TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 57, 2010 NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC, QUY TRÌNH SẢN XUẤT GEL GCL VÀ THỬ NGHIỆM DÙNG CHO MÁY CẮT LẠNH MÔ TRONG XÉT NGHIỆM SINH THIẾT TỨC THÌ Ngô Văn Trung, N
Trang 1TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 57, 2010
NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC, QUY TRÌNH SẢN XUẤT GEL GCL
VÀ THỬ NGHIỆM DÙNG CHO MÁY CẮT LẠNH MÔ TRONG XÉT NGHIỆM SINH THIẾT TỨC THÌ
Ngô Văn Trung, Nguyễn Văn Mão
Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế
TÓM TẮT
Gel dùng cho máy cắt lạnh là một sản phẩm không thể thiếu trong quá trình sản xuất tiêu bản sinh thiết lạnh tức thì, loại gel này từ trước đến nay luôn phải nhập ngoại, khó mua và rất đắt tiền chúng tôi đã nghiên cứu sản xuất được gel thay thế gel ngoại nhập với chất lượng tương đương, giá thành hạ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng được quy trình gồm 4 bước sản xuất gel dùng cho máy cắt lạnh từ nguyên liệu thông dụng sẵn có trong nước là polyvinyl alcohol với trang thiết bị đơn giản, chất lượng gel làm ra luôn ổn định, bảo quản dễ dàng, thời hạn sử dụng lâu dài
Tất cả các trường hợp thử nghiệm bằng gel GCL đều đọc tốt và cho kết luận rõ ràng, gel GCL tương đương gel ngoại nhập cả trên phương diện cắt và đọc tiêu bản Do đó, gel GCL
có thể thay thế gel ngoại nhập với giá thành chỉ bằng 20%
1 Đặt vấn đề
Thế kỷ 21 là thế kỷ của khoa học và công nghệ, trong đó có nhiều thành tựu to lớn ứng dụng trong y học nhằm bảo vệ sức khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống Tuy nhiên, loài người phải đối diện với một thách thức lớn là bệnh tật, đặc biệt là bệnh ung thư
Để điều trị căn bệnh hiểm nghèo này, vai trò của chẩn đoán mô bệnh học đã được khẳng định có khả năng phát hiện sớm các giai đoạn của ung thư, giúp điều trị bệnh có hiệu quả ngày càng cao Trong 2 phương pháp chính của mô bệnh học thì sinh thiết lạnh tức thì là khâu đột phá về thời gian, có thể có kết quả trong vòng 15 phút Phương pháp này đã giúp cho thầy thuốc có thể quyết định cách thức phẫu thuật phù hợp ngay khi bệnh nhân đang nằm trên bàn mổ.[3,6]
Trong quá trình triển khai kỹ thuật này, một trong những khó khăn mà các cơ sở gặp phải đó là giá thành rất cao của gel dùng cho máy cắt lạnh, hơn nữa, các loại gel nhập ngoại không có mặt trên địa bàn các tỉnh miền Trung, do đó, các cơ sở y tế không
Trang 2chủ động được trong công tác chẩn đoán bệnh, nên nhiều người dân chưa được tiếp cận
kỹ thuật cao này một cách rộng rãi
Để giải quyết vấn đề này, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tìm tòi nghiên cứu chế tạo gel dùng cho máy cắt lạnh nhằm thay thế gel nhập ngoại bằng nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Trải qua thời gian dài nghiên cứu và thử nghiệm, đến nay, chúng tôi đã sản xuất được gel tự chế có tên viết tắt là gel GCL, được đưa vào sử dụng tại Bộ môn Giải phẫu bệnh - Y pháp Trường Đại học Y Dược Huế từ tháng 9/2004 đến nay [4,13]
