THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM VI SINH

• Tuy nhiên, việc giảm tiêu cự của vật kính và thị kính cũng bị giới hạn hiện tượng nhiễu xạ của ánh sáng trong kính hiển vi, bởi vì với tiêu cự f1 và f2 quá bé sẽ không còn khả năng phâ

THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM VI

SINH

I.LỊCH SỬ:

• Nh ng kính hi n vi ban ữ ể đầ đượ u c phát

minh vào n m 1590 ă ở Middelburg , Hà Lan [1]

Ba ng ườ i th t o kính là ợ ạ Hans Lippershey

(ng ườ đ i ã phát tri n các ể kính vi n v ng ễ ọ

tr ướ đ c ó), Zacharias Janssen , cùng v i cha ớ

c a h là ủ ọ Hans Janssen là nh ng ng ữ ườ đầ i u tiên xây d ng nên nh ng kính hi n vi s khai ự ữ ể ơ

N m 1625, ă Giovanni Faber là ng ườ i xây d ng ự

• 1590-1608- Zacharias Janssen l n ầ đầ u tiên

l p ghép kính hi n vi ắ ể

• 1676- Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) hoàn thi n kính hi n vi và khám phá ra th ệ ể ế

gi i vi sinh v t (mà ông g i là ớ ậ ọ anmalcules).

N m 1625, ă Giovanni Faber là ng ườ i xây d ng ự

m t kính hi n vi hoàn ch nh ộ ể ỉ đặ t tên là

Galileo Galilei [2]

• N m 1938, kính hi n vi i n t ra ă ể đ ệ ử đờ ạ i t i

M ỹ M t th ắ ườ ng ch có th phân bi t v t th ỉ ể ệ ậ ể

t i kích th ớ ướ c 106 Å(angstrom), 1 Å = 0,1nm

(nanomètre), hay = 1.0 × 10-10 met.

Kính hi n vi quang h c thông th ể ọ ườ ng có th ể phóng đạ đượ i c 500 l n, t c phân bi t ầ ứ ệ đượ c

2000 Å Kính hi n vi quang h c hi n ể ọ ệ đạ i nh t ấ

có độ phóng đạ i 2.500 l n Kính hi n vi i n ầ ể đ ệ

t có th phóng ử ể đạ i 40.000 l n, th m chí có ầ ậ

II.NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG:

• Các bộ phận chủ yếu của KHV trường sáng

bao gồm vật kính và thị kính Vật kính O1 là một hệ thấu kính quang học phức tạp, tác

dụng như một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất nhỏ (vài mm), thị kính O2 cũng là thấu kính hội tụ quang học có tiêu cự lớn hơn đặt cách O1 một khoảng rất lớn so với hai tiêu cự của chúng

• Nguyên tắc hoạt động của KHV như sau :

Kính hiển vi quang học trường

sáng

• Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động :

O1B

A2 A1A

o2

• Vật nhỏ AB phải quansát được đặt trước tiêu

điểm F2 của vật kính (tức nằm ngoài tiêu cự) và rất gần tiêu điểm vật kính O1 sẽ cho một ảnh thực A1B1 cho ngược chiều lớn hơn vật A1B1 đóng vai trò vật đối với thị kính O2 và cho ảnh ảo A2B2, ảnh ảo này lớn gấp nhiều lần A1B1 và gấp bội lần AB.Đặt mắt sau thị kính ta sẽ quan sát được ảnh ảo này Muốn

nhìn rõ được ảnh ảo A2B2 ta phải điều chỉnh vật AB với kính (hoặc điều chỉnh kính đối với vật) sao cho ảnh A2B2 nằm trong khoảng

nhìn rõ nhất của mắt (hình 5-4)

• * Naêng suaát phaân li cuûa kính hieån vi

α

B

d

• Chúng ta đã biết các tia sáng cũng như các

chùm điện tử có cùng vận tốc khi đi qua một khe hẹp đều bị thay đổi phương truyền do

hiện tượng nhiễu xạ Nhờ có hiện tượng

nhiễu xạ và vận dụng tiêu chuẩn Rayleigh người ta đã xác định được khả năng phân li của các dụng cụ hiển vi :

• Năng suất phân li của dụng cụ hiển vi là

một đại lượng cho biết khả năng phân li hai điểm có khoảng cách nhỏ nhất (cỡ µm)

