KIỂM TRA độ NHIỄM CHÉO một số THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNH sản XUẤT THUỐC THÚ y BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV VIS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ ------ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA ĐỘ NHIỄM CHÉO MỘT SỐ THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT THUỐC THÚ Y BẰNG PHƯ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA ĐỘ NHIỄM CHÉO MỘT SỐ THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNH

SẢN XUẤT THUỐC THÚ Y BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV- VIS

Ngành: CN Kỹ thuật hóa học-Khóa 37

Tháng 5/2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA ĐỘ NHIỄM CHÉO MỘT SỐ THUỐC KHÁNG SINH TRONG QUÁ TRÌNH

SẢN XUẤT THUỐC THÚ Y BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV- VIS

Ngành: CN Kỹ thuật hóa học-Khóa 37

Tháng 5/2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

BỘ MÔN CÔNG NG HỆ H ÓA H ỌC - -

Cần Thơ, ngày 09 tháng 05 năm 2015 - -

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 Tên đề tài “Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis” 2 Cán bộ hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Diệp Chi, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự Nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Ths Nguyễn Phương Hải, Công ty SX - KD vật tư & thuốc thú y Vemedim 3 Sinh viên thực hiện Họ và tên: Nguyễn Văn Khi MSSV: 2112146 Lê Minh Vấn MSSV: 2112221 Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học Khóa: 37 4 Nội dung nhận xét 4.1 Nhận xét về hình thức LV

4.2 Nhận xét về nội dung LVTN

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài

 Những vấn đề còn hạn chế

4.3 Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có)

4.4 Kết luận, đề nghị và điểm

Cần Thơ, ngày 09 tháng 05 năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

Ths Nguyễn Thị Diệp Chi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

BỘ MÔN CÔNG NG HỆ H ÓA H ỌC - -

Cần Thơ, ngày 09 tháng 05 năm 2015 - -

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 Cán bộ phản biện

2 Tên đề tài “Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis” 3 Cán bộ hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Diệp Chi, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự Nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Ths Nguyễn Phương Hải, Công ty SX - KD vật tư & thuốc thú y Vemedim 4 Sinh viên thực hiện Họ và tên: Nguyễn Văn Khi MSSV: 2112146 Lê Minh Vấn MSSV: 2112221 Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học Khóa: 37 5 Nội dung nhận xét 5.1 Nhận xét về hình thức LVTN

5.2 Nhận xét về nội dung LVTN

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài

 Những vấn đề còn hạn chế

5.3 Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có)

5.4 Kết luận, đề nghị và điểm

Cần Thơ, ngày 09 tháng 05 năm 2015

Cán bộ phản biện

Ts Đoàn Văn Hồng Thiện Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn này, chúng tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và những kỹ năng thực hành rất bổ ích Đó chính là nhờ sự giúp đỡ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè Chúng tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:

Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã luôn động viên tinh thần, giúp đỡ và hướng dẫn chúng

em trong suốt quá trình làm luận văn

Chú Nguyễn Phương Hải đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cả về vật chất lẫn tinh thần giúp chúng tôi hoàn thành tốt luận văn này

Các anh chị phòng thí nghiệm hóa lý, công ty Vemedim đã tạo điều kiện và giúp

đỡ chúng tôi trong suốt quá trình làm luận văn này

Tất cả thầy cô bộ môn Công nghệ Hóa Học, khoa Công Nghệ đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức vô cùng bổ ích trong học tập và nghiên cứu

Gia đình và người thân đã hổ trợ và giúp đỡ chúng tôi trong học tập

Cuối cùng, chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn lớp Kỹ thuật Hóa Học K37

đã luôn bênh cạnh, động viên và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cần Thơ, tháng 5 năm 2015

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC B ẢNG vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 3

1.1 Nhiễm chéo (Cross – Contamination) trong s ản xuất 3

1.2 Khái quát về nhóm Floroquinolones 4

1.2.1 Enrofloxacin 5

1.2.2 Norfloxacin 6

1.2.3 Marbofloxacin 7

1.3 Khái quát về kỹ thuật thêm chuẩn 8

1.3.1 Cách thực hiện và công thức tính toán 8

1.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật thêm chuẩn 11

1.4 Phương pháp phân tích quang phổ 11

1.4.1 Khái quát về phương pháp quang phổ 11

1.4.2 Định luật Lambert – Beer 12

1.4.3 Ứng dụng của quang phổ UV – Vis trong hóa học phân tích 15

1.5 Thẩm định kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ 16

1.5.1 Mục đích 16

1.5.2 Nội dung 16

1.5.3 Phương pháp thực hiện 17

CHƯƠNG 2: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM 22

2.1 Phương tiện thực hiện 22

2.1.1 Hóa chất và thuốc thử 22

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 22

2.2 Cách tiến hành 22

2.3 Hoạch định thí nghiệm 22

2.3.1 Thí nghiệm về khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ 22

2.3.2 Thí nghiệm về thẩm định phương pháp 23

2.3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật 25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27

