KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG DI TRUYỀN HỌC

 Trình bày được nguyên lý của các kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản: kỹ thuật PCR, điện di ADN, Southern blot, xác định trình tự ADN..  Phân tích được các ưu điểm, nhược điểm, ứng dụng

 Trình bày được nguyên lý của các kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản: kỹ thuật PCR, điện

di ADN, Southern blot, xác định trình tự ADN.

 Phân tích được các ưu điểm, nhược điểm, ứng dụng trong y học của mỗi kỹ thuật trên.

 Là phản ứng kéo dài mồi nhờ ADN polymerase nhằm tổng hợp in vitro các đoạn ADN đặc trưng.

 Khuôn mẫu là một đoạn ADN nhất định

đã biết hoặc chưa biết trình tự

 Các đoạn ADN mới hình thành lại được

sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng

kế tiếp theo phương thức phản ứng chuỗi.

 Biến tính: 93-95 o C

Tách ADN thành 2 sợi đơn

 Gắn mồi: 50-70 o C

Gắn mồi với trình tự bổ sung

 Kéo dài mồi: 72 o C

Tổng hợp sợi ADN mới

 Mồi: đoạn oligonucletide 18-30 Nu, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

 Enzyme ADN polymerase:

Taq polymerase (VK Thermus aquaticus)

 Trộn các thành phần với thể tích 25-50 µl

 Đặt ống PCR vào máy luân nhiệt, cài chương trình luân nhiệt thích hợp

 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

 Nhuộm ethidium bromide

 Đọc kết quả dưới đèn cực tím

 Nhanh, dễ thực hiện

 Rất nhạy

 Có thể khuếch đại ADN mô, tế bào giáng hoá,

tế bào trong môi trường đặc biệt, mô đã cố định formalin, ADN giáng hoá (nếu trình tự ngắn)

 Dễ phát hiện sản phẩm

 Phải biết trình tự ADN ở 2 đầu (flanking)

 Có thể nhiễm ADN từ phòng thí nghiệm (khắc phục được)

 Chỉ thực hiện được với các đoạn ADN cần khảo sát có kích thước ngắn.

 Chẩn đoán đột biến gene trong bệnh lý di truyền.

- Mơ hồ giới tính: xác định gen SRY

- Mất đoạn nhỏ NST Y ở người vô tinh, thiểu năng tinh trùng.

- Teo cơ Duchene: mất đoạn gen dystrophin

 Ứng dụng trong pháp y

 Tạo dòng nhanh chóng, là phương tiện giúp nghiên cứu gen, genome

ĐIÊÊN DI ADN TRÊN

GEL AGAROSE

 Các phân tử ADN mang điêÊn tích âm sẽ di chuyển từ cực âm đến cực dương trong gel agarose khi được đăÊt trong điêÊn trường.

cực tím sau khi nhuôÊm bằng thuốc nhuôÊm huỳnh quang ethidium bromide.

 Kích thước ADN

 PHÂN TÁCH ADN THEO KÍCH THƯỚC

 Nồng độ gel

 Điện thế điện di

 Đặc điểm hình dạng

 HêÊ thống điêÊn di

 BôÊ đổ gel agarose

 Là một kỹ thuật lai phân tử giữa một probe

ADN với một ADN đích để nhận dạng gen đặc hiệu.

 Thực hiện dựa trên việc chuẩn bị các đoạn

DNA được cắt bằng enzym cắt hạn chế rồi

phân tách bằng cách điện di trên gel.

 Các đoạn ADN này được biến tính, chuyển lên màng để lai phân tử.

 Nguồn gốc: là enzym của vi khuẩn, có nhiệm

vụ cắt ADN virus, nhằm hạn chế sự xâm nhập virus.

 Có vị trí nhận biết đặc hiệu trên ADN

Là trình tự ADN lặp lại đảo ngược 4-8 nu.

 Enzym cắt thông dụng: EcoRI

Vị trí nhận biết đặc hiệu là:

GAATTC CTTAAG

 Đột biến mất hoặc thêm nucleotide mà có kích thước trên 50-100 bp.

 Đột biến thay thế nucleotide làm mất vị trí cắt hoặc tạo ra vị trí cắt mới của enzym cắt hạn chế.

 Đột biến GAG → GTG ở codon 6.

 Làm mất 1 vị trí cắt của MstII (CCTNAGG) CCTGAGG → CCTGTGG

 Mất nhiều thời gian, nhiều công đoạn phức

tạp.

 Phụ thuộc vào kỹ thuật tạo dòng (bằng pp tế bào hoặc PCR) để tạo probe.

 Cần nhiều ADN từ bệnh phẩm (5-10 µg) → cần nhiều máu để tách chiết ADN.

 Không thực hiện được từ ADN thô.

 Phương pháp hóa học:

Maxam và Gilbert

 Phương pháp dideoxy (pp kết thúc chuỗi)

Frederick Sanger

 Dùng các dideoxynucleotide thay thế một phần các deoxynucleotide trong quá trình tổng hợp mạch ADN bổ sung.

Đánh dấu phóng xạ, điện di sản phẩm trên gel polyacrylamide, quan sát bằng mắt thường các band tên phim phóng xạ tự chụp

Đánh dấu huỳnh quang, điện di trên gel polyacrylamid, ghi nhận tín hiệu bằng máy kỹ thuật số.

Đánh dấu huỳnh quang, điện di mao quản.