Năng suất phân li càng lớn thì khả năng

phân giải càng cao Thí dụ hai điểm sáng

có khoảng cách là l qua kính hiển vi cho 2 ảnh nhiễu xạ có cực đại trung tâm với cường độ phân bố trên hình 5-6.Các đường đậm

nét là cường độ sáng tổng hợp

• Từ đây dễ dàng thấy khả năng phân li 2

điểm sáng khi khoảng cách d giữa hai đỉnh của hai cực đại trung tâm phải lớn hơn bán kính vân sáng trung tâm tức là d>p, khi p thì không có khả năng phân li nữa Như

vậy, phải có dmin để cho KHV còn có khả năng phân ly Chúng ta đã biết :

• nên

• người ta đã chứng minh được với điều kiện

trên thì:

f r

, F

• là khoảng cách giữa hai điểm sáng mà mắt còn phân biệt được Nếu gọi năng suất phân li của KHV là S thì nó là đại lượng nghịch đảo của I min (khoảng cách nhỏ

nhất giữ a hai diểm sáng)



• với

• n: chiết suất môi trường đặt vật quan sát

∀ θ: góc lệch của tia sáng hoặc chùm điện tử với trục chính

n

, min = 0 61



• Từ (1-7) chúng ta thấy muốn có S lớn thì

phải nhỏ, nhỏ khi n, θ là lớn và càng bé càng tốt Chính vì vậy chùm điện tử có bước sóng liên kết rất nhỏ nên KHV điện tử có khả năng phóng đại lớn hơn (105 lần )

» Độ phóng đại của kính hiển vi :

• Đại lượng đặc trưng thường dùng nhất của

KHV là độ phóng đại – tỷ số độ lớn ảnh

cuối cùng trên độ lớn vật

A

B

A AB

B

A

1 1

2 2

1 1

k B

• Vậy độ phóng đại của KHV là :

• Gọi khoảng cách giữa tiêu điểm chính thứ

hai của vật kính và tiêu điểm chính thứ của thị kính là là độ dài quang học của KHV.

• f1 tiêu cự thứ hai của vật kính

• f2 tiêu cự thứ hai của thị kính

2

k

• Người ta đã chứng minh được độ phóng đại

của KHV xác định theo công thức sau:

• Công thức 1-9 cho biết với , l cố định thì các

hệ quang học có tiêu cự càng ngắn độ phóng đại càng lớn

) cm

( ' f

' f

K K

2

0 1

=

=

= ∆  

• Tuy nhiên, việc giảm tiêu cự của vật kính và

thị kính cũng bị giới hạn hiện tượng nhiễu xạ của ánh sáng trong kính hiển vi, bởi vì với tiêu cự f1 và f2 quá bé sẽ không còn khả năng phân biệt được hai điểm sáng nằm gần nhau

Độ tương phản

• Độ tương phản là sự khác nhau giữa cường

độ sáng trên ảnh của vật và môi trường

xung quanh hoặc giữa các phần khác nhau trên ảnh Độ tương phản càng lớn thì ảnh càng rõ nét Khi cho ánh sánh có bước sóng xác định chiếu vào vật cần quan sát thì độ tương phản thể hiện sự hấp thụ khác nhau giữa các phần cần nghiên cứu với môi

trường xung quanh Muốn quan sát nhân và

• Do đặc điểm riêng của các cấu trúc, khả

năng hấp thụ năng lượng của chúng sẽ khác nhau Tuy nhiên trong thực tế có những đối tượng sống có mức độ hấp thu năng lượng

ánh sáng giống nhau với môi trường xung

quanh, do đó độ tương phản của ảnh kém và ảnh không rõ Để giải quyết vấn đề này

người ta nhuộm vật nghiên cứu, vật hấp thụ thuốc nhuộm khác hẳn và độ tương phản

của ảnh sẽ được tăng lên Nhưng việc nhuộm tiêu bản làm chết tế bào nên không thể quan

CÁC LỌAI KÍNH HIỂN VI:

• 1.Kính hiển vi kh ki n: : ả ế

• Kính hiển vi kh ki n ( KHV quang học ả ế

trường sáng) là loại KHV có nguồn chiếu là nguồn phát ánh sáng trắng và thấu kính

làm bằng thuỷ tinh trong suốt.