3.1 Thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thu theo nồng độ 27

3.2 Thí nghiệm về thẩm định phương pháp 34

3.2.1 Độ chọn lọc 34

3.2.2 Độ lặp lại 35

3.2.3 Độ đúng 38

3.2.4 Kho ảng tuyến tính 39

3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 41

3.3 Áp dụng phương pháp trên mẫu thật 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOAC: Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of

Official Analytical Chemists)

GMP: Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice) ICH: Hội đồng hòa hợp Quốc tế (International Conference on

Harmonization) HLOQ: Giới hạn định lượng trên (High Limit of Quantification) LLOQ: Giới hạn định lượng dưới (Low Limit of Quantitation) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

USFDA: Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Mỹ (United States Food

and Drug Administration) USP: Dược điển Mỹ (United States Pharmacopeia)

UV – Vis: Ultraviolet - Visible WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1: Quy trình kiểm tra nhiễm chéo trên thiết bị sản xuất 4

Hình 1-2: Công thức cấu tạo cơ bản của fluoroquinolones 4

Hình 1-3: Công thức cấu tạo của Enrofloxacin 5

Hình 1-4: Trạng thái tự nhiên của Enrofloxacin 6

Hình 1-5: Công thức cấu tạo của Norfloxacin 6

Hình 1-6: Trạng thái tự nhiên của Norfloxacin 7

Hình 1-7: Công thức cấu tạo của Marbofloxacin 7

Hình 1-8: Trạng thái tự nhiên của Marbofloxacin 8

Hình 1-9: Mô tả kỹ thuật thêm chuẩn một điểm 8

Hình 1-10: Mô tả kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm 10

Hình 1-11: Tìm lại Cx bằng cách dùng đồ thị đối với kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm 10

Hình 1-12: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis 12

Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự hấp thụ ánh sáng của một dung dịch 13

Hình 1-14: Máy quang phổ Ultrospec 2000 16

Hình 1-15: So sánh độ nhạy của phương pháp bằng đồ thị 20

Hình 3-1: Kết quả quét phổ của dung dịch NaOH 0,1 N 27

Hình 3-2: Kết quả quét phổ của Enrofloxacin 28

Hình 3-3: Kết quả quét phổ của Norfloxacin 28

Hình 3-4: Kết quả quét phổ của Marbofloxacin 29

Hình 3-5: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 5 mg/L – 25 mg/L 31

Hình 3-6: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ ER từ 0,05 mg/L – 1 mg/L 32

Hình 3-7: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 5 mg/L – 25 mg/L 32

Hình 3-8: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ NL từ 0,05 mg/L – 1 mg/L 32

Hình 3-9: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 5 mg/L – 25 mg/L 33

Hình 3-10: Kết quả phổ đồ đối với dãy nồng độ MB từ 0,05 mg/L – 1 mg/L 33

Hình 3-11: Đánh giá độ chọn lọc của phương pháp quang phổ đối với ER 35

Hình 3-12: Đồ thị sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của dãy mẫu thêm chuẩn 38

Hình 3-13: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Enrofloxacin 39

Hình 3-14: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Norfloxacin 40

Hình 3-15: Đồ thị khoảng tuyến tính của Abs theo nồng độ của Marbofloxacin 41

Hình 3-16: Phổ đồ kết quả thí nghiệm 7 43

Hình 3-17: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 7 43

Hình 3-18: Phổ đồ kết quả thí nghiệm 8 44

Hình 3-19: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 8 45

Hình 3-20: Phổ đồ kết quả thí nghiệm 9 46

Hình 3-21: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 9 46

Hình 3-22: Phổ đồ kết quả thí nghiệm 10 48

Hình 3-23: Đồ thị Abs = f(C) thí nghiệm 10 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1-1: Kỹ thuật thêm chuẩn một điểm 9

Bảng 1-2: Kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm 9

Bảng 1-3: Giá trị Rc (%) theo nồng độ chất phân tích 18

Bảng 1-4: Giá trị RSD (%) theo nồng độ chất phân tích 19

Bảng 3-1: Điều kiện quét phổ thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs theo  28