Ở Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu sản xuất Gel dùng cho cắt lạnh,
vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu:
- Nghiên cứu công thức và xây dựng quy trình sản xuất gel tự chế GCL
- Thử nghiệm gel tự chế GCL dùng cho máy cắt lạnh mô trong xét nghiệm sinh thiết lạnh tức thì
2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
- Bột polymer tổng hợp Polyvinyl alcohol
- 300 mẫu bệnh phẩm sau phẫu thuật được lấy từ các u lành tính và ác tính của hầu khắp các cơ quan trong cơ thể Mỗi mẫu bệnh sẽ được cắt thành 2 tiêu bản, 1 tiêu bản sử dụng gel nhập ngoại, tiêu bản còn lại sử dụng gel tự chế GCLI hoặc gel GCLII
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân tích so sánh và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm có đối chứng
2.3 Phương tiện nghiên cứu
Máy cắt lạnh Microm HM 505 N (Đức), kính hiển vi nghiên cứu Zeiss Axioskop
2.4 Địa điểm nghiên cứu thử nghiệm
Tại 3 cơ sở y tế là Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế, Bệnh viện Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng
2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phương pháp thống kê y học, ứng dụng phần mềm SPSS 10.0
Trang 33 Kết quả nghiên cứu
3.1 Kết quả về nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất gel dùng cho máy cắt lạnh từ polyvinyl alcohol
3.1.1 Thiết kế quy trình sản xuất gel GCL chúng tôi rút ra 4 bước như sau
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, cân đong, tinh lọc nguyên liệu
Bước 2: Nấu gel: hòa tan PVA (trong nước cất với gel GCLI, và hòa tan trong
dung dịch nước muối sinh lý với gel GCLII), đun sôi, chưng cách thủy
Bước 3: Pha màu thử nhanh
Bước 4: Lắng bọt, khử trùng, đóng chai gel thành phẩm: thời gian trung bình 12
giờ với gel GCLI và 36 giờ với gel GCLII
4 giai đoạn này được mô tả tóm tắt qua sơ đồ sau:
Sơ đồ 1 Mô hình tóm tắt quy trình sản xuất gel GCL
Qua thực tế sản xuất thử ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy: gel GCL được sản xuất theo một quy trình khá đơn giản, không đòi hỏi máy móc trang thiết bị hiện đại, nguyên liệu rẻ tiền, có sẵn tại địa phương
3.2 Kết quả về nghiên cứu công thức gel dùng cho máy cắt lạnh
Bảng 1 Các chỉ tiêu vật lý của gel nội và gel ngoại
- Độ quánh
(độ nhớt tuyệt đối ) 4835 ( cP) 20854 (cP) 21754 (cP)
Nấu gel hòa tan PVA trong nước
Lắng bọt đóng chai
khử trùng
Chuẩn bị
dụng cụ,
cân đong
tinh lọc
nguyên liệu
Pha màu thử nhanh
Trang 4Kết quả bảng 1 cho thấy:
- Về tỷ trọng:
+ Giữa gel nội (GCL) và gel ngoại có tỷ trọng tương tự như nhau (GCLI = 1,05, GCL 2 = 1,04, gel ngoại = 1,03)
- Độ PH:
+ Gel ngoại có độ PH thấp hơn gel nội một ít: 4,54 so với 5,75 và 5, 93 (PH dao động trong khoảng từ 4,5 đến 5,7 là đạt yêu cầu.)