• Kính hi n vi g m hai b ph n c h c và ể ồ ộ ậ ơ ọ quang h c B ph n c h c bao g m ng ọ ộ ậ ơ ọ ồ ố kính là m t ng tròn, th ng, l p trên kính ộ ố ẳ ắ ở

hi n vi; mâm v t kính l p ể ậ ắ ở đầ u d ướ ố i ng kính có 4 l ỗ để ắ l p v t kính, mâm xoay ậ

quanh tr c c a ng kính theo chi u kim ụ ủ ố ề

ng h Tr kính hình cung n m gi a

ng kính và kính kính n i ti p v i

• Ố đ ề c i u ch nh g m có c v c p và c vi ỉ ồ ố ĩ ấ ố

c p, c v c p n m ngoài có tác d ng di ấ ố ĩ ấ ằ ụ

chuy n v t kính lên xu ng m c ể ậ ố ở ứ độ ớ l n, còn tác d ng c a c vi c p di chuy n v t ụ ủ ố ấ ể ậ kính v i kho ng cách nh ch ng vài ớ ả ỏ ừ

micromét Mâm soi có m t l tròn ộ ỗ để ánh sáng

t t quang r i lên và có m t xa tr ừ ụ ọ ộ ượ t dùng

di chuy n lam kính soi

• B ph n quang h c bao g m v t kính v i ộ ậ ọ ồ ậ ớ hai lo i là v t kính khô và v t kính d u V t ạ ậ ậ ầ ậ kính d u có ầ độ phóng đạ ớ ừ i l n t x90 và

• T quang l p d ụ ắ ướ i mâm soi và di chuy n theo ể chi u th ng lên xu ng v i tác d ng làm t p ề ẳ ố ớ ụ ậ trung ánh sáng d i lên tiêu b n xét nghi m; ọ ả ệ

ngay trong b ph n t quang có kèm theo ộ ậ ụ

m t chi t quang ộ ế để ă t ng ho c gi m ặ ả độ

sáng G ươ ng soi g m có hai m t, m t m t ồ ặ ộ ặ

ph ng và m t m t lõm có tác d ng ph n chi u ẳ ộ ặ ụ ả ế ngu n sáng m t tr i lên t quang phòng ồ ặ ờ ụ Ở

thí nghi m c nh, g ệ ố đị ươ ng soi c a kính ủ

hi n vi ể đượ c thay th b ng h th ng èn ế ằ ệ ố đ

• Trên nguyên lý, kính hi n vi quang h c có th ể ọ ể

• v i là b ớ λ ướ c sóng ánh sáng, NA là thông s ố

kh u ẩ độ Vì th , ế độ phân gi i c a các kính ả ủ

hi n vi quang h c t t nh t ch vào kho ng ể ọ ố ấ ỉ ả vài tr m nm ă

Kính hiển vi tử ngoại

• Nguyên lí và cấu tạo cơ bản giống kính

hiển vi trường sáng chỉ khác ở điểm sau

đây:

• Soi tiêu bản bằng ánh sáng tử ngoại (đèn

thủy ngân).

• Các thấu kính làm bằng thạch anh bởi vì

thủy tinh thường hấp thụ mạnh tia tử ngoại còn thạch anh không hấp thụ tia tử ngoại.

• Có bộ lọc tia tử ngoại để tạo ra chùm tia đơn

sắc bao gồm lăng kính phân tích, khe lọc và lăng kính phản xạ toàn phần (hình 1-13)

Cần chú ý không quan sát trên kính hiển vi tử ngoại bằng mắt thường vì tia tử ngoại có tác hại lớn tới mắt Vì vậy khi nghiên cứu

bằng kính hiển vi tử ngoại phải chụp bằng

• Ưu điểm chính của tia tử ngoại là tia tử

ngoại có bước sóng ngắn do đó (theo công

thức 1-7) làm tăng năng suất phân li của

kính (có thể tăng gấp đôi so với kính hiển vi trường sáng), đồng thời cũng làm tăng độ

tương phản của ảnh vì các thành phần cấu trúc của tế bào như protein, acid nucleic hấp

