Tìm hiểu về độc tố ochratoxin

Tìm hiểu về độc tố ochratoxin

Viện công nghệ sinh học và thực phẩm

GVHD :Trần Thị Mai Anh

Thành phố Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG

Phần phân công Lời mở đầu

Lời cảm ơn Nguồn gốc sinh ra độc tố Đặc điểm của độc tố ochratoxin

Độc tính Các phương pháp phân tích Ochratoxin

Quy định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm Biện pháp hạn chế độc tố Ochratoxin trong thực phẩm

LỜI MỞ ĐẦU

Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu,

đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm.

Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩ thuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó đồng thời chế biến nông sản thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao là một trong những phần cần thiết

Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm mốc chiếm một

Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt như : protein, carbohydate, lipid và các vitamin, mà phần lớn các loại độc tố do nấm mốc sản sinh ra đều gây ra những tác hại rất lớn cho con người và động vật tiêu thụ Những độc tố do nấm mốc sinh ra phần lớn gây ra ung thư đối với động vật và con người Chính vì thế, việc tìm hiểu và đánh giá đúng tác hại của từng loại độc tố đóng vai trò quan trọng trong việc phòng chóng độc tố nấm mốc Với tầm quan trọng và ý nghĩa thực tiễn nêu trên, nhóm chúng em thực hiện đề tài “Tìm hiểu về Ochratoxin”

LỜI CẢM ƠN

Nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Mai Anh đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất để nhóm chúng em thực hiện đề tài tiểu luận này.

Chúng em cũng xin cảm ơn các trang wed như trong tài liệu tham khảo đã cung cấp tài liệu cho chúng em

Tuy chúng em đã cố gắng hết sức nhưng trong bài tiểu luận chắc chắn vẫn còn nhiều thiếu sót Mong sự góp ý cô nhiều hơn.

NỘI DUNG

I. Nguồn gốc sinh ra độc tố Ochratoxin:

1 Định nghĩa:

Ochratoxin là độc tố gây tác hại vào các cơ quan quan trọng của cơ thể: thần kinh, gan

và thận, hệ miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng đối với người và động vật nuôi Là độc tố có tác hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người

Ochratoxin được tìm thấy nhiều ở ngũ cốc, rau củ, cà phê, trái cây khô, sản phẩm sữa, rượu, bia… và cả trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do đã bị lây nhiễm trước

2 Nguồn gốc sinh độc tố:

Ochratoxins là một nhóm độc tố nấm mốc sản xuất bởi một số loài Aspergillus

ochraceus (chủ yếu là A ochraceus , mà còn bởi 33% chủng A niger công nghiệp) và một

số loài Penicillium verrucosum (đặc biệt là P verrucosum và P carbonarius ) và là loại độc tố

có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật

Ochratoxin được sinh ra từ nấm Aspergillus ochraceus trên bánh mì mốc Các loại

thực vật dễ nhiễm là gạo, lúa mạch, lúa mì, bắp, cao lương, ớt, hạt tiêu, đậu nành, cafe

Một số ochratoxins là những chất độc mạnh và sự hiện diện của nó trong thực phẩm là không mong muốn.Các ochratoxins là pentaketides dihydro-isocoumarin liên kết ß-phenylalanine Ochratoxin quan trọng nhất và độc hại nhất được tìm thấy tự nhiên trong thực phẩm là ochratoxin A Ochratoxin khác được tìm thấy trong thực phẩm là ochratoxin B, rất hiếm gặp và ít độc hại hơn rất nhiều Ochratoxins khác có cấu trúc tương tự như ochratoxin C

Trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, Ochratoxin A được sản xuất chủ yếu bởi

các loài Aspergillus Tuy nhiên, ở vùng khí hậu ôn đới (Canada, Bắc Âu và các bộ phận của Nam Mỹ), nguồn sản xuất chính là Penicillium verrucosum

P verrucosum :

Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh, bào tử đính có màu xanh khi chín nên còn được gọi là mốc xanh

Khuẩn lạc P verrucosum trên môi trường CYA ở 25oC

Sự hiện diện Ochratoxin trong thực phẩm:

Trong cuộc điều tra, Ochratoxin A đã được tìm thấy trong một phạm vi rất rộng các mặt hàng thực phẩm tươi sống và chế biến trên toàn thế giới Nó lần đầu tiên trong ngũ cốc, nhưng từ