Trong kỹ thuật mô học, chất cố định mô ở môi trường nghiêng về acide thì thường cố định bệnh phẩm tốt hơn [14], chúng tôi cho rằng có thể điều chỉnh độ PH của gel trong những lần sản xuất sau
- Độ quánh: còn gọi là độ nhớt tuyệt đối: có sự khác biệt rõ rệt lớn về độ nhớt
tuyệt đối giữa gel nội và gel ngoại
+ Gel GCLI quánh gấp 4,313 lần và gel GCLII quánh gấp 4,5 lần gel ngoại, điều này có thể giải thích là: gel nội chỉ có một thành phần chính là PVA – chất quyết định để sản xuất ra gel dùng cho máy cắt lạnh có hàm lượng cao hơn gel ngoại (15,8 % so với 9,8% - Bảng 3.6.) nên tạo ra độ quánh lớn hơn Trên thực tế, độ quánh không ảnh hưởng
gì nhiều đến quá trình cắt tiêu bản, nó chỉ làm cho động tác rót phủ gel lên tiêu bản lâu hơn chút ít do chảy chậm
- Độ chiết quang:
+ Độ chiết quang của gel nội và gel ngoại gần như tương đương nhau
GCLI: 1,3625; GCLII :1,3654 và gel ngoại là :1,3544 cho thấy giữa gel nội và gel ngoại có sự đồng nhất cao, có độ chiết quang tương nhau
- Nhiệt độ sôi: Bảng 1 cho thấy nhiệt độ sôi của gel nội và gel ngoại hoàn toàn
giống nhau: cùng sôi ở 950C
- Nhiệt độ bắt đầu đóng băng:
+ Gel GCL có nhiệt độ bắt đầu đóng băng - 60C trong khi gel ngoại bắt đầu đóng băng thấp hơn, ở - 200C Đây là sự khác biệt quan trọng nhất giữa gel nội và gel ngoại,
do điểm bắt đầu đóng băng cao hơn nên chỉ cần máy cắt lạnh đạt nhiệt độ từ -120 C đến
- 150C là có thể cắt tiêu bản được, do đó, có thể cắt được tiêu bản trên các máy cắt lạnh
đã cũ
Trang 5Bảng 2 Thành phần hóa học của gel nội và gel ngoại
Định tính
- Phản ứng đặc trưng của Colagen Âm tính Âm tính Âm tính
- Phản ứng đặc trưng của Gelatin Âm tính Âm tính Âm tính
- Phản ứng đặc trưng của Albumin Âm tính Âm tính Âm tính
- Phản ứng đặc trưng của polyethylen glycol Dương tính Âm tính Âm tính
- Phản ứng đặc trưng của poly vinyl alcohol Dương tính Dương tính Dương tính Định lượng
Theo bảng 2, ghi nhận một số kết quả phân tích sau:
- Về Colagen, albumin, gelatin
+ Gel nội không chứa các chất như colagen, gelatin và albumin như dự kiến, điều này có thể giải thích về nguồn nguyên liệu để sản xuất gel
Nếu nguyên liệu sản xuất là các chất hữu cơ như lòng trắng trứng, keo da trâu thì thành phần của gel chứa colagen, albumin, gelatin là hoàn toàn có thể có trong kết quả phân tích
Khi nguồn nguyên liệu chính để sản xuất là chất tổng hợp polyme cao phân tử nên việc vắng mặt các chất hữu cơ kể trên là phù hợp [7,11,12,14]
- Polyvinyl alcohol có tỷ lệ 9,8% trong gel ngoại, 15,78% trong GCLI và
15,93 % , có thể khẳng định đây là thành phần chính tạo ra sản phẩm gel cắt lạnh ngoại cũng như nội Trong gel nội nó là thành phần chủ yếu chế tạo ra gel GCLI và GCLII (chiếm 15,78 và 15, 93%), trong khi gel ngoại chứa 9,8% Sở dĩ lượng Polyvinyl alcohol ở gel ngoại thấp chỉ bằng 2/3 trong gel nội vì nó chứa thêm thành phần thứ hai
là polyethylen glycol 4,65%, tổng cộng 2 thành phần này trong gel ngoại là 14,45 %, tỷ
