hóa sinh học thực phẩm

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau . Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (làm mềm thịt , đông tụ sữa làm pho mát, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…)

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO

Đề tài: Ứng dụng enzyme protease trong công nghê

chế biến thịt

Giáo viên: Trần Thị Minh Ha

Tháng 5- 2016

LỜI MỞ ĐẦU

Ngay nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghê sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất cang nhiều va được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiêp, chăn nuôi, y tế… Hang năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triêu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiêp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm la enzyme thủy phân được sử dụng cho viêc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease la enzyme được sử dụng nhiều nhất hiên nay trong một số nganh sản xuất như: sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiêp đặc biêt la trong lĩnh vực công nghê thực phẩm (lam mềm thịt , đông tụ sữa lam pho mát, bổ sung để lam tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…)

I Tổng quan về emzyme protease

1.1 Định nghĩa enzyme protease

- Protease la enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein va peptid thanh các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton

- Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng la các axit amin Ngoai ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este va vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.

3

- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bao, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm va virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) va động vật (gan, dạ day bê ) So với protease động vật va thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biêt Trước hết hê protease vi sinh vật la một hê thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng va hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

- Cũng do la phức hê gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường

có tính đặc hiêu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triêt để va đa dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease.

1.

2 Phân loại

Protease được phân chia thanh hai loại: endopeptidase va exopeptidase

* Dựa vao vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thanh hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide va giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vao động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thanh bốn nhóm: + Serin proteinase: la những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động va có vai trò đặc biêt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm nay bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin va subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính va thể hiên tính đặc hiêu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vai protein động vật va proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiêu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động va thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

5

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase la nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính va hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoai ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thanh ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

II Nguồn thu nhận enzyme protease

- Enzyme la protein được sinh vật tổng hợp trong tế bao va la chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem la nguồn thu nhận

để sản xuất enzyme Nhưng vẫn chủ yếu la ba nguồn chính: Động vật, thực vật va vi sinh vật

2.1 Nguồn động vật:

- Tụy tạng: đây la nguồn enzyme sớm nhất, lâu dai nhất va có chứa nhiều enzyme nhất Trypsin la men phân giải các protein hỗn hợp, men nay do tuyến

tụy tiết ra, tiền thân của nó la trypsinogen, được hoạt hóa bởi Enterokinaza của ruột Trypsin la một enzyme có chức năng phân cắt các protein ta ăn vao thanh mảnh nhỏ đồng thời tự phân cắt nó ra mảnh nhỏ

- Ngoai ra ở tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzyme nay góp phần phân giải protein trong ruột non va được chiết xuất từ tụy bò

- Dạ day bê: Trong ngăn thứ tư của dạ day bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên la renin Enzyme nay đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghê phomat Renin lam biến đổi cazein thanh paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây la quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu va ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong

trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ day bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loai Eudothia Parasitica va Mucor Purillus

2.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain va Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme nay được sử dụng để chống lại hiên tượng tủa trắng của bia khi lam lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật nay la trong công nghê lam mềm thịt va trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

7

Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật Hình 1.3 Mô hình phân tử e Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật nzyme protease (papain)

2.3 Vi sinh vật

Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc va xạ khuẩn…gồm nhiều loai

thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces va một số va một số

loại nấm men

 Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vao khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiêu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease la Bacillus subtilis,

B mesentericus, B thermorpoteoliticus va một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó,

B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn va cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính va kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) va có khả năng chịu nhiêt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm

ít đắng hơn so với protease động vật va tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính

có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo va thơm Chúng được sinh ra nhiều

bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus va một số giống thuộc chi

Clostridium.

Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điên bằng 11, khối lượng phân tử từ

20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 va hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Bacillus

 Xạ khuẩn

Về phương diên tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn va nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp

protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

9

Hình 2.5 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều la pronase (Nhật) được tách

chiết từ S grieus, enzyme nay có đặc tính đặc hiêu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%

liên kết peptide của nhiều protein thanh amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên la protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên la M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae cũng

có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiêp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiêu, vì thế có thể sử dụng các enzyme nay theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vê, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hê hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật la nguồn nguyên liêu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghê va đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

• Chủ động về nguyên liêu nuôi cấy vi sinh vật va giống vi sinh vật

• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm

• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dang theo hướng có lợi (định hướng

sử dụng va tăng hiêu suất tổng thu hồi)

• Giá thanh tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bênh) để có biên pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp

ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nao đó

III Ứng dụng enzyme protease trong công nghệ chế biến thịt

3.1 Làm mềm thịt

- Trong công nghiêp chế biến thịt, các enzyme phân giải protein cũng được sử dụng trong viêc lam mềm thịt Kết quả lam cho thịt có một độ mềm thích hợp va có vị tốt hơn Protease được sử dụng để lam mềm thịt va tăng hương vị thịt