Kính hiển vi huỳnh quang

• Nguyên lí của kính hiển vi huỳnh quang là

dựa vào hiện tượng một số chất khi bị tia tử ngoại kích thích sẽ phát ra ánh sáng có

bước sóng đặc trưng cho chính nó Thí dụ diệp lục sẽ phát quang màu đỏ tươi Sự

phát quang của chính vật cần nghiên cứu

do tác dụng của tia tử ngoại tạo nên ánh

sáng huỳnh quang sẽ tạo ảnh của vật qua

• Từ nguyên lí này chúng ta thấy cấu tạo của

kính hiển vi huỳnh quang có những phần giống kính hiển vi trường sáng và kính hiển

vi tử ngoại, chỉ thêm một bộ phận ngăn tia tử ngoại để nó không có troing thành phần tạo ảnh của vật Có một số thành phần

trong cấu trúc tế bào như protein, acid

nucleic không có khả năng phát quang do

4 Kính hiển vi điện tử

»Cấu tạo:

• Khi xét về năng suất phân li của kính hiển

vi quang học trường sáng, ta đã biết công thức sau:

α

λ

sin n

d

2

=

• Trong đó d là khoảng cách phân ly tối thiểu

của kính, là bước sóng của ánh sang chiếu vào vật, n là chiết suất của môi trường giữa vật và thấu kính, là góc mở của vật kính Kính hiển vi sẽ có năng suất phân li càng lớn nếu d càng nhỏ Như vậy, năng suất

phân li tỉ lệ nghịch với và tỉ lệ thuận với a

• Ở các kính hiển vi tốt, có thể đạt tới 70o ()

Nếu chùm sáng chiếu vào vật có bước sóng trung bình 0,5 m và dùng vật kính chìm (nhỏ một giọt dầu bá hương có chiết suất 1,3 lên vật kính, như thế đã làm tăng chiết suất của môi trường giữa vật kính và vật từ 1 lên 1,3), thì d có thể đạt tới giá trị:

• Xem như vậy, kính hiển vi trường sáng

không thể giúp chúng ta quan sát được vật hoặc các chi tiết của vật có kích thước nhỏ hơn 0,16m như các phân tử, các đại phân tử cấu tạo nên các mô, tế bào, các virus, các

chi tiết dưới mức tế bào , đối tượng của sinh

m

, ,

,

,

94 0

3 1 2

• Sự phát sinh ra kính hiển vi điện tử có năng

suất phân li lớn hơn kính hiển vi trường sáng nhiều lần đã đánh dấu một giai đoạn mới trong đó con người đã tiến sâu hơn vào thế giới vi mô, đã mở đường cho không những ngành sinh học mà còn nhiều ngành khoa học kĩ thuật phát triển

• Năm 1923 LuiĐơbờrơi (Loui de Broglie) đã

cho chùm điện tử có cùng vận tốc v được gắn với một sóng có bước sóng xác định bằng hệ thức:

h

• : khối lượng của điện tử

• h: hằng số Plăng (Plank)

• Khái niệm bước sóng liên kết giúp chúng ta

hiểu được nhiều hiện tượng mà chúng ta

không thể giải thích được bằng các quan

điểm của cơ học cổ điển

ω

• Vài năm sau, người ta đã thực hiện các thí

nghiệm đầu tiên về nhiễu xạ điện tử bằng cách chiếu một chùm hẹp điện tử có cùng vận tốc vào một lá vàng mỏng cấu tạo bởi các vi tính thể phân bố theo rất nhiều hướng Sau khi qua lá vàng chùm điện tử sẽ có vận tốc khác nhau và ảnh thu được khi chiếu chùm tia X đồng sắc vào lá vàng trên và bán kính các vòng tròn nhiễu xạ ghi trên phim có thể tính được nếu quan niệm chùm

• Sự phù hợp giữa trị số tính theo hệ thức trên

và trị số trên thực nghiệm đã chứng minh

tính chất đúng đắn của quan điểm Broglie.