Bảng 3-2: Xây dựng dãy chuẩn Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin 30

Bảng 3-3: Điều kiện quét phổ 30

Bảng 3-4: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Enrofloxacin 30

Bảng 3-5: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Marbofloxacin 31

Bảng 3-6: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự phụ thuộc của Abs vào nồng độ của Norfloxacin 31

Bảng 3-7: Kết quả thí nghiệm đánh giá độ chọn lọc 34

Bảng 3-8: Chuẩn bị bãy thêm chuẩn đối với Enrofloxacin 36

Bảng 3-9: Kết quả đánh giá độ lặp lại trên Enrofloxacin 37

Bảng 3-10: Kết quả đánh giá độ lặp lại trên Norfloxacin 37

Bảng 3-11: Kết quả đánh giá độ lặp lại trên Marbofloxacin 37

Bảng 3-12: Kết quả quét phổ đánh giá độ đúng 38

Bảng 3-13: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Enrofloxacin 39

Bảng 3-14: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Norfloxacin 40

Bảng 3-15: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Marbofloxacin 40

Bảng 3-16: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 7 .42

Bảng 3-17: Kết quả quét phổ thí nghiệm 7 .43

Bảng 3-18: Kết quả quét phổ thí nghiệm 8 .44

Bảng 3-19: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 9 .46

Bảng 3-20: Kết quả quét phổ thí nghiệm 9 .46

Bảng 3-21: Dãy mẫu thêm chuẩn trên mẫu thật thí nghiệm 10 47

Bảng 3-22: Kết quả quét phổ thí nghiệm 10 .47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong sản xuất thuốc thú y, quá trình tạo ra một thành phẩm thường trải qua nhiều giai đoạn như: kiểm tra chất lượng và chuẩn bị nguyên liệu, kiểm tra độ sạch của thiết

bị, dung cụ pha chế, kiểm tra chất lượng thuốc thành phẩm, phối trộn nguyên liệu,

Trong đó, giai đoạn kiểm tra độ sạch của thiết bị, dụng cụ pha chế rất quan trọng, bởi nếu không thực hiện tốt giai đoạn này thì rất dễ xảy ra sự nhiễm chéo thành phần giữa các thuốc thành phẩm trong sản xuất, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin là các kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolones, theo Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25/02/2014 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã bị cấm sử dụng trong ngành thủy sản nhưng vẫn được cho phép sử dụng có giới hạn trong ngành thú y Chính vì vậy, khi sản xuất thuốc thú y và thuốc thủy sản trên cùng thiết bị, dụng cụ thì nguy cơ nhiễm chéo chúng vào các loại thuốc thủy sản rất dễ xảy ra

Để kiểm soát lượng tồn dư Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin trong thiết bị, dụng cụ pha chế thường dùng các phương pháp quang phổ và HPLC Nhưng với phương pháp HPLC thì việc định lượng lượng tồn dư kháng sinh mất nhiều thời gian

và chi phí cao, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Mặc khác, hàm lượng kháng sinh tồn dư thường rất thấp nên kết quả phân tích thường cho sai số lớn khi định lượng bằng phương pháp quang phổ bằng các kỹ thuật thông thường Với kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng cho phương pháp quang phổ có thể khắc phục được nhược điểm đã nêu và đáp ứng được nhu cầu sản xuất

Vì vậy, để đảm bảo kết quả định lượng Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có hàm lượng thấp trong thiết bị, dụng cụ pha chế có độ chính xác cao, chúng tôi chọn thực hiện đề tài:

“Kiểm tra độ nhiễm chéo một số thuốc kháng sinh trong quá trình sản xuất thuốc thú y bằng phương pháp quang phổ UV- Vis”

Mục đích nghiên cứu chính của đề tài:

Xây dựng quy trình định lượng Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có hàm lượng thấp trong thiết bị, dụng cụ pha chế bằng kỹ thuật thêm chuẩn áp dụng trên phương pháp quang phổ, nhằm tránh sự nhiễm chéo của chúng vào các loại thuốc thủy sản, cũng như đảm bảo chất lượng thuốc thành phẩm Thông qua đề tài này, chúng tôi

hy vọng sẽ đưa ra một phương pháp định lượng Enrofloxacin, Norfloxacin và Marbofloxacin có độ tin cậy cao và áp dụng tốt trong điều kiện thực tế sản xuất hiện nay

Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài:

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vemedim thuộc Công ty SX - KD vật

tư & thuốc thú y Vemedim, số 7 Đường 30 - 4, Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ

Thời gian thực hiện từ tháng 01/2015 đến hết tháng 04/2015

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN

Tạp nhiễm là sự nhiễm không mong muốn các tạp chất có bản chất hóa học hoặc

vi sinh vật, hoặc tiểu phân lạ vào một nguyên liệu ban đầu hoặc thành phẩm trung gian trong quá trình sản xuất, lấy mẫu, đóng gói hoặ đóng gói lại, bảo quản hoặc vận chuyển

Như vậy nhiễm chéo là việc tạp nhiễm của một nguyên liệu ban đầu, sản phẩm trung gian, hoặc thành phẩm với một nguyên liệu ban đầu hay sản phẩm khác trong quá trình sản xuất (Cục quản lí dược, 2014)

Nhiễm chéo trên các sản phẩm sẽ gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng Theo Cơ quan quản lý dược phẩm và các sản phẩm y tế Anh thì nhiễm chéo trên các sản phẩm thuốc

là một trong những nguyên nhân hàng đầu trong việc thu hồi sản phẩm Sự nhiễm chéo các chất cấm sử dụng vào thuốc, thức ăn thủy sản không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn gây thiệt hại nghiêm trọng cho nhà chăn nuôi

Việc nhiễm chéo có cả nguyên nhân bên ngoài và bên trong và thường xảy ra do các nguyên nhân chủ yếu sau:

– Bố trí các khu vực (sản xuất, kho, kiểm nghiệm,…) không phù hợp với điều kiện môi trường

– Không phân vùng rõ rệt trong sản xuất

– Lắp đặt hệ thống thông gió, điều hòa không khí không riêng biệt

– Các cấp lọc trong hệ thống không riêng biệt

– Đường đi của nguyên liệu không đảm bảo quy trình một chiều

– Đường đi của công nhân không tuân thủ quy định

– Công nhân không tuân thủ quy trình vệ sinh công nghiệp (trang phục bảo hộ lao động, quy trình rửa tay, thay trang phục, giày dép, đi đường,…)

– Không lắp đặt hệ thống xử lí nước thải công nghệp, không có quy trình thu gom

và xử lí chất thải rắn

– Quy trình vệ sinh không được thẩm định dẫn đến không phát hiện sự tồn dư các vết nguyên liệu (nhiễm chéo giữa các sản phẩm), các chất tẩy rửa, và khả năng nhiễm vi sinh từ môi trường

Để hạn chế tình trạng nhiễm chéo trong sản xuất, cần phải khắc phục các nguyên nhân trên bằng cách thực hiện tốt các nguyên tắc đưa ra trong GMP, cần phải có nhà xưởng chuyên biệt và khép kín cho việc sản xuất những sản phẩm đặc biệt Trong những trường hợp ngoại lệ, có thể chấp nhận sản xuất trong cùng nhà xưởng với điều kiện là phải đặc biệt thận trọng và có tiến hành các thẩm định cần thiết

Hình 1-1: Quy trình kiểm tra nhiễm chéo trên thiết bị sản xuất

Fluoroquinolones là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolones được tìm ra lần đầu tiên vào những năm 1960 Cấu trúc phân tử của fluoroquinolones có một nguyên tử Fluor gắn vào vị trí số 6 của hệ thống trung tâm

Hình 1-2: Công thức cấu tạo cơ bản của fluoroquinolones

Dựa trên sự khác nhau về phổ kháng khuẩn, các fluoroquinolones được chia thành nhiều thế hệ:

– Thế hệ thứ nhất: acid nalidicixic – Thế hệ thứ hai: enrofloxacin, difloxacin, marbofloxacin và ciprofloxacin – Thế hệ thứ ba: obifloxacin, levofloxacin,

– Thế hệ thứ tư: gatifloxacin, moxifloxacin, pradofloxacin,

Fluoroquinolones có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm

và Gram dương Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy Fluoroquinolones bài thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận

Cơ chế tác động chính của các fluoroquinolones là ức chế sự tổng hợp ADN ở nhân tế bào Quá trình này được thực hiện thông qua việc ức chế enzyme ADN gyrase, một enzyme tham gia vào quá trình tháo xoắn và đóng xoắn của AND trong quá trình nhân đôi, khiến cho AND không thể tổng hợp được Ngoài ra, chúng còn tác dụng trên

cả mARN nên ức chế tổng hợp protein ở vi khuẩn (Bermúdez-Almada, 2012; Zimmerman, 2010)

Pallo-Nhóm Fluoroquinolones nói chung là nhóm kháng sinh có tính độc nên đã bị nhiều nước đưa vào danh mục các hóa chất cấm sử dụng hoặc sử dụng hạn chế