lệ này xấp xỉ với tỷ lệ 15,78% và 15,93% Polyvinyl alcohol trong gel GCL [1,10,16]
- Polyethylen glycol:
+ Thành phần này không có trong gel nội GCL và có tỷ lệ 4,65% trong gel ngoại, đây là điểm khác biệt hóa học duy nhất giữa gel nội và gel ngoại chính là thành phần polyethylen glycol
Trang 6Theo dược điển, tác dụng của polyethylen glycol hút nước do đó làm tăng độ dẻo của gel, đặc biệt trong điều kiện lạnh sâu nó có tác dụng chống làm giòn bệnh phẩm, tuy vậy, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng polyethylen glycol làm gel khó đông hơn gel chỉ có Polyvinyl alcohol, chính vì vậy, chúng tôi sẽ dùng polyethylen glycol để điều chỉnh gel theo nhiệt độ của máy khi cần [10,11,12,15,]
+ Nếu máy lạnh có độ lạnh sâu tốt thì nên sản xuất gel với công thức có 2 thành phần như gel ngoại
+ Nếu máy lạnh bị giảm độ lạnh sâu sau một thời gian sử dụng thì nên dùng gel chỉ có một thành phần là Polyvinyl alcohol, lúc này gel GCL có dễ đông kết ở nhiệt độ cao hơn hẳn gel ngoại nhập Đây có thể nói là phát hiện mới trong nghiên cứu của chúng tôi Như vậy, chúng ta có thể chủ động chế tạo ra những loại gel phù hợp với độ lạnh của từng loại máy cắt
3.3 Kết quả nuôi cấy vi sinh vật gel ngoại và gel GCL trong kỳ hạn sử dụng
Bảng 3 Kết quả nuôi cấy vi sinh vật gel ngoại và gel GCL
Thời gian cấy Ngay sau khi sản
xuất
Giữa kỳ hạn sử
GCLII Âm tính Serratia plynuthica Providecia strartic
- Đối với gel ngoại: Do không có loại gel mới sản xuất hoặc giữa thời hạn sử dụng, chúng tôi nuôi cấy vi khuẩn ở gel ngoại có date cuối hạn sử dụng, kết quả có vi khuẩn Serratia plynuthica mọc
- Đối với gel GCLII: nuôi cấy vi khuẩn không mọc ở thời điểm ngay sau khi sản xuất nhưng vi khuẩn có mọc ở thời điểm giữa và cuối thời hạn, điều này có thể giải thích: sự nhiễm khuẩn có thể do cách chúng ta lấy mẫu gel nuôi cấy chưa đạt chuẩn hoặc do không khí khu vực sản xuất gel bị nhiễm khuẩn nên gel sản xuất sau vẫn có thể
bị nhiễm khuẩn nhiều hơn mẫu gel sản xuất trước đó 3 tháng
- Đối với gel GCLI: nuôi cấy vi khuẩn không mọc ở cả 3 thời điểm điều này chứng tỏ: nếu thực hiện đóng chai trong môi trường (không khí, dụng cụ đong, chai lọ đựng gel) vô khuẩn thì sản phẩm có thể để được lâu mà không bị nhiễm khuẩn
Trang 73.4 Kết quả thử nghiệm gel GCL đối chứng với gel ngoại
3.4.1 Kết quả thử nghiệm gel GCL đối chứng với gel ngoại khi cắt tiêu bản ở các thang nhiệt độ khác nhau của máy cắt lạnh
Bảng 4 Liên quan giữa độ lạnh của buồng máy cắt ảnh hưởng tới thao tác
cắt bệnh phẩm giữa các loại Gel
Nhiệt độ máy cắt -25 o C đến -30 o C -15 o C đến -24 o C Trên -15 o C
Gel Ngoại Cắt tiêu bản tốt
Khó cắt tiêu bản
do gel đông không chắc
Không cắt được tiêu bản
GCLI Cắt tiêu bản khá tốt,
bệnh phẩm hơi giòn Cắt tiêu bản tốt Cắt tiêu bản khá tốt
GCLII Cắt tiêu bản khá tốt,
bệnh phẩm hơi giòn Cắt tiêu bản tốt Cắt tiêu bản được