Chùm điện tử cùng vận tốc

Lá vàng

Hình nhiễu xạ của chùm điện tử cùng

vận tốc

• Quan điểm này là lí luận cơ bản dẫn đến

việc chế tạo kính hiển vi điện tử: thay chùm tia sáng vào vật bằng chùm điện tử mà bước sóng kiên kết của nó ngắn hơn của ánh

sáng nhìn thấy nhiều lần ; nhờ việc thay thế đó chúng ta có thể tăng gấp bội năng suất phân li Chúng ta hãy tính khoảng cách

phân li tối thiểu của kính hiển vi điện tử

bằng công thức:

• của các lưới điện tử lọt vào vùng có điện

trường Nếu vận tốc ban đầu của các điện tử nhỏ và Trong đó e và m là diện tích và khối lượng của điện tử Thay giá trị cụ thể của U vào công thức chúng ta có thể tính được v và sau đó có thể tính được

22

1

mv

• Bảng sau chỉ quan hệ giữa U và

•

m m

1 = − = −

λ

• Trường hợp U = 60 kV, sẽ bằng 5pm.Với giá

trị này của , về phương diện lí thuyết khoảng cách phân li tối thiểu có thể đạt tới 2pm

nghĩa là nhỏ hơn khoảng cách phân li tối

thiểu của kính hiển vi trường sáng loại tốt

nhất 100.000 lần

• Thấu kính điện tử:

• Trong kính hiển vi điện tử cần phải có các

thấu kính điện tử để làm lệch chùm điện tử (tương ứng với các thấu kính bằng thủy tinh khúc xạ ánh sáng trong kính hiển vi trường sáng) có 2 loại thấu kính điện tử :thấu kính tĩnh điện và thấu kính từ:

• Thaáu kính tónh ñieän:

Tiêu điểm

O

• Hình 5-15 mô tả một cách đơn giản thấu kính

tĩnh điện Thấu kính cấu tạo bởi một tụ điện mà hai bản là các lưới kim loại xếp theo hai mặt cong có cùng tâm O Qua các lỗ điện trường giữa hai má tụ điện có cường độ lớn thì quỹ đạo của các điện tử thường trùng với đường sức của điện trường Các điện tử có quỹ đạo song song với trục của thấu kính tĩnh điện sẽ hội tụ tại O, điểm này tương ứng với tiêu

• Thấu kính từ:

• Thấu kính này tạo bởi 1 Rôbin hình

sô-lê-nô-it (1 bình lò xo xoắn tròn) Rôbin được bọc bằng một vỏ thép để cho từ trường chỉ xuất hiện tại vùng E (hình 1) Các điện tử mà quỹ đạo đi qua điểm vật A, khi ra khỏi thấu kính sẽ hội tụ tại A (điểm ảnh).

• Công suất P của thấu kính xác định bởi

công thức :

• H:là cường độ từ trường do thấu kính tạo

nên

• i:là cường độ dòng điện qua bôbin

• U: là hiệu điện thế tăng tốc cho các điện tử

U

i '

k U

H k

• Nguyên lí tạo ảnh

• Về nguyên lí chung cơ bản là giống kính

hiển vi quang học, song chỉ khác ở chỗ

nguồn bức xạ chiếu vào mẫu vật là nguồn

sáng e- và các thấu kính làm lệch hướng

truyền của chùm tia e- là các thấu kính từ

đồng thời có thêm một số bộ phận đặc biệt

phù hợp với tính chất cấu tạo ảnh của chùm tia điện tử như màn huỳnh quang để ghi

hình, mẫu vật được đặt trong chân không để tránh hiện tượng tán xạ của electron trong không khí và làm tăng độ tương phản hình (5-17) là sơ đồ cấu tạo và nguyên tắc tạo ảnh

• Chùm tia electron được phát ra từ sợi đốt (1)

bằng kim loại trước khi đi vào thấu kính từ hội tụ (2) (giống vai trò của tụ quang ở kính hiển vi quang học) electron được gia tốc ở

vùng A có điện trường mạnh được tạo bởi U – 60KV Sau khi qua thấu kính (2) chùm

điện tử chiếu vào mẫu vật đặt trong chân

không (B),

• sau khi đi vào mẫu vật chùm electron đi vào

thấu kính từ (3) có vai trò như vật kính ở

kính hiển vi quang học và tạo nên ảnh thứ A1B1, vai trò của thấu kính này giống thị kính ở kính hiển vi quang học Màn huỳnh quang E sẽ ghi ảnh A2B2

• Để đảm bảo không có sự tán xạ điện tử

trong không khí người ta dùng hệ thống bơm như “bơm khuếch tán” hay “bơm phân tử” để tạo khoảng không bên trong kính và có một của sổ đặc biệt để đưa mẫu vật vào mà không làm ảnh hưởng đến độ chân không của kính.

• Khi đưa tiếp một vật khác vào để quan sát

người ta phải cho hệ thống bơm hoạt động