Enrofloxacin được tổng hợp lần đầu tiên bởi hai nhà nghiên cứu thuộc công ty Bayer là Grohe và Peterson vào năm 1980, sau đó được giới thiệu ra thị trường vào năm

1988 Nó đã trở thành quinolone quan trọng nhất trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do

vi khuẩn (Bayer AG Leverkusen, 1999)

Enrofloxacin được sử dụng làm kháng sinh chủ yếu cho các chứng bệnh về đường

hô hấp, nhiễm trùng huyết, xương khớp, Ngoài ra, chất này còn được sử dụng để kiểm soát môi trường và phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản (nhưng hiện nay đã bị cấm

Norfloxacin được công bố lần đầu tiên vào năm 1980 và là fluoroquinolone thế hệ thứ hai đầu tiên được đưa ra thị trường vào năm 1986 (Bayer AG Leverkusen, 1999)

Tính chất hóa lý

Norfloxacin có khối lượng phân tử là 319,331 (g/mol), tồn tại dưới dạng bột kết tinh màu trắng; nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 220oC đến 221oC; tan ít trong nước, độ tan tăng lên khi pH nằm trong khoảng <5 hoặc > 10

Hình 1-6: Trạng thái tự nhiên của Norfloxacin

9-Fluoro-3-methyl-10-(4-methyl-carboxylic acid, có công thức phân tử là C17H19FN4O4

Hình 1-7: Công thức cấu tạo của Marbofloxacin

Tính chất hóa lý

Marbofloxacin có khối lượng phân tử là 362,356 (g/mol), tồn tại dưới dạng bột kết tinh màu trắng đến vàng nhạt; nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 268oC đến 269oC; tan ít trong nước

Hình 1-8: Trạng thái tự nhiên của Marbofloxacin

Ứng dụng

Marbofloxacin được sử dụng làm kháng sinh chủ yếu trong điều trị nhiễm trùng

hô hấp, nhiễm trùng da, tuyến vú, tiết niệu,…

Kỹ thuật thêm chuẩn có thể tiến hành theo hai cách là thực hiện thêm chuẩn một điểm và thêm chuẩn nhiều điểm

Kỹ thuật thêm chuẩn một điểm: chuẩn bị hai bình định mức như nhau, cho vào

hai bình cùng một thể tích mẫu cần phân tích, V0 Thêm vào bình thứ hai một lượng chính xác chất cần phân tích đã biết trước nồng độ Thêm dung môi và thuốc thử cần thiết vào cả hai bình và mang đi đo tín hiệu phân tích

Hình 1-9: Mô tả kỹ thuật thêm chuẩn một điểm

Bảng 1-1: Kỹ thuật thêm chuẩn một điểm

o A f

V

C V

Ssamp: Tín hiệu phân tích của dung dịch không thêm chuẩn

Sspike: Tín hiệu phân tích của dung dịch có thêm chuẩn

CS: Nồng độ chất chuẩn thêm vào

CA: Nồng độ chất cần xác định trong mẫu ban đầu.

Kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm: nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng ngay

mẫu phân tích làm nền để chuẩn bị một dãy mẫu thêm chuẩn, bằng cách lấy một lượng mẫu phân tích nhất định và thêm vào đó những lượng xác định chất cần phân tích theo từng bậc nồng độ (theo cấp số cộng) như bảng sau:

Bảng 1-2: Kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điể m

Hình 1-10: Mô tả kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm

Chọn các điều kiện thí nghiệm phù hợp và tiến hành ghi nhận tín hiệu phân tích

Dựa vào tín hiệu phân tích theo nồng độ ta dựng đường chuẩn

Kéo dài đường thẳng S = a.C + b đến khi cắt trục hoành (trục nồng độ) tại một điểm, giá trị đó chính là nồng độ chất phân tích Cx ta cần tìm

Tuy nhiên, kỹ thuật thêm chuẩn một điểm thường dẫn đến một số sai sót do thao tác chưa chính xác hoặc các ảnh hưởng ngẫu nhiên nào đó trong quá trình chuẩn bị mẫu

Trong khi đó, kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm có thể dễ dàng thấy được các sai sót này

và kết quả thu được dựa vào phương pháp toán thống kê nên sai số mắc phải thường thấp hơn kỹ thuật thêm chuẩn một điểm Do đó trong các phép phân tích, người ta thường

sử dụng kỹ thuật thêm chuẩn nhiều điểm

S2

S1

S0

S 3

S 4 S

1.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật thêm chuẩn

– Làm tăng tín hiệu của chất cần phân tích trong trường hợp hàm lượng của chúng trong mẫu ban đầu thấp, dễ bị các thành phần khác trong mẫu ảnh hưởng, gây sai lệch tín hiệu phân tích