đó đã được tìm thấy trong các sản phẩm khác, bao gồm cà phê, trái cây khô, rượu, bia, ca cao, các loại hạt, đậu, đậu Hà Lan, bánh mì và gạo Nó cũng đã được phát hiện trong thịt, đặc biệt

là thịt lợn và gia cầm, sau khi chuyển từ thức ăn bị ô nhiễm

Ochratoxin A lần đầu tiên tìm thấy ở nấm mốc Aspergillus ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa mì bị nhiễm Aspergillus ochraceus.Ở Anh, chúng được tìm thấy trong đậu nành, bắp, bột bắp, bột ca cao Ở Đức Ochratoxin A được phát hiện thường xuyên trong thịt Tuy nhiên ở câc nước nhiệt đới , Ochratoxin A lại có nhiều trong cà phê

A ochraceus

Khuẩn ty có vách ngăn, các bào tử đính xòe ra như những bông cúc và mang màu sắc đặc trưng (màu vàng nâu)

Khuẩn lạc A ochraceus trong môi trường MA 25oC

M.nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ nhiễm 30% ở hàm lượng Ochratoxin A từ 0,1-17,4µg/kg trên 47 mẫu cà phê nhân được nhập vào Nhật Bản từ Châu Phi và các nước Asian Một số nhà nghiên cứu còn phân tính được Ochratoxin A trên cà phê rang (H.Tsubouchi 1988) Một số công trình liên quan cũng cho biết thêm rằng loại bỏ được 78% Ochratoxin A nhờ vào quá trình rang hạt cà phê ở 2000C trong 20 phút

Ngoài ra, nhiều loài có thể tạo ochratoxin như: A alliaceus, A ostianus, A carbonarius, A melleus, Penicillium nordicum…

Sự sản sinh Ochratoxin phụ thuộc vào chủng nấm mốc, cơ chất, nhiệt độ và hoạt tính của nước trong hạt Độ ẩm thích hợp để sinh sản Ochratoxin A khoảng 10%

II Đặc điểm của độc tố ochratoxin

1 Cấu trúc hóa học của ochratoxin :

Ochratoxin là một độc tố rất phổ biến bên cạnh các mycotoxin khác như aflatoxin Có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê, và cả trong các sản phẩm có nhuồn gôc động vật do đã bị lây nhiễm trước do Aspergillus ochraceus, carbonarius Aspergillus và Penicillium verrucosum Có các loại như ochratoxin A, B, C vầ các dẫn xuất của chúng Về cấu tạo thì OTA là hợp chất của izocoumarin lên kết với một nhóm L-phenylalanin Các nhóm có độc tính khác nhau là do lien quan tới các nhóm hydroxyl phenol được tách ra khó hay dễ

Ochratoxin được tạo ra từ các loài nấm như Aspergillus và Pencillium(Aspergillus ochraceus, carbonarius Aspergillus và Penicillium verrucosum)- là những loại nấm có khả năng gây nhiễm độc thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được phổ biến rộng rãi Một số loài nấm Pencillium có thể tạo ra ochratoxin ở 5oC

2 Tính chất chung của ochratoxin:

Là một hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicarbonate

Ochratoxin là hợp chất của isocoumarin liên kết với nhóm L-phenylalanin.dộc tố này xuất hiện trong quá trình lưu kho khi nấm mốc nhiễm vào ngũ cốc và đỗ, đặc biệt ở tiết lạnh và ôn đới Độc tố được sản sinh mạnh nhất và nhiều nhất ở 20 tới 25oC

Có ba loại ochratoxin: A,B,C trong đó loại ochratoxin A(OTA) có độc tính mạnh nhất

Hiện nay, người ta biết OTA, OTB và những dẫn xuất ester của nó : ester ethylic và ester methylic Các ochratoxin B, C được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm hoặc phát hiện trong nước tiểu súc vậy ăn thức ăn nhiễm OTA

2.1 Ochratoxin A

CTPT: C20H18ClNO6

Ochratoxin A độc là do sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin, khi phân hủy nó tạo chất dihydro-izocumarin, đây là chất gây độc

CTCT:

Nấm thuộc giống Aspergillus ochraceus

(R)-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H-2-benzopyran-7-yl) carbonyl]-L-phenylalanin