- Chế phẩm enzyme để lam mềm thịt thường chứa papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật Tùy theo tính chất của thịt ma sử dụng các chế phẩm một cách thích hợp Chẳng hạn đối với thịt cứng thì trong chế phẩm ngoai hoạt tính proteolizơ

ra phải có cả hoạt tính elastaza ( nghĩa la có khả năng phân giải elastin) Chế phẩm loại

nay có thể thu được từ Actinomyces fradiae Người ta nhận thấy rằng chế phẩm keratinaza từ Actinomyces fradiae nay có tác dụng mềm thịt xấp xỉ với tandrin (la chất lam mềm thịt tốt nhất của nước ngoai) Chế phẩm protease từ Aspergillus terricola thì

không có hoạt tính elastaza do đó khả năng lam mềm thịt rất yếu

- Kĩ thuật lam mềm thịt :

11

+ Enzyme protease được dùng lam mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả lam cho thịt có một độ mềm thích hợp va có vị tốt hơn Protease được sử dụng để lam mềm thịt va tăng hương vị thịt (ngâm thịt vao dinh dưỡng protease ở pH va nhiêt độ xác định- phương pháp nay phổ biến va thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp lam mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vao thịt; tiêm dung dịch enzyme

vao con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces

fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất

dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoan toan các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D lam giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thuỷ phân sâu sắc va triêt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiêu cao va tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loai: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lê tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân

Ưu điểm của viêc thuỷ phân protease bởi enzyme la bảo toan được vitamin của nguyên liêu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không lam sẫm mau dịch thuỷ phân

- Để lam mềm thịt, người ta hay sử dụng papain, bromelin, fixcin….có điều các enzyme nay chỉ phân giải được các liên kết peptit ở vùng không xoắn của collagen do đó hoặc có thể không mấy hiêu quả đối với thịt chứa nhiều collagne hoặc thủy phân thịt quá mức lam cho thịt có chất lượng cảm quan xấu

- Các yêu cầu đối với chế phẩm enzyme sử dụng trong lam mềm thịt:

+ Có khả năng chịu nhiêt

+ Không độc đối với con người

+ Có khả năng lam giảm độ bền vững của mô liên kết khi gia nhiêt

Ngay nay, papain va các enzyme proteolitic nguồn gốc vi khuẩn, nấm, thực vật được sử dụng phổ biến trong xử lý thịt bảo quản chủ yếu bằng 3 phương pháp sau

 Ngâm trong dung dịch enzyme,

 Bôi bột lam mềm thịt có chứa enzyme cùng với mì chính, muối ăn, tinh bột…

 Bơm dung dịch enzyme vao mô thịt

Ưu điểm của viêc thuỷ phân protease bởi enzyme la bảo toan được vitamin của nguyên liêu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không lam sẫm mau dịch thuỷ phân

Các enzyme papain, bromelin, pepsin hoặc các protease vi khuẩn từ Aspergillus,

Bacillus…., được sử dụng lam mềm thịt, hòa tan các protein cá,…nói chung thủy phân

bằng protease lam tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc biêt có lợi cho những người bị mắc bênh tiêu hóa kém hoặc lam mất tính mẫn cảm của người sử dụng với protein

Thủy phân protein trong điều kiên thích hợp lúc đầu thu được các peptid có kích thước nhỏ sau đó xảy ra hiên tượng plastein hóa như sắp xếp lại các peptid hoặc gắn thêm các acid amin không thay thế Protease cũng được dùng để xử lý, tận dụng các phế liêu từ thịt, hoặc các nguyên liêu có nguồn gốc từ protein (thịt vụn, xương, gelatin…) để tạo ra các sản phẩm có giá trị như dịch protein, chất tăng vị, chất cải thiên mùi…

Enzyme Papain :

Papain la một protease điển hình được ứng dụng nhiều trong công nghê chế biến

thịt, có trong cây đu đủ va đu đủ núi

Cấu trúc: bao gồm 212 amino acid được ổn định bằng 3 cầu nối disulfide Cấu trúc

không gian gồm 2 phần rõ rêt với 1 khe ở giữa Khe nay chứa vùng hoạt động chứa đựng một “bộ ba xúc tác” được ví như chymotrypsin Bộ 3 xúc tác được lam từ 3 amino acid: cystein - 25, histidine - 159 va asparagines - 158

Chức năng: Lam đứt liên kết peptit liên quan đến sự deproton của cys-25 bởi

his-159 Asn-158 giúp định hướng nhóm imido của his-159 cho phép sự deproton diễn ra Sau đó cys-25 thực hiên sự tấn công nucleophitic vao carbon carbonyl của 1 mạch peptid Nhóm amino cuối cùng của mạch peptit được tự do acyl-enzyme đồng hóa trị ngay lập

13