- Ở nhiệt độ -25oC đến - 30oC: Gel ngoại cắt tiêu bản rất tốt, trong khi gel GCL cắt được nhưng ở mức độ khá tốt mà thôi, lúc này với gel GCL, bệnh phẩm có vẻ hơi giòn, vai trò của polyethylen glycol chính là hút nước, giữ độ ẩm cho mô, do vậy, chính nhờ polyethylen glycol mà gel ngoại không bị giòn khi máy cắt đạt nhiệt độ lạnh sâu
- Ở nhiệt độ -15oC đến - 24oC: gel ngoại đã bắt đầu khó cắt vì gel đông không chắc nhưng Gel nội GCL lại cắt tiêu bản rất tốt Có thể nói với nhiệt độ từ -15oC đến -
24oC là khoảng nhiệt độ lý tưởng dể các gel nội GCL nội cắt tiêu bản tốt nhất
- Ở nhiệt trên độ -15oC , gel ngoại không đông kết nên hoàn toàn không cắt được tiêu bản, trong khi GCLI còn cắt khá tốt và GCLII vẫn còn cắt được tiêu bản
Như vậy, chúng ta có thể chủ động sản xuất ra các loại gel phù hợp với độ lạnh đạt được của máy
Bảng 5 So sánh về thời gian đông cứng gel và mức độ hòa tan gel trong môi trường nhuộm,
độ dày của lát cắt tiêu bản được thực hiện
Thời gian đông cứng gel ở -25 o C
Mức độ hòa tan Gel trong môi trường nhuộm
Độ dày lát cắt
Từ bảng 5 cho thấy:
- Thời gian đông cứng của gel ngoại lâu hơn gel nội từ 1-2 phút
Trang 8- Độ dày của các lát cắt tiêu bản tương đương giữa gel nội và gel ngoại
- Gel nội và gel ngoại đều hòa tan tốt trong môi trường nhuộm
Như vậy, mặc dù thời gian đông cứng của gel nội và gel ngoại có khác nhau chút
ít nhưng 2 tiêu chuẩn cơ bản nhất là độ dày của tiêu bản và sự hòa tan gel trong môi trường nhuộm là như nhau
+ Độ dày hợp lý của tiêu bản từ 2-5 micromet, khi đó ta nhìn rõ cấu trúc mô, tế bào, nhân, màng nhân, hạt nhân, bào tương… Nếu cắt dày quá, các hàng tế bào sẽ chồng lên nhau, khó đánh giá được các thành phần trên nên khó hoặc không thể đọc được tiêu bản
+ Sự hòa tan gel hay chính xác hơn, gel được tẩy sạch trong khi nhuộm tiêu bản giúp ta có một tiêu bản nhuộm đạt chất lượng tốt vì phần bắt màu thuốc nhuộm duy nhất chỉ có mô bệnh, nếu gel không tan hết, không được tẩy sạch thì sẽ gây ra hiện tượng bắt màu cùng với mô, rất khó khăn trong việc nhận định kết quả
Bảng 6 Kết quả đánh giá về cắt tiêu bản với 300 ca bệnh nghiên cứu sử dụng gel GCLI và
GCLII so sánh với gel ngoại
Điểm (thang điểm
Chứng (Gel ngoại)
(n)
Gel GCLI: Χ = 8,97 ± 0,47 điểm, Gel GCLII : Χ = 8,90 ± 0,52 điểm
Gel Ngoại: Χ = 8,95 ± 0,46 điểm
Như vậy sự khác biệt trị trung bình của Gel GCLI, GCLII và Gel ngoại không
có ý nghĩa thống kê, p> 0,05 hay nói cách khác là không có sự khác biệt giữa Gel GCLII, GCLII và Gel ngoại khi cắt tiêu bản
Trang 93.4.2 Kết quả đánh giá khi thử nghiệm gel GCL đối chứng với gel ngoại khi đọc tiêu bản (chẩn đoán bệnh)
Bảng 6 Đánh giá kết quả đọc tiêu bản với 300 ca bệnh nghiên cứu
Điểm (thang điểm 10) Gel GCLI (n) Gel GCLII (n) Chứng (gel Ngoại) (n)
- So sánh giữa gel GCLI và gel ngoại:
+ Gel GCLI đạt Χ = 8,86 ± 0,53 điểm Gel ngoại nhập đạt Χ = 8,88 ± 0,53 điểm
Sự khác biệt trị trung bình của Gel GCLI và Gel ngoại không có ý nghĩa thống
kê, p>0,05