Trọng lượng phân tử OTA: 403,8

Điểm nóng chảy: 169°C

Phổ hấp phụ UV: 2 đỉnh: 216 – 333 nm

Là tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như: chloroform, methanol, ethanol, ít tan trong nước và tan trong đệm carbornat loãng

Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường acid, kiềm hoặc chất tẩy (như sodium hypochlorite)

2.2 Ochratoxin B:

CTPT: C20H19NO6

Ochratoxin B là dẫn xuất dechloro ochratoxin A

(R)-N-[(3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H-2-benzopyran-7-yl)carbonyl]-L-phenylalanine

2.3 Ochratoxin C:

CTPT: C22H22ClNO6

Ochratoxin C là ethyl ester ochratoxin A

CTCT :

(R)-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H-2-benzopyran-7-yl)carbonyl]-L-phenylalanine ethyl ester

Trong các ochratoxin trên, ochratoxin A được quan tâm đến nhiều nhất do đặc tính gây ung thư và viêm thận cũng như sự xâm nhiễm phổ biến của nó trên ngũ cốc, ochratoxin A gây độc nhiều hơn so với ochratoxin B và ochratoxin C, do đó ochratoxin A được xem như là đối tượng chính trong việc xác định ochratoxin

3 Tính chất hóa lý của ochatoxin:

Ochratoxin là hợp chất tinh thể không màu, ít tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ như benzen, chloroform, acetonitril,…

Ochratoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ethyl eter, eter dầu hỏa,

Hầu hết các loại ochratoxin đều phát huỳnh quang màu xanh ở bước sóng λ=460nm dưới đèn

tử ngoại UV

Ochratoxin có thể bảo quản trong etanol được vài năm ở nhiệt độ tháp mà không bị phân hủy

Bảng1 Các tính chất hóa lý của ochratoxin

Ochratoxin Khối lượng

phân tử

Λmax hấp thu(nm)

Điểm nóng chảy(oC)

ε (1.mol-1.cm

-1)

Ánh sáng huỳnh quang

III Độc tính

1 Đối với vật nuôi:

- Là một hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicarbonat

- Ochratoxin độc là do sự ghép một nhân phenylalamin và một nhân izocumarin, khi phân hủy nó tạo ra chất dihydro-izocumarin là chất gây độc Tác dụng của độc tố này

là gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây tổn thất trong chăn nuôi gia súc Cho đến nay độc tố ochratoxin A tác động lên thận gây ra các đợt bộc phát bệnh thận

ở động vật và là tác nhân gây tổn thất nghiêm trọng về mặt kinh tế

đẻ ít trứng, ở nồng độ cao gây rối loạn gan, thận và đôi khi làm chết gà Với nồng độ lớn hơn 1ppm có thể làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ, nồng độ lớn hơn 5ppm có thể gây nên những tổn thương ở gan và ruột

tiểu quản thận

bò…)

- Liều lượng gây độc Ochratoxin đối với vịt 1 ngày tuổi là 25 μg/con theo

đường miệng, đối với chuột đực là 22 mg/kg và chuột cái là 20 mg/kg, ở gà con là 3.6 mg/kg Vì vậy quốc tế đã có quy định giới hạn nghiêm ngặt về Ochratoxin từ 1 -50µg/kg (quy định của Việt Nam là chỉ 35µg/kg)

2 Đối với con người:

Ochratoxin A chủ yếu gây độc mãn tính hơn là cấp tính, nó biểu hiện rõ hơn cả vào thời tiết khí khí hậu ẩm ướt và lạnh, làm hại hệ thần kinh và làm giảm sức đề kháng Ochratoxin gây tính ảnh hưởng lâu dài ở người, nó được tính lũy trong cơ thể và gây ra tổn thương gan, thận Nếu nhiễm Ochratocxin trong thời kì mang thai thì thai sẽ bị dị tật, sinh quái thai hoặc chết Ochratoxin A đặc biệt còn được tìm thấy trong máu người khỏe mạnh với hàm lượng từ 0.1-14.1 μg/l và khi nhiễm Ochratoxin ở 22mg/kg thể trọng sẽ gây giảm cân, biếng ăn cho người, cũng là tác nhân gây ung thư ở người

IV Các phương pháp phân tích Ochratoxin.