– Có thể sử dụng trong trường hợp các kỹ thuật khác như kỹ thuật so sánh, kỹ thuật đường chuẩn cho kết quả phân tích có độ chính xác không cao

– Có độ đúng và độ chính xác cao hơn so với phương pháp chuẩn ngoại

– Cần phải thực hiện lại thao tác thêm chuẩn đối với mỗi lần phân tích

– Tốn thời gian khi phải thực hiện thao tác thêm chuẩn cho một dãy chuẩn

Ngày nay các phương pháp vật lý, đặc biệt là các phương pháp phổ được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các hợp chất hóa học cũng như các quá trình phản ứng hóa học

Những phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với việc xác định các hợp chất hữu cơ

Cơ sở của phương pháp phổ là quá trình tương tác của các bức xạ điện từ đối với các phân tử vật chất Khi tương tác với các bức xạ điện từ, các phân tử có cấu trúc khác nhau sẽ hấp thụ và phát xạ năng lượng khác nhau Kết quả của sự hấp thụ và phát xạ năng lượng này chính là phổ, từ phổ chúng ta có thể xác định ngược lại cấu trúc phân tử

và hàm lượng chất phân tích

Phương pháp quang phổ được chia thành:

 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử:

 Phương pháp phổ quay và dao động: Phương pháp quang phổ hồng ngoại

 Phương pháp phổ Raman

 Phương pháp phổ UV-Vis

 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

 Phương pháp phổ khối lượng

Mỗi phương pháp quang phổ có một ứng dụng riêng Trong luận văn này, chúng tôi khảo sát các quá trình thí nghiệm trên phương pháp quang phổ UV – Vis

Phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV – Vis (Ultraviolet - Visible) là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi từ lâu Phổ UV – Vis có được

do sự tương tác của các điện tử hóa trị ở trong phân tử hay nhóm phân tử với chùm tia sáng kích thích (chùm tia bức xạ trong vùng UV – Vis) tạo ra Nó là phổ của tổ hợp sự chuyển mức các điện tử liên kết, sự quay và dao động của phân tử, có các cực đại và cực tiểu ở những vùng sóng Δλ nhất định tùy theo cấu trúc và liên kết của phân tử hay nhóm nguyên tử có trong hợp chất Phổ UV – Vis chủ yếu nằm trong vùng sóng từ 190 nm –

800 nm

Hình 1-12: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis

Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng sử dụng quang phổ

UV – Vis là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer:

Nếu ta chiếu một chùm sáng đơn sắc có cường độ Io vào một cuvet chứa dung dịch phân tích có bề dày nhất định, thì một phần chùm sáng đi qua cuvet, một phần phản xạ

và tán xạ ra các phương do va đập vào thành cuvet và một phần bị các phân tử trong cuvet hấp thu Trong đó phần hấp thụ bởi các phân tử chất phân tích trong cuvet là chính

Nếu sau khi đi qua cuvet cường độ ánh sáng còn là I, khi đó sự hấp thụ ánh sáng đơn sắc của các phân tử chất phân tích trong cuvet được biễu diễn như Hình 1-13:

Hình 1-13: Sơ đồ mô tả sự hấp thụ ánh sáng của một dung dịch

Đại lượng mật độ quang: I0

L là chiều dài của dung dịch ánh sáng đi qua (cm)

C là nồng độ của chất hấp thu (mol/L)

Để tăng độ chính xác của việc phân tích bằng quang phổ UV – Vis, có thể kết hợp các kỹ thật đường chuẩn, chuẩn ngoại, thêm chuẩn, phổ đạo hàm, ma trận, …

Tại những dung dịch có nồng độ thấp, Abs của chất cần đo không lớn hơn nhiều so với Abs của dung môi nên Abs tổng hợp của dung dịch đo bao gồm hai giá trị Abs của chất đo và dung môi Điều này làm sai lệch định luật

Trong thực tế, khoảng nồng độ từ thấp đến cao mà trong khoảng đó hàm số Abs = f(C) có hệ số tương quan R ≥ 0,9990 thì được xem như khoảng tuyến tính của định luật