- So sánh giữa gel GCLII và gel ngoại:
+ Gel ngoại nhập đạt Χ = 8,88 ± 0,53 điểm, Gel GCLII đạt Χ = 8,94 ± 0,50 điểm
Sự khác biệt trị trung bình của Gel GCLII và Gel ngoại không có ý nghĩa thống
kê, p> 0,05
Trong suốt quá trình 5 năm nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm dùng gel tự chế GCL với 300 ca bệnh tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế, Bệnh viện Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng, chúng tôi rút ra các kết luận sau:
4 Kết luận và đề nghị
4.1 Kết luận
- Đã xây dựng được quy trình gồm 4 bước sản xuất gel dùng cho máy cắt lạnh từ nguyên liệu thông dụng sẵn có trong nước là polyvinyl alcohol với trang thiết bị đơn giản, chất lượng gel làm ra luôn ổn định, bảo quản dễ dàng, thời hạn sử dụng lâu, giá thành chỉ bằng 20% gel ngoại
Trang 10- Đã xác định được các chỉ tiêu vật lý và thành phần hóa học chủ yếu để sản xuất gel dùng cho máy cắt lạnh mô là polyvinyl alcohol và polyethylen glycol Trong đó, công thức của gel GCLI là: polyvinyl alcohol: 15,78 % và nước cất: 82,52% có nhiều
ưu điểm hơn so với công thức GCLII
- Những tiêu bản sinh thiết lạnh cắt bằng gel GCL dễ dàng tẩy sạch khi nhuộm tiêu bản, không làm biến đổi hình thái, kích thước tế bào, cấu trúc mô được giữ nguyên, chất lượng bắt màu của nhân và bào tương ổn định trên nhiều loại mô khác nhau Không
có sự khác biệt giữa gel GCLI, GCLII với gel ngoại khi cắt và đọc tiêu bản
- Tất cả các trường hợp thử nghiệm bằng gel GCL đều đọc tốt, đánh giá qua thang điểm cho thấy gel GCL tương đương gel ngoại nhập cả trên phương diện cắt và đọc tiêu bản
4.2 Đề nghị
4.2.1 Đối với các cơ sở đào tạo y dược và các trường đại học
- Có thể dùng sinh thiết lạnh tức thì với gel GCL trong nghiên cứu các mô bệnh lành tính cũng như ung thư để nghiên cứu trong các luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Y khoa,
Hệ sau đại học như CKI, CK II, thạc sỹ, Tiến sỹ
- Đối với các trường có sử dụng kỹ thuật cắt mô làm sinh thiết để giảng dạy và nghiên cứu, như Đại học Nông nghiệp, Khoa Sinh Đại học tổng hợp, Sư phạm, có thể dùng gel GCL vì chất lượng tiêu bản, chất lượng hình ảnh rất tốt cho giảng dạy và nghiên cứu
4.2.2 Đối với các cơ sở y tế khám chữa bệnh
Các cơ sở y tế tuyến tỉnh, thành phố đều có thể triển khai kỹ thuật sinh thiết lạnh tức thì để chẩn đoán nhanh các bệnh lý khối u và ung thư với các máy cắt lạnh đã cũ vẫn có thể sử dụng với gel nội (GCL)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 David K, Tuson AZ Polyvinyl Alcohol Slime Science USA (2008), 18-32
2 Phạm Phan Địch, Trịnh Bình Mô học, Sợi collagen, Mô liên kết chính thức NXBYH,
(2004), 116-124
3 Ibanez M.L, Chang J.P, Russel W.O Advances in the Diagnosis of Neoplasia by Cold Chamber Cryostat Frozen Tissue Sections Recent advances in Clinical Pathology
Dyke S.C, 2 nd Boston, USA (1968), 87-103
4 Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam Minh dao- A dao NXB Y học