1 Phương pháp hoá lý.

1.1 Quy trình chung:

Tất cả phương pháp hóa lý đều phải qua các bước sau:

● Lấy mẫu

●Chiết Ochratoxin

● Tinh sạch dịch chiết

● Cô đặc

● Phát hiện và định lượng Ochratoxin

-Lấy mẫu: Do lượng độc tố phân bố không đồng đều nên cần lấy một số mẫu

có tính phân bố đủ để đại diện cho sản phẩm cần kiểm tra Mẫu phải được lấy từ nhiều

vị trí khác nhau với những lượng khác nhau Các mẫu này được gộp lại thành mẫu duy nhất và nghiền đồng đều Và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích chratoxin, thường từ 20 – 100 g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng Ochratoxin cao hay thấp trong mẫu

-Chiết Ochratoxin ,loại chất béo :Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên,

sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết Ochratoxin

-Chiết Ochratoxin : Dựa vào đặc tính tan của Ochratoxin trong các dung môi hữu cơ nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như: dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform hay methanol Ochratoxin được chiết bằng cách lắc với dung môi ở nhiệt độ phòng, nước được thêm vào để làm ẩm cơ chất giúp dung môi dễ dàng thấm sâu vào bên trong mẫu

-Tinh sạch dịch chiết , loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng Ochratoxin trong dịch chiết mẫu Có ba cách tinh sạch phổ biến:

+ Loại các tạp chất không mong muốn bằng các tác nhân gây tủa: thường dùng

để cho mẫu có nguồn gốc thực vật Các chất gây tủa thường dùng là các muối kim loại

+ Loại bằng cách phân chia trên hai pha lỏng (partition): Chiết bằng cách chuyển Ochratoxin từ dung môi chiết ban đầu (ví dụ như methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform)

+ Loại tạp bằng cột sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography column): Kỹ thuật này có ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất hấp phụ thường là silicagel, thích hợp cho phân tích bằng HPLC với hệ dung môi lần lượt là n–hexan, ethyl ether, hỗn hợp chloroform: methanol.:

-Cô đặc mẫu: Nồng độ Ochratoxin trong dịch chiết thường thấp nên cần cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ

Phát hiện và xác định hàm lượng Các phương pháp sắc ký thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc ký Pha tĩnh có tính liên kết với ochratoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lý hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng

1.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TCL).

Phương pháp này dựa trên sự hấp phụ khác nhau của các Ochratoxin trên lớp silicagel (pha tĩnh) và khả năng hòa tan của chúng trong hệ dung môi (pha động) Các Ochratoxin lần lượt được tách trong quá trình hệ dung môi di chuyển theo lực mao dẫn trên bản silicagel Silicagel được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa) có kích thước thường là 20 cm x 20 cm, dịch chiết sau khi cô đặc sẽ được hòa vào hỗn

hòa tan lên bản silicagel, tiến hành song song với chuẩn đã biết trước nồng độ Sau khi sắc ký, sấy khô bản, soi dưới đèn huỳnh quang ở bước sóng 333 nm Sự hiện diện của Ochratoxin trong mẫu được xác định bằng cách so sánh dựa vào vị trí so với vệt huỳnh quang chuẩn Sự định tính bằng mắt cho kết quả tương đối Dùng máy đo mật

độ phát huỳnh quang (fluorodensimeter) thay mắt thường để giảm sai số

1.3 Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography –

HPLC).

Kỹ thuật HPLC nhanh, nhậy, cho kết quả phân tích chính xác hơn TCL Gồm 2 giai đoạn:

● Giai đoạn tách các chất phân tích: gồm pha tĩnh và pha động Pha tĩnh (stationary phase) Thường dùng cột pha đảo, các chất dùng nhồi trong cột sắc ký có tính phân cực thấp (thường dùng là hợp chất silicagel có gắn các chuỗi alkyl từ C8 đến

C18)

Pha động (mobile phase) là hỗn hợp các dung môi có độ phân cực khác nhau, qua cột với vận tốc dòng 1 – 10 ml/phút nhờ hệ thống bơm cao áp Thường sử dụng hệ dung môi gồm nước, alcol (methanol), acetonitril

● Giai đoạn phân tích các chất sau khi ra khỏi cột: Dựa vào tính chất của các chất cần phân tích, một thiết bị thích hợp gọi là đầu dò (detector) sẽ được nối trực tiếp