độ quang thu được

2.2.2.6 Ưu điểm

Phương pháp quang phổ khả kiến có các ưu điểm:

Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2 đến 10-6mol/L (1-10%)

Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tíchnhiều đối tượng mẫu khác nhau

Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu từ phân tích vào, đưa các hóa chất cần thiết,

vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một các tự độnghóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại

Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức xác định cácdạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand trong phanước cũng như pha hữu cơ

2.2.2.7 Các sai số trong phép đo

Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích khác, sai sốđược chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa chất, thao tác dụngcụ…), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (sai số hệ thống) Trong phươngpháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai số của tín hiệu trong quá trình đo độhấp thụ

2.2.3 Ứng dụng phương pháp quang phổ uv-vis

Phương pháp quang phổ UV – Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích địnhtính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng Nguyên tắc của phương phápphân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịchcủa định luật Lambert – Beer, phương pháp định tính là dựa vào hình dáng của phổ vàbước sóng cực đại

2.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Đánh giá chất lượng và độ tin cậy của kết quả đo nhằm tạo độ tin cậy từ phương phápxác định cho ra kết quả Được áp dụng cho các phép thử có sử dụng đường chuẩn (P,

Fe, SO42-, F, Al,…) của phòng thí nghiệm hóa sinh

Phương pháp thẩm định này dựa trên tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích bằng đo

quang phổ tử ngoại khả - khả kiến UV-VIS” phụ lục 8, sổ tay đăng kí thuốc, được ban

hành bởi Cục quản lý, Dược – Bộ Y tế (27-11-2013)

Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn định lượng (LOQ)

2.3.1 Độ đặc hiệu

- Định nghĩa:

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khácnhư các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…Cụ thể, trongphép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt

chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là âm tính khi có mặtcác chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng là

khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các

yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

- Cách xác định:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, các giá trị địnhlượng được y Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trongkhoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường thẳng theophương trình sau: y = ax + b hay A = aC + b

Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số tươngquan R Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ sốtương quan R