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch đo là tia đơn sắc

Mỗi tia đơn sắc có một  tương ứng (Ví dụ tia đỏ có  = 800nm; tia xanh lam có

 = 435nm) Mỗi tia đơn sắc tương ứng với một độ hấp thu riêng () Nếu ánh sáng truyền qua không đơn sắc thì  của dung dịch đo là tổng hợp của các  ở các  khác nhau

có trong ánh sáng truyền qua

Tuy nhiên, trong thực tế rất khó tạo được ánh sáng đơn sắc mà chỉ tạo được một dải bước sóng quanh giá trị mong muốn, tức là λ + Δλ Thiết bị có bộ đơn sắc hóa càng tốt thì Δλ càng nhỏ Các máy quang phổ hiện đại có Δλ trong khoảng ±1nm

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch thật (dung dịch hoàn toàn trong suốt)

Đối với dung dịch thật, quang trình là bề dày của cốc đo chứa dung dịch mà ánh sáng chiếu qua (l)

Khi dung dịch không trong suốt (chứa các tiểu phân li ti), ánh sáng chiếu qua dung dịch bị các tiểu phân này cản lại nên không đi hết quang trình, do đó giá trị l không còn

là hằng số như dung dịch thật

Định luật Lambert – Beer là chỉ đúng khi ánh sáng truyền qua dung dịch đo chứa đơn chất hay là hỗn hợp có chứa thành phần không gây nhiễu

Thành phần gây nhiễu là thành phần có max gần với max của chất khảo sát Nếu tại max của chất khảo sát, Abs của chất gây nhiễu < 5% Abs chất khảo sát thì xem như chất đó không gây nhiễu

Ngoài ra, để triệt tiêu sự gây nhiễu của dung môi hòa tan chất khảo sát thì cốc so sánh phải chứa dung môi hòa tan Thực hiện tính năng Set reference (Set-ref) của máy

sẽ triệt tiêu nhiễu do dung môi hòa tan gây ra

1.4.3 Ứng dụng của quang phổ UV – Vis trong hóa học phân tích

Phương pháp quang phổ UV-Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa Abs và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer

Phương pháp UV-Vis còn được sử dụng để xác định hằng số cân bằng, hằng số phân

li và nghiên cứu động học phản ứng

Ưu điểm:

 Độ nhạy cao: giới hạn dò tìm của phổ hấp thụ phân tử trong khoảng

10-4 M đến 10-5 M, thậm chí lên đến 10-7 M nếu áp dụng thêm các kỹ thuật thích hợp Sai số tương đối nhỏ (chỉ 1% - 5%)

 Độ chọn lọc từ trung bình đến cao tùy thuộc vào max của chất khảo sát

Trong vùng tử ngoại (UV), nhiều chất có max gần nhau nên có thể gây nhiễu lẫn nhau dẫn đến độ chọn lọc không cao Trong vùng khả kiến (Vis), chất nào có màu đặc trưng sẽ có max đặc trưng nên ít gây nhiễu lẫn nhau dẫn đến độ chọn lọc cao hơn

Ngoài ra, đối với các máy có tính năng quét phổ theo  và lấy đạo hàm của hàm số Abs = f(C) thì tính năng chọn lọc được nâng cao rất nhiều

 Độ chính xác cao: thang đo Abs trong các máy quang phổ UV-Vis hiện nay

là 0,001  3,000 hoặc 0,0001  4,0000 Như vậy sai số tương đối về Abs nằm trong khoảng 0,01%  0,1%

 Dễ thao tác và thực hiện nhanh chóng

 Chi phí tương đối thấp (thấp hơn phương pháp HPLC)

Trong đề tài luận văn này, chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – Vis Ultrospec

2000 của Pharmacia – Anh, thuộc phòng thí nghiệm Vimedim của Công ty SX - KD vật

tư & thuốc thú y Vemedim với các thông số kỹ thuật như sau:

Hình 1-14: Máy quang phổ Ultrospec 2000

Thẩm định phương pháp phân tích là sự thực hiện các thí nghiệm nhằm cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu trong việc xây dựng một phương pháp phân tích

Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối với các phương pháp phân tích hóa học, các yêu cầu cần thẩm định bao gồm:

– Tính đặc hiệu, độ chọn lọc (Specifility/Selectivity) – Độ tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve) – Độ đúng (Trueness)

– Độ chụm (Precision) – Độ bền vững (ổn định) của phương pháp (Robustness/Ruggedness) – Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

– Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ) Việc lựa chọn các yêu cầu thẩm định phụ thuộc vào đối tượng áp dụng của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm Trong nội dung đề tài, chúng tôi lựa chọn các thông số thẩm định phương pháp phân tích bao gồm:

– Độ chọn lọc – Độ đúng – Độ lặp lại – Độ tuyến tính

 Khoảng quét: 190 – 1100nm

 Độ phân giải bước sóng: 1nm

 Thang đo (Abs): 0 – 3

 Độ phân giải Abs: 0,001

 Số cốc đo: 5 cốc và 1 cốc đối chứng

 Quét phổ theo  và lấy đạo hàm đến bậc 4

– Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

b) Yêu cầu:

Sự khác biệt giữa giá trị tìm lại của thành phần khảo sát ở mẫu đơn và mẫu đa thành phần phải nhỏ hơn độ không đảm bảo đo (U) của giá trị tìm lại ở mẫu đơn Độ chọn lọc có thể tính toán theo công thức:

∆R = RÑôn - RÑa ≤ 2UĐơn (1) Hay có thể tính đơn giản hơn bằng công thức:

Ñôn

RR

So sánh kết quả của mẫu chỉ chứa chất khảo sát (Rđơn) với mẫu chứa chất khảo sát

và nhiều thành phần khác (Rđa) ở cùng nồng độ Áp dụng công thức (2) để tính toán

Nói chung, sự khác biệt của hai kết quả càng nhỏ thì độ chọn lọc của phương pháp thử càng cao

Độ đúng là một đặc trưng quan trọng trong một phép phân tích định lượng Độ đúng biểu thị độ gần của kết quả đo so với giá trị thực của mẫu (hoặc với giá trị chấp nhận là đúng) Độ đúng là một khái niệm tương đối, bởi một phương pháp có độ đúng hay không còn phụ thuộc nhiều vào yêu cầu của phòng thí nghiệm và mức độ khó khăn của vấn đề cần phân tích

Có thể xác định độ đúng Rc theo một trong các cách sau:

– Đo tín hiệu phân tích của dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết chính xác (từ 50% – 150% nồng độ dự kiến) Tỉ số giữa kết quả đo và trị số đã biết thể hiện

độ đúng của phương pháp

– So sánh kết quả của phương pháp mới với phương pháp cũ đã biết độ đúng

– Phương pháp thêm chuẩn: thêm lượng đã biết (từ 50 – 150% nồng độ dự kiến) của chất chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ Dùng phương pháp thử để tìm lại giá trị sau khi thêm vào

Theory

X

100X

Trong đó: XRecovery = Xsau  Xtrước

XT heory = lượng chất chuẩn thêm vào – Phương pháp mẫu trắng: thêm lượng đã biết (xấp xỉ nồng độ dự kiến) của chất chuẩn vào mẫu trắng Dùng phương pháp thử để tìm lại giá trị sau khi thêm vào

c) Yêu cầu:

Tùy theo nồng độ đo của mẫu mà Rc phải nằm trong khoảng sau:

Bảng 1-3: Giá trị Rc (%) theo nồng độ chất phân tích

1,0 ≤ C < 10,0 90,0  110,0 0,1 ≤ C < 1,0 80,0  120,0

Độ chụm gồm: độ lặp lại (repeatability) và độ tái lặp (reproducibility)

– Độ lặp lại: áp dụng cho dãy kết quả đo một mẫu trong cùng điều kiện trong khoảng thời gian liên tục (khoảng thời gian ngắn)

– Độ tái lặp: áp dụng cho dãy kết quả đo một mẫu trong cùng điều kiện trong khoảng thời gian không liên tục (khoảng thời gian dài và đo cách khoảng)

b) Cách xác định:

Có thể xác định độ lặp lại bằng các cách sau:

– Tiến hành thí nghiệm lặp lại ít nhất 6 lần trên cùng một mẫu (mỗi lần lặp lại

từ khâu cân hay đong mẫu) Mẫu phân tích là mẫu chuẩn hoặc mẫu trắng có thêm chuẩn

– Tính toán kết quả dựa trên các kết quả phân tích các mẫu thực đã làm

Tiêu chí đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Nồng độ chất phân tích càng thấp thì RSD càng cao

Cách tìm RSD bằng phần mềm Excel:

– Tìm trị số trung bình (mean): Ở một ô trống muốn hiển thị mean, gõ

= AVERAGE (Chọn (bôi đen) dãy số cần tìm), enter – Tìm độ lệch chuẩn (Standard Deviation – SD) Đưa chuột đến ô trống muốn hiển thị SD, gõ = STDEV(chọn (bôi đen) dãy số cần tìm), enter

– Tìm RSD (%): Ở một ô trống muốn hiển thị RSD, gõ = “ô SD”*100/“ô mean”, enter

Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R) R được tính bằng phần mềm Excel R càng gần 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao Ngoài ra cũng cần xem xét các giá trị a và b